一种基于小分子抑制剂的荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种基于小分子抑制剂的荧光探针及其制备方法和应用 (Fluorescent probe based on small molecule inhibitor and preparation method and application thereof ) 是由 王宏达 吴强 陈俊玲 蔡明军 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于小分子抑制剂的荧光探针及其制备方法和应用,属于荧光成像的小分子标记探针领域。本发明选择具有特定靶点的小分子抑制剂作为研究对象,通过合成手段对小分子抑制剂的合适位点进行衍生修饰,借助柔性PEG链或其它链接分子将其与荧光染料分子相连来构建一种新型的小分子荧光探针,具有体积小、标记特异性高、制备简便等优点,可广泛用于细胞蛋白的分布、定位和组装的研究。本发明的基于小分子抑制剂的荧光探针的制备方法简便、制备时间短、质量易控制,可以广泛应用与对应蛋白的分布、定位与组装研究。本发明的基于小分子抑制剂的荧光探针特别适用于超分辨成像。(The invention relates to a fluorescent probe based on a small molecular inhibitor, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of small molecular labeled probes for fluorescence imaging. The invention selects the small molecule inhibitor with specific target as a research object, performs derivative modification on the proper site of the small molecule inhibitor by a synthesis means, and connects the small molecule inhibitor with the fluorescent dye molecule by virtue of the flexible PEG chain or other linking molecules to construct a novel small molecule fluorescent probe, has the advantages of small volume, high labeling specificity, simple and convenient preparation and the like, and can be widely used for research on distribution, positioning and assembly of cell protein. The preparation method of the fluorescent probe based on the small molecular inhibitor is simple and convenient, short in preparation time and easy in quality control, and can be widely applied to research on distribution, positioning and assembly of corresponding proteins. The fluorescent probe based on the small-molecule inhibitor is particularly suitable for super-resolution imaging.)
技术领域
本发明属于荧光成像的小分子标记探针领域，具体涉及一种基于小分子抑制剂的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
以高时空分辨率来表征细胞结构和生物分子是在分子层面研究细胞生物学的前提。到目前为止，具有良好灵敏度和分辨率的荧光显微镜成为了首选的研究方法，但是受限于常规荧光显微镜200纳米的衍射极限，并不足以分辨大多数的生物结构。近年来，随着超分辨荧光成像技术的快速发展，如基于单分子定位的超分辨显微镜(SMLM)、结构光显微镜(SIM)、受激发射损耗显微镜(STED)等，已经大大突破了传统荧光成像技术的分辨率极限限制，逐渐成为了生命化学领域的重要研究手段。
对于高质量的荧光成像，除了先进的成像技术，往往还需要精确的荧光标记来实现，因此，高效、特异性高的荧光探针的选择显得尤为重要。目前，光可激活或光可转换的荧光染料或荧光蛋白是超分辨成像技术最为常用的荧光探针。荧光染料具有尺寸小、亮度高、易于修饰等特点，但是荧光染料自身并不具有靶向性，无法对目标物进行特异性标记，通常需要借助一抗或二抗分子来获得高的标记特异性。2012年，Heilemann课题组借助抗体标记gp210蛋白，成功实现了细胞核孔复合物周围gp210蛋白的超分辨成像，并首次观察到gp210蛋白的八倍对称性(J.Cell.Sci,2012,125,570-575)。我们课题组同样利用多种抗体探针实现了对细胞膜表面Band3、EGFR、GLUT1等蛋白的dSTORM成像，并进一步研究了这些蛋白在细胞膜表面的组装规律和分布特点(Nanoscale,2013,5,11582；Sci.Rep-UK,2015,5,9045；Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2018,115,7033.)。具有高特异性的荧光蛋白同样在超分辨成像领域有着广泛的运用。2008年，通过结合PALM和单颗粒示踪技术，Schwartz小组使用荧光蛋白标记细胞膜上GAG和VSVG蛋白，获得了更高数量级的单细胞运动轨迹(NatureMethods,2008,5,155-157)。通过特定蛋白标签(如Halo-tag,SNAP-tag等)的引入，借助蛋白残基与专一性荧光染料的反应实现对特定蛋白的荧光标记(Nat.Chem.2013,5,132–139；ACS Chem.Biol.2008,3,373–382)。纳米抗体具有更小的体积，更有利于对目标蛋白进行精确标记。2012年，Ewers课题组开发了一种通用的、高效的纳米抗体标记方法，借助纳米抗体与荧光蛋白的结合来实现对目标蛋白更精确的荧光标记(Nature Methods,2012,9,582-584)。近些年兴起的核酸适配体，因其高的标记特异性，相对较小的体积也倍受关注。2012年，Rizzoli小组首次报道了核酸适配体标记技术在超分辨领域的应用，成功实现转铁蛋白(TRF)，生长因子受体(EGFR)的超分辨成像(Nature Methods,2012,9,938-939)。
虽然抗体、荧光蛋白、纳米抗体以及核酸适配体标记具有各自的优点，但是这些标记方法都有着自身的标记缺点。抗体自身体积较大，在标记过程中具有多价交联、标记不全、连接误差大等不足，使得抗体标记往往会造成标记假象，无法体现蛋白的真实表达。荧光蛋白和蛋白标签与抗体相比，具有更高的标记特异性，可是荧光蛋白和蛋白标签需借助于基因编辑技术来实现，因此在其表达过程中往往会破坏目标蛋白的真实表达和功能。具有更小尺寸的纳米抗体，虽然在体积上具有优势，但是与荧光蛋白一样，需借助基因编辑技术来控制表达，造成目标蛋白的不真实表达，影响了蛋白的真实功能，同时纳米抗体的筛选严格且复杂，进一步限制了纳米抗体在超分辨成像领域的广泛应用。近些年兴起的核酸适配体标记技术，在筛选更易操作，可由于不能依赖于成熟的动物免疫系统，其高特异性很难保证，目前也仅有有限的目标蛋白可以利用核酸适配体进行标记。
体积小、特异性高、不干扰目标蛋白表达和功能是实现精确荧光标记的前提，因此，找到一种尺寸更小、适用广泛、标记特异性高的标记方法，是提高超分辨成像精确性的关键。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，基于小分子抑制剂对特定靶蛋白的特异性识别，提供一种基于小分子抑制剂的荧光探针及其制备方法和应用，本发明的荧光探针具有体积小、标记特异性高、制备简便等优点，可广泛用于细胞蛋白的分布、定位和组装的研究。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种基于小分子抑制剂的荧光探针，其结构如式1所示：
式1中：
代表小分子抑制剂，包括但不仅限于吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、他立喹达、GDC-0941、A-674563或AZD-805等，优选为吉非替尼或他立喹达；
代表长度可调整的链接分子，包括但不仅限于柔性PEG链、饱和碳链、或不饱和碳链等，优选为柔性PEG链，PEG链的链长优选为3个乙二醇分子链长，长度可调整；
代表荧光染料分子，包括但不仅限于Alexa532、Alexa647、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Atto532、Atto488或TAMRA等，优选为Alexa532或TAMRA。
在上述技术方案中，进一步优选的是：所述的基于小分子抑制剂的荧光探针的结构如式2或者式3所示：
本发明还提供一种基于小分子抑制剂的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：对小分子抑制剂进行衍生修饰，得到小分子抑制剂的衍生物；
步骤二：将步骤一中得到的小分子抑制剂的衍生物与链接分子进行连接得到产物二；
步骤三：将步骤二中得到的产物二与荧光染料分子反应，即可得到基于小分子抑制剂的荧光探针。
在上述技术方案中，优选的是，所述的步骤一中反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈或四氢呋喃。
在上述技术方案中，优选的是，所述步骤一中的反应温度为20～120℃，反应时间为1至16小时。
在上述技术方案中，优选的是，所述步骤二中的小分子抑制剂的衍生物与链接分子的摩尔比为1:1.1～1:3。
在上述技术方案中，优选的是，所述步骤二中的反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、或四氢呋喃，反应温度为50～120℃，反应时间为10～24小时。
在上述技术方案中，优选的是，所述步骤三中的反应温度为室温，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、PBS或水，反应时间为2～24小时。
在上述技术方案中，优选的是，所述步骤三中的产物二与荧光染料分子的摩尔比为1:1.1～1:2。
本发明还提供上述基于小分子抑制剂的荧光探针在超分辨成像上的应用。
本发明的有益效果是：
本发明选择具有特定靶点的小分子抑制剂作为研究对象，通过合成手段对小分子抑制剂的合适位点进行衍生修饰，借助柔性PEG链或其它链接分子将其与荧光染料分子相连来构建一种新型的小分子荧光探针，用于细胞蛋白的特异性标记，从而进行相应的超分辨成像研究。与传统的荧光蛋白和抗体探针相比，该类基于小分子抑制剂的荧光探针具有下列优势：第一，该类小分子探针分子量和体积小，对于对应蛋白的标记密度更高并且精确，而抗体由于自身体积的原因，无法精确标记每个目标；第二，每一个小分子抑制剂都会与对应的蛋白进行一对一的结合，这样就可以体现更为真实的蛋白的分布形态，而常用的荧光蛋白需要经过基因编辑技术进行表达，通常会影响目标蛋白的真实表达与功能。第三，合成反应的化学选择性，可以确保小分子抑制剂与染料分子1:1结合，与不确定数量的染料连接的抗体相比，这样更能准确地显示目标蛋白的分布；本发明的基于小分子抑制剂的荧光探针的制备方法简便、制备时间短、质量易控制，可以广泛应用与对应蛋白的分布、定位与组装研究。本发明的基于小分子抑制剂的荧光探针特别适用于超分辨成像。
附图说明
下面结合附图和
具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明的基于小分子抑制剂的荧光探针的制备的原理图；
图2为吉非替尼小分子探针Gefitinib-Alexa 532标记的A549细胞膜上EGFR的组装分布图，标尺为5微米；
图3为双色超分辨荧光成像由吉非替尼小分子探针Gefitinib-Alexa 532标记和antibody-Alexa647探针标记的A549细胞膜上EGFR的共定位分布叠加图，标尺为5微米；
图4为他立喹达小分子探针Tariquidar-TAMRA标记MCF-10A细胞膜上的P-糖蛋白的组装分布图，标尺为5微米。
图5为他立喹达小分子探针Tariquidar-TAMRA标记231细胞膜上的P-糖蛋白的组装分布图，标尺为5微米。
具体实施方式
本发明提供了一种基于小分子抑制剂的荧光探针，结构如式1所示：
式1中，代表小分子抑制剂，包括但不仅限于吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、他立喹达、GDC-0941、A-674563、或AZD-805等。优选为吉非替尼或他立喹达。
代表荧光染料分子，包括但不仅限于Alexa532、Alexa647、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Atto532、Atto488或TAMRA等。优选为Alexa532或TAMRA。
按照本发明，最优选的是，所述的基于小分子抑制剂的荧光探针的结构如式2或式3所示：
本发明还提供了一种基于小分子抑制剂的荧光探针的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤一：对小分子抑制剂进行衍生修饰，得到小分子抑制剂的衍生物；
步骤二：将步骤一中得到的小分子抑制剂的衍生物与链接分子进行连接得到产物二；
步骤三：将步骤二中得到的产物二与荧光染料分子反应，即可得到基于小分子抑制剂的荧光探针。
按照本发明，首先要对小分子抑制剂的合适位点进行改造修饰，改造过程为多步反应，不同反应之间条件略有不同，优选反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇或四氢呋喃，反应温度优选为20～120℃，反应时间为1～16小时；其次，将得到的小分子抑制剂的衍生物与链接分子进行相连得到产物二，优选小分子抑制剂的衍生物与链接分子的摩尔比为1:1.1～1:3，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、或四氢呋喃，反应温度优选为50～120℃，反应时间为10～24小时；最后，将上述得到的产物二与荧光染料分子反应即可得到基于小分子抑制剂的荧光探针，优选的反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、PBS或水，反应温度为室温，产物二与荧光染料分子的摩尔比为1:1.1～1:2，反应时间为2～24小时。
按照本发明，将步骤二中得到的产物二与荧光染料分子反应，所述的反应需要根据产物二末端的分子基团而决定。当产物二的分子末端为氨基时，将产物二直接与荧光染料分子的活性酯进行亲核取代反应，该取代反应优选是在反应溶剂中进行，所述的反应溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、PBS或水，所述的反应过程中需要加入碱，所述的碱优选为三乙胺或二异丙基乙基胺，所述的取代反应的温度优选为室温避光，反应时间优选为2～24小时；
当产物二的分子末端为叠氮基团时，可选择通过点击化学方法与带有炔基基团的染料分子反应得到所需的小分子探针，所述的反应的温度优选为室温，反应时间优选为2～24小时；
当产物二的分子末端为炔基基团时，可选择通过点击化学方法与带有叠氮基团的染料分子反应得到所需的小分子探针，所述的反应的温度优选为室温，反应时间优选为2～24小时；
当产物二的分子末端为巯基基团时，可选择与带有马来酸酐基团的染料分子进行取代反应得到所需的小分子探针，所述的反应的温度优选为室温，反应时间优选为2～24小时；
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1：吉非替尼小分子探针的制备
步骤一：将500毫克吉非替尼溶解于60毫升的二氯甲烷中，冰水浴下向该体系中缓慢加入1.2克三氯化铝，之后撤去冰水浴加热60℃搅拌反应16小时。反应结束后，冷却至0℃，向体系中加入饱和碳酸氢钠以淬灭反应。分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到80毫克产物1。
步骤二：将45毫克产物1溶解于1毫升的乙腈中，搅拌下分别将45毫克的PEG链接分子和43毫克碳酸钾加入该体系，之后升温至50℃反应10个小时。反应结束后，冷却至室温，加入乙酸乙酯稀释，使用去离子水洗涤三次，分出有机相。之后，有机相用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩的初产物。出产物通过柱分离得40毫克产物2。
步骤三：将40毫克产物2溶解于1毫升的二氯甲烷中，之后向该体系中加入0.2毫升三氟乙酸，室温搅拌反应2小时。反应结束后，浓缩得45毫克产物3。
步骤四：将18微克产物3溶解于100微升的DMF溶剂中，之后向反应体现中加入85微克Alexa532染料，室温下避光搅拌过夜。反应结束后，通过柱分离得到吉非替尼小分子探针Gefitinib-Alexa 532。
采用上述方法得到的吉非替尼小分子探针Gefitinib-Alexa 532可以特异性标记细胞膜上的表皮生长因子受体(EGFR)。图2为利用合成所得的吉非替尼小分子探针Gefitinib-Alexa 532对A549细胞表面的EGFR标记的超分辨成像图，标尺为5微米。图2说明合成的吉非替尼小分子探针Gefitinib-Alexa 532能够适用于A549细胞膜表面的EGFR标记。
图3为双色超分辨成像叠加图，分别用Gefitinib-Alexa 532探针标记和antibody-Alexa647探针标记A549细胞膜上EGFR的共定位分布叠加图。图3说明合成的小分子荧光探针Gefitinib-Alexa 532具有标记特异性。
实施例2：他立喹达小分子探针的制备
步骤一：将1克4-硝基苯乙基溴和1.0克的6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐溶解于20毫升的DMF中，之后分别向体系中加入670毫克的碳酸钾和145毫克的碘化钾，升温至70℃搅拌反应16个小时。反应结束后，冷却至室温，加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。有机相用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩的初产物。出产物经过柱分离后得到800毫克化合物4。
步骤二：将800毫克的化合物4溶解于10毫升甲醇中，之后向体系中加入80毫克钯碳催化剂，氮气置换三次后使用氢气置换三次，室温搅拌反应16小时。反应结束后，直接过滤去除钯碳催化剂，滤饼用乙酸乙酯洗涤三次，浓缩得到580毫克化合物5。
步骤三：将550毫克的化合物5和628毫克的化合物6溶解于10毫升的DMF中，之后向体系中加入810毫克的HATU和685毫克的二异丙基乙基胺，室温搅拌反应5小时。反应结束后，加水稀释体系，然后使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。有机相使用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩的初产物。出产物经柱分离后得到750毫克化合物7。
步骤四：将700毫克的化合物7溶解于10毫升甲醇和乙酸乙酯的混合溶剂中，之后向体系中加入70毫克的钯碳催化剂，氮气置换三次后使用氢气置换三次，室温搅拌反应16小时。反应结束后，直接过滤去除钯碳催化剂，滤饼用乙酸乙酯洗涤三次，浓缩得初产物。初产物经过柱分离得200毫克化合物8。
步骤五：将200毫克化合物8溶解于5毫升无水四氢呋喃中，冷却至0℃，向体系中缓慢加入205毫克化合物9，之后升至室温继续搅拌反应16小时。反应结束后，向体系中加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。有机相使用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩的初产物。出产物经柱分离后得到120毫克化合物10。
步骤六：将100毫克的化合物10溶解于5毫升甲醇和四氢呋喃的混合溶剂中，之后向体系中缓慢加入35微升甲醇钠溶液，室温下搅拌反应10小时。反应结束后，加入稀盐酸淬灭反应，加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。有机相使用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩的初产物。出产物经柱分离后得到50毫克化合物11。
步骤七：将50毫克的化合物11溶解于2毫升的DMF中，之后分别向体系中加入27毫克的PEG链分子和33毫克的碳酸钾，升温至50℃搅拌反应10个小时。反应结束以后，冷却至室温，，加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。有机相使用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩的初产物。出产物经柱分离后得到30毫克化合物12。
步骤八：在100微升的PBS溶液中，4mM的TAMRA-alkyne和4mM的化合物12与1Mm的硫酸铜、1mM的TCEP和2mM的TBTA在室温下，避光搅拌反应12小时。反应结束后，通过柱分离得到酪氨酸小分子探针Tariquidar-TAMRA。
利用合成的酪氨酸小分子探针Tariquidar-TAMRA分别对MCF-10A和231细胞膜上的P-糖蛋白进行了超分辨成像研究。图4为酪氨酸小分子探针Tariquidar-TAMRA标记MCF-10A细胞膜上的P-糖蛋白的组装分布图，说明合成的酪氨酸小分子探针Tariquidar-TAMRA可以很好的标记MCF-10A细胞膜表面的P-糖蛋白。图5为酪氨酸小分子探针Tariquidar-TAMRA标记231细胞膜上的P-糖蛋白的组装分布图，说明合成的酪氨酸小分子探针Tariquidar-TAMRA可以精确标记231细胞膜表面的P-糖蛋白。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。