阅读说明：本技术 一种基于百部生物碱骨架的小分子探针及制备方法和应用 (Stemona alkaloid skeleton-based small-molecule probe and preparation method and application thereof ) 是由 马开庆 张梦晨 武兴康 阴彩霞 于 2020-04-07 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种基于百部生物碱骨架的小分子探针及制备方法和应用,属有机化物及其制备的技术领域。本发明完成了基于化合物SA-11结构的小分子探针(阳性探针)的设计与合成,该小分子探针可以与生物正交反应联用,发现基于百部生物碱骨架的活性小分子的作用靶点,为后续小分子结构优化奠定基础,还可对结肠癌细胞HCT-116抑制。(The invention particularly relates to a small molecular probe based on a stemona alkaloid skeleton, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of organic compounds and preparation thereof. The invention completes the design and synthesis of a small molecular probe (positive probe) based on the compound SA-11 structure, the small molecular probe can be used together with a bioorthogonal reaction, the effect target of an active small molecule based on the stemona alkaloid skeleton is found, the foundation is laid for the subsequent optimization of the small molecular structure, and the small molecular probe can also inhibit colon cancer cells HCT-116.)

一种基于百部生物碱骨架的小分子探针及制备方法和应用

技术领域

本发明具体涉及一种基于百部生物碱骨架的小分子探针及制备方法和应用，属有机化物及其制备的技术领域。

背景技术

中药和天然药物是药物发现的宝库，曾经的抗疟疾的青蒿素和最新发现的能够抵抗埃博拉病毒的汉防己碱都是来源于中药。在创新药物研究花费大、时间长、难度越来越大的背景下，从中药和天然药物中寻找先导化合物在近年来又重新成为热点。从中药和天然药物中能够分离得到的天然产物具有显著的生物活性，但是这些天然产物的作用靶点未知，而且其很少的产量也限制了进一步的药理学机制研究。探索行之有效的新研究方法有重要的意义。

目前，多种策略被开发并应用于活性天然产物的靶点寻找，其中基于活性蛋白谱(Activity-based Protein Profiling,ABPP)的策略被广泛应用于活性小分子的靶点寻找。多个天然产物明星分子应用该技术完成了靶点的确认，如腺花素，雷公藤甲素、HEP14、青蒿素、黄芩苷等。而ABPP策略第一步是构建基于活性小分子结构的探针。在前期研究中，我们发现基于百部生物碱骨架的小分子具有显著的抑制结肠癌的活性，但是其作用机制并不清楚。因此，我们在前期合成方法积累及构效关系的基础上，完成了基于化合物SA-11结构的阳性探针的设计与合成，为了在排除在靶点垂钓过程中出现的蛋白非特异性结合，我们同时完成了与阳性探针相对应的阴性探针的设计与合成，并完成了活性验证。在pull-down实验中，靶标蛋白通过SDS-PAGE电泳分离，与阴性探针相比发现多个明显的差异蛋白条带。

化合物SA-11的结构式为：

发明内容

本发明的目的是提供一种基于百部生物碱骨架的小分子探针及其合成方法和应用，该小分子探针可以与生物正交反应联用，发现基于百部生物碱骨架的活性小分子的作用靶点，为后续小分子结构优化奠定基础。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种基于百部生物碱骨架的小分子探针(阳性探针)为(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-N-(丙-2-炔-1-胺基)-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酰胺，其结构式为：

上述分子探针的制备方法为：

(3aR,10bR)-1-亚甲基-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-2-酮与草酰氯及二甲基甲酰胺反应生成(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲醛，(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲醛在二水磷酸二氢钠及次氯酸钠的作用下氧化生成(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酸，(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酸与炔丙胺发生缩合反应生成(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-N-(丙-2-炔-1-胺基)-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酰胺。

一种基于百部生物碱骨架小分子探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在氩气保护下，向干燥的二甲基甲酰胺中逐滴加入草酰氯，产生白色晶体后在此条件下继续反应，并向此混合物中加入二氯甲烷，然后加入(3aR,10bR)-1-亚甲基-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-2-酮(化合物1)的二氯甲烷溶液，继续反应后加入醋酸钠水溶液，搅拌，终止反应，用二氯甲烷萃取，加入无水Na₂SO₄干燥，经柱色谱分离得到(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲醛(化合物3)；

步骤2，在氩气保护下，室温下，依次将二水磷酸二氢钠、次氯酸钠、2-甲基-2-丁烯加入到(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲醛的1，4-二氧六环溶液中，搅拌过夜，反应混合物中加入冰乙酸，用混合溶剂萃取，无水Na₂SO₄干燥后经柱色谱分离得到(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酸(化合物4)；

步骤3，在氩气保护下，室温下，将炔丙胺、三乙醇胺、1-羟基苯并三唑以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐依次加入到(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酸的二氯甲烷溶液中，室温下过夜反应，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥后经柱色谱分离得到(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-N-(丙-2-炔-1-胺基)-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酰胺(化合物2)。

本路线实现了基于百部生物碱骨架活性小分子探针的高效合成。

进一步，所述步骤1中向干燥的二甲基甲酰胺中逐滴加入草酰氯的反应温度为0～10℃，产生白色晶体后继续反应的时间为15min，加入(3aR,10bR)-1-亚甲基-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-2-酮继续反应的时间为0.5h，搅拌的时间为0.5h，萃取的次数为3次。

进一步，所述步骤1中二甲基甲酰胺和草酰氯的摩尔比为2～5:2～5，二氯甲烷的体积为8～16mL，(3aR,10bR)-1-亚甲基-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-2-酮的二氯甲烷溶液的浓度为0.2～0.8mol/L，体积为2～8mL，醋酸钠水溶液的浓度为1～3mol/L，体积为2～10mL。

进一步，所述步骤2中二水磷酸二氢钠、次氯酸钠、2-甲基-2-丁烯的摩尔尔比为4～10：4～10：4～10，(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲醛的1，4-二氧六环溶液的浓度为0.01～1mol/L，体积为1～5mL。

进一步，所述步骤2中搅拌的温度为28℃，冰乙酸的量为2～5mL，混合溶剂为二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1～20:1。

进一步，所述步骤3中炔丙胺、三乙醇胺、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1.5～5：10～15：1.5～5：1.5～5，(3aR,10bR)-1-亚甲基-2-氧-1,3a,4,5,6,10b-六氢-2H-呋喃并[3,2-c]吡咯[1,2-a]氮杂卓-8-甲酸的二氯甲烷溶液浓度为0.02～1mol/L，体积为0.5～2mL，萃取的次数为3次。

一种基于百部生物碱骨架的小分子探针的应用，可与生物正交反应联用，进行百部生物碱骨架化合物的作用靶点垂钓；可对结肠癌细胞HCT-116抑制。

与现有检测小分子硫醇的荧光探针相比本发明具有以下优点：

1.本发明提供了一种基于百部生物碱骨架的小分子探针的简易合成路线，合成本探针的原料易得，成本较低；

2.本发明提供了小分子探针的用途，可与生物正交反应联用，进行百部生物碱骨架化合物的作用靶点垂钓。

附图说明

图1是小分子探针的核磁共振的氢谱图；

图2是小分子探针的核磁共振的碳谱图；

图3是小分子探针对结肠癌细胞HCT-116的抑制活性数据；

图4是小分子探针的靶标蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳。

具体实施方式

实施例1

一种基于百部生物碱骨架小分子探针的制备方法，包括以下步骤：

1)化合物3制备

在氩气保护下，10℃下，向干燥的DMF(72μL)中逐滴加入草酰氯(40μL)。产生白色晶体后在此条件下继续反应15min,并向此混合物中加入8mL DCM。然后加入2mL化合物1(95mg，0.47mmoL)的DCM溶液，继续反应0.5h后加入AcONa水溶液(225mgAcONa溶于2.5mL水中)，搅拌0.5h，终止反应，用DCM萃取三次，加入无水Na₂SO₄干燥，经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离到化合物3(64.2mg)，产率为59％。

如图1：

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.51(s,1H),6.90(d,J＝3.8Hz,1H),6.60(d,J＝3.3Hz,1H),6.25(d,J＝3.8Hz,1H),6.02(d,J＝2.4Hz,1H),5.84(dd,J＝14.8,5.2Hz,1H),4.17–4.10(m,1H),4.01–3.94(m,1H),3.81–3.73(m,1H),2.59(dd,J＝12.9,3.1Hz,1H),2.24–2.18(m,1H),1.92(qd,J＝13.0,3.3Hz,1H),1.68(d,J＝12.2Hz,1H).

如图2：

¹³C NMR(151MHz,CDCl₃)δ179.89(s),169.12(s),138.74(s),134.35(s),132.24(s),124.85(s),123.96(s),107.01(s),80.64(s),45.07(s),44.78(s),34.26(s),25.72(s).

2)化合物4制备

在氩气保护下，室温下，依次将二水磷酸二氢钠(131mg，0.84mmoL)、次氯酸钠(76mg，0.84mmoL)、2-甲基-2-丁烯(90μl，0.84mmoL)加入到化合物3(32mg，0.14mmoL)的1，4-二氧六环(2mL)溶液中，反应在28℃下搅拌过夜。反应混合物中加入2mL冰乙酸，用二氯甲烷：甲醇＝10:1的混合溶剂萃取，无水Na₂SO₄干燥后经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到化合物4(20mg)，产率为58％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.10(d,J＝3.9Hz,1H),6.60(d,J＝3.4Hz,1H),6.19(d,J＝3.5Hz,1H),6.04(d,J＝3.0Hz,1H),5.77(dd,J＝14.8,5.0Hz,1H),4.14(d,J＝7.2Hz,1H),4.02–3.95(m,1H),3.76(t,J＝13.1Hz,1H),2.61–2.56(m,1H),2.22(d,J＝11.8Hz,1H),1.92(d,J＝14.9Hz,1H),1.69(d,J＝13.6Hz,1H).

3)化合物2制备

在氩气保护下，室温下，将炔丙胺(6μL，0.09mmoL)、TEA(43μL，0.8mmoL)、HOBT(12mg，0.09mmoL)以及EDC(17.2mg，0.09mmoL)依次加入到化合物4(15mg，0.06mmoL)的二氯甲烷(1mL)溶液中，在室温下过夜反应，二氯甲烷萃取三次，无水Na₂SO₄干燥经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到化合物2(14.5mg)，产率为85％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.96(d,J＝4.1Hz,1H),6.58(d,J＝3.6Hz,1H),6.14(d,J＝4.0Hz,1H),6.02(d,J＝3.2Hz,1H),5.77(dd,J＝14.9,5.7Hz,1H),5.44–5.34(m,2H),4.15–4.08(m,1H),4.00–3.93(m,1H),3.76(d,J＝7.1Hz,2H),2.60(s,3H),2.28–2.18(m,1H),1.91(qd,J＝13.3,4.2Hz,1H),1.66(dt,J＝23.8,11.1Hz,2H).

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ178.9,171.6,133.4,128.7,113.1,106.9,103.0,47.3,45.2,36.1,35.36,34.7,19.9,15.0,13.1,10.6.

实施例2

1)化合物5制备

在氩气保护下，将钯/碳加入到化合物4(20mg，0.08mmoL)的乙醇(2.5mL)溶液中，进行换气三次，通入氢气，反应在室温下进行3h，过滤、浓缩得到化合物5(16mg)，产率为80％，用于下一步反应。

2)化合物6制备

在氩气保护下，室温下,将炔丙胺(6μL，0.09mmoL)、TEA(43μL，0.8mmoL)、HOBT(12mg，0.09mmoL)以及EDC(17.2mg，0.09mmoL)依次加入到化合物5(15mg，0.06mmoL)的二氯甲烷(1mL)溶液中，在室温下反应混合物搅拌过夜，用二氯甲烷萃取三次，无水Na₂SO₄干燥，经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到化合物6(13.7mg)，产率为80％。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.93(d,J＝4.0Hz,1H),5.99(d,J＝3.8Hz,1H),5.79(dd,J＝14.7,5.8Hz,1H),4.23(t,J＝6.6Hz,2H),4.14(d,J＝7.1Hz,1H),3.96–3.89(m,1H),3.75(d,J＝7.0Hz,1H),3.64(dd,J＝14.6,11.5Hz,1H),3.13–3.06(m,1H),3.05–2.98(m,1H),2.57(dd,J＝12.9,3.2Hz,1H),2.07(s,1H),1.97(s,1H),1.45(d,J＝6.8Hz,3H),1.30–1.26(m,1H).

实施例3

化合物2显著抑制HCT116的增殖(如图3)：

采用SRB检测法检测细胞增殖作用，基于检测蛋白质的含量确定细胞的密度。对数生长期的细胞，胰酶消化，用新鲜培养基将细胞密度调整为4～6×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，置于37.0℃，5.0％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。用培养基稀释药物至2倍检测浓度，保证药物稀释液中DMSO含量保持一致，吸取100μL药物稀释液加入96孔板中，继续培养72h。弃除细胞培养基，轻轻地加入100μL预冷的10％(Wt/Vol)三氯乙酸(TCA)，4℃至少放置1h以上。去除TCA固定液，用缓慢流动的水洗涤五遍，用吸水纸去除残留的水，轻轻地加入100μLSRB染色液，室温孵育25min。去除SRB染色液，用1％的冰醋酸溶液洗涤五遍去除未结合的染料。室温干燥，加入100μL的10mM Tris(pH10.0)溶液，待染料完全溶解后，酶标仪检测OD_570nm。

实施例4

靶标蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳(如图4)：

HCT-116细胞在加有10％FBS且不含抗生素的DMEM中于潮湿环境中生长在37℃的大气中加入10％的二氧化碳。将细胞约80～90％汇合，用1X PBS和胰蛋白酶处理。通过在4℃下于1000rpm离心5分钟获得细胞沉淀，将沉淀用1X PBS洗涤3次。为了制备全细胞裂解液，将细胞首先悬浮在低渗缓冲液(10mM HEPES，pH 7.5，2mM MgCl₂，0.1％吐温20，20％甘油，Roche完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂)，在4℃下孵育10分钟。将悬浮液在4℃下以16000转离心15分钟后分离出来。然后将沉淀重悬于高盐缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，420mMNaCl，2mM MgCl₂、0.1％的tween-20、20％的甘油，罗氏完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂)。在4℃下孵育30分钟。将悬浮液在4℃下以16000转离心15分钟。收集上清液，然后将其与低渗缓冲液中的可溶性部分合并，得到整个细胞的裂解液。使用Bradford分析法对蛋白质进行定量后(Bio-Rad DCTM蛋白质测定)，使用化合物2及化合物6对裂解物进行标记。简而言之，100μg裂解液的浓度为1μg/μL在存在或不存在过量的情况下，然后将裂解物进行CuAAC催化，化合物2及化合物6与Biotin-PEG4-N₃进行点击反应1.5小时，点击反应被淬灭加入10mMEDTA，用CHCl₃-MeOH-水系统沉淀蛋白质。然后将沉淀在含2％SDS和10mM DTT的PBS中溶解至10mg/mL，并最终稀释至1mg/mL 1X PBS。使用PAGE在12％SDS凝胶上分离蛋白质，并扫描凝胶使用EttanTM DIGE成像仪(GE Healthcare)获得荧光。