阅读说明：本技术 乏氧响应性化学修饰蛋白及其制备方法和应用 (Hypoxia-responsive chemically modified protein and preparation method and application thereof ) 是由 殷黎晨 李旭东 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了乏氧响应性化学修饰蛋白及其制备方法和应用,活化的单甲氧基聚乙二醇和羟基偶氮苯在碱、催化剂存在下混合,加热搅拌反应,得到单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯；然后将单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯与对硝基苯基氯甲酸酯反应,得到乏氧响应性蛋白修饰聚合物；碱性条件下,将乏氧响应性蛋白修饰聚合物与蛋白反应,得到乏氧响应性化学修饰蛋白。本发明制备的乏氧响应性化学修饰蛋白不仅具有优异的水溶性,而且不改变蛋白质二级结构,解离后不影响蛋白质性能。(The invention discloses a hypoxic responsive chemical modified protein and a preparation method and application thereof.A preparation method comprises the steps of mixing activated monomethoxy polyethylene glycol and hydroxyazobenzene in the presence of alkali and a catalyst, heating and stirring for reaction to obtain hydroxyazobenzene of monomethoxy polyethylene glycol; then, reacting hydroxyazobenzene of monomethoxy polyethylene glycol with p-nitrophenyl chloroformate to obtain an hypoxic-responsive protein modified polymer; and under the alkaline condition, reacting the hypoxia-responsive protein modified polymer with the protein to obtain the hypoxia-responsive chemically modified protein. The hypoxia-responsive chemically modified protein prepared by the invention has excellent water solubility, does not change the secondary structure of the protein, and does not influence the performance of the protein after dissociation.)

乏氧响应性化学修饰蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及蛋白和多肽化学修饰领域，具体涉及一种乏氧响应性的蛋白修饰及其制备方法与应用，可实现乏氧前后对蛋白和多肽活性的调控。

背景技术

蛋白质是生物学功能的执行者，并且具有多种多样复杂的生物学功能，例如催化生化反应，充当细胞间物质运输的受体以及细胞与细胞间支撑的骨架等等。从理论上，蛋白药物可以于治疗几乎所有明确发病机理的疾病。而与小分子药物相比，蛋白药物高的特异性、复杂的功能性和良好的生物相容性，使得此类药物具有不可比拟的优势。

尽管蛋白药物在疾病治疗中具有众多优势，但在应对不同环境条件时蛋白本身具有一定敏感性，因此将治疗功能性蛋白递送至靶点发挥效果仍具有一定挑战，治疗性蛋白需要安全有效地引入到目的细胞，并最大程度地减少对正常细胞的非特异性作用，在此过程中，根据患病细胞内的特征生理环境，调控蛋白质活性的方式，对蛋白质功能的开发、治疗方法以及递送过程优化至关重要。因此，本领域仍需开发新型化学修饰蛋白的方法，以克服蛋白或多肽类药物的缺陷，拓展蛋白或多肽的应用。

发明内容

本发明是提供一种由偶氮苯键连接、乏氧响应性的修饰方法，该制备方法不仅可以简单快速的把聚合物修饰到蛋白或多肽的表面，而且能够在乏氧条件下实现修饰基团的完全脱落，从而实现对蛋白或多肽活性以及蛋白性能的调控。

本发明采取如下技术方案：

乏氧响应性化学修饰蛋白，其具有如下化学结构式：

其中，R来自蛋白质或者多肽，R-NH₂为蛋白质或者多肽。

本发明通过偶氮苯小分子为连接基团，与不同分子量的单甲氧基聚乙二醇增共同合成偶氮苯聚合物，最后将聚合物修饰到蛋白或多肽的氨基上，完成对蛋白或多肽功能化修饰，得到乏氧响应性化学修饰蛋白。通过在蛋白（RNase）表面修饰具有乏氧响应的偶氮苯基团，使其免受非特异性组织或细胞的相互作用，同时在肿瘤部位恢复其活性。

上述乏氧响应性化学修饰蛋白的制备方法，碱性条件下，将乏氧响应性蛋白修饰聚合物与蛋白反应，得到乏氧响应性化学修饰蛋白。

本发明中，乏氧响应性蛋白修饰聚合物其具有如下化学结构式：

式中：mPEG是单甲氧基聚乙二醇；优选的，所述单甲氧基聚乙二醇的重均分子量是750～10000。

本发明中，碱性条件的pH为8～9，优选8.5；乏氧响应性蛋白修饰聚合物与蛋白反应为室温搅拌反应9～11小时，优选10小时；乏氧响应性蛋白修饰聚合物与蛋白的重量比为1∶0.8～1.5，对蛋白上赖氨酸的伯胺基团进行偶氮苯修饰。

上述乏氧响应性蛋白修饰聚合物的制备方法为，活化的单甲氧基聚乙二醇和羟基偶氮苯在碱、催化剂存在下混合，加热搅拌反应，得到单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯；然后将单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯与对硝基苯基氯甲酸酯反应，得到乏氧响应性蛋白修饰聚合物。

本发明中，活化的单甲氧基聚乙二醇的化学结构式如下：

羟基偶氮苯的化学结构式如下：

单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯的化学结构式如下：

本发明中，制备单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯时，碱为无机碱，催化剂为碘化钾，加热搅拌反应为70～90℃搅拌反应10～15小时；单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯与对硝基苯基氯甲酸酯的反应在分子筛、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶存在下进行，反应的温度为0℃至室温，时间为1～6小时。

本发明提供了一种蛋白或多肽的修饰方法，可以通过乏氧响应性的蛋白修饰材料与蛋白上赖氨酸的伯胺基团进行反应修饰，选择性调控蛋白或多肽活性，制备蛋白或多肽前药，提升蛋白或多肽性能。

本发明中，所述蛋白为核糖核酸酶A、皂草素和细胞色素C等功能性蛋白或多肽药物。

本发明提出了一种偶氮苯修饰的蛋白的制备方法，有益效果在于：

（1） 该偶氮苯修饰的方法，可简单实现多种蛋白和多肽的修饰。反应在室温下进行，不需要添加任何催化剂，并能在水相缓冲液的条件下高效快速进行。

（2） 该方法制备的偶氮苯修饰的蛋白，所具有的PEG链不仅可以保护蛋白的稳定性，延长相应药物蛋白的半衰期，同时改变了蛋白表面电性，利于蛋白药物的生物体内递送。在乏氧刺激下，修饰基团能完全脱落，蛋白的活性恢复，进而实现降低非特异性毒性的作用。

（3） 创新的乏氧响应性可逆修饰方法可进一步拓展蛋白或多肽药物在肿瘤以及炎症相关领域的应用。

附图说明

图1为实施例1中活化的单甲氧基聚乙二醇的核磁图谱。

图2为实施例1中羟基偶氮苯的核磁图谱。

图3为实施例1中带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯的核磁图谱。

图4为实施例1中乏氧响应性的修饰聚合物的核磁图谱。

图5为对比例1中带有甲氧基的羟基偶氮苯的核磁图谱。

图6为对比例1中小分子蛋白修饰物的核磁图谱。

图7为实施例3中化学修饰以及乏氧处理前后MALDI-TOF测定RPAB的分子量变化图。

图8为实施例4中化学修饰以及乏氧处理前后RNase蛋白活性测试图。

图9为实施例5中化学修饰以及乏氧处理前后RNase蛋白圆二色谱图。

图10为实施例6中化学修饰以及乏氧处理前后RNase蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明乏氧响应性蛋白修饰聚合物的制备方法如下：

1）制备活化的单甲氧基聚乙二醇：将单甲氧基聚乙二醇溶解于无水甲苯中，并在减压下除去溶剂和水；加入无水二氯甲烷、三乙胺和对甲苯磺酰氯，混合物室温下搅拌5～8小时；继续加入对甲苯磺酰氯后，搅拌9～11小时，滤出不溶物；滤液浓缩，硅胶柱色谱分离，得到活化的单甲氧基聚乙二醇，化合物1；

2）制备羟基偶氮苯：将对氨基苯甲醇和水的悬浮液冷却至0～5 ^oC，并将盐酸加入到混合物中；向混合物中加入0～5℃的NaNO₂水溶液，并0～5 ^oC下搅拌1小时；苯酚，碳酸钾与水的混合液滴加至上述混合物中，持续5～15分钟，再室温下搅拌2～4小时；反应后，稀冰醋酸加入混合物中，调节pH至4；产物过滤，水和甲醇洗涤，得到羟基偶氮苯固体，化合物2；

3）制备带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯：步骤1）所得的活化的单甲氧基聚乙二醇和步骤2）所得的羟基偶氮苯，碳酸钾，碘化钾混合，在70～90^oC下搅拌10～15小时；混合物用乙酸乙酯稀释，水，饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥；减压蒸发，硅胶柱色谱分离，纯化粗产物，得到带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯，化合物3；

4）制备乏氧响应性的蛋白修饰聚合物：步骤3）所得的带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯溶于二氯甲烷中，加入活化分子筛，冰水浴下加入N,N-二异丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶，再加入对硝基苯基氯甲酸酯的二氯甲烷溶液；0^oC下反应1小时，室温再反应4小时；减压蒸发，硅胶柱色谱分离，得到最终乏氧响应性的蛋白修饰聚合物。

将蛋白和乏氧响应性的蛋白修饰聚合物分别溶解在碳酸氢钠溶液（pH 8.5，0.1M）和二甲亚砜溶液中，之后两者溶液混合，室温搅拌9～11小时，混合物超滤，纯化，冻干，获得乏氧响应性化学修饰蛋白。本发明蛋白为蛋白质或者多肽。

上述具体反应可如下表示:

实施例中：

甲氧基聚乙二醇，对氨基苯甲醇，苯酚，对甲苯磺酰氯，N，N-二异丙基乙胺购，4-二甲基氨基吡啶购买于安耐吉；

三乙胺，对硝基苯基氯甲酸酯，4-硝基苯甲酸，4Å分子筛购买于百灵威化学；

牛胰核糖核酸酶 A购买于Sigma-Aldrich；

所有使用玻璃仪器购买于欣维尔；

分析天平购买于Sartorius（型号：BSA224S）；

离心机购买于Thermo SCIENTIFIC（型号：MULTIFUGE X1R）；

磁力搅拌器购买于IKA（型号：RH digital）；

旋转蒸发仪购买于IKA（型号：RV10）。

具体测试方法都常规技术。

实施例一

制备乏氧响应性聚合物的方法，具体如下：

制备活化的单甲氧基聚乙二醇：将单甲氧基聚乙二醇（15 g，15 mmol）溶解于无水甲苯（100 mL）中，并在减压下除去溶剂。过程重复两次，除去痕量的水。之后依次加入无水二氯甲烷（DCM，250 mL）、三乙胺（14.5 mL，105 mmol）和对甲苯磺酰氯（20 g，105 mmol）。将混合物室温下搅拌6小时。加入对甲苯磺酰氯（20 g，105 mmol）后，继续搅拌10小时，滤出不溶物。滤液浓缩，获得的粗产物通过硅胶柱色谱（二氯甲烷/甲醇 = 10/1）分离，得到白色固体为活化的单甲氧基聚乙二醇（9.28 g，产率48%），氘代氯仿打核磁，附图1为其核磁谱图。

制备羟基偶氮苯：将对氨基苯甲醇（2.34 g，19.00 mmol）和水（35 mL）的悬浮液冷却至5 ^oC，并将盐酸（3.95 mL，47.5 mmol）加入到混合物中。向反应混合物中加入冷的NaNO₂水溶液（1.25 g，19.95 mmol，35 mL），并5 ^oC下搅拌1小时。然后将苯酚（1.88 g，19.98mmol），碳酸钾（3.75 g，27.12 mmol）与水（30 mL）的混合液滴加至上述混合物中，持续10分钟，并在室温下搅拌3小时。反应完成后，将稀的冰醋酸加入混合物中，调节pH至4。产物过滤，水和甲醇洗涤，得到终产物为黄色固体的羟基偶氮苯（4.98 g，产率 72%），氘代二甲基亚砜打核磁，附图2为其核磁谱图。

制备带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯：羟基偶氮苯（684 mg，3 mmol）溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF，4 mL），之后依次加入活化的单甲氧基聚乙二醇（3.00 g，3mmol），碳酸钾（1.38 g，10 mmol），碘化钾（166 mg，1 mmol），并将混合物在80 ^oC下搅拌12小时。将混合物用乙酸乙酯（EtOAc，100 mL）稀释，水（2 × 50 mL），饱和食盐水（50 mL）洗涤，Mg₂SO₄干燥。减压蒸发溶剂后，通过硅胶柱色谱（二氯甲烷/甲醇 = 5/1），纯化粗产物，得到橙色固体的带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯（490 mg，产率 13%），氘代二甲基亚砜打核磁，附图3为其核磁谱图。如果将该步骤中碘化钾除去，即不添加碘化钾，其余不变，则得不到产物单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯；如果将该步骤80℃更换为室温或者50℃，其余不变，全都得不到产物单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯。

制备乏氧响应性的蛋白修饰聚合物：带有单甲氧基聚乙二醇的羟基偶氮苯（0.2g，0.67 mmol）溶于二氯甲烷（15 mL）中，随后加入4Å分子筛（0.1 g），并将混合物搅拌10分钟。在0 ^oC下加入N,N-二异丙基乙胺（0.35 mL，2.01 mmol）和4-二甲氨基吡啶（10 mg，0.08mmol）后，继续加入溶于二氯甲烷（3 mL）的对硝基苯基氯甲酸酯（0.471 g，2.35 mmol）溶液。0 ^oC下反应1小时，室温再反应4小时。减压蒸发溶剂，残留物通过硅胶柱色谱（乙酸乙酯/正己烷 = 3.5/6.5）分离，得到为橙色固体的化合物4乏氧响应性蛋白修饰聚合物（124mg，产率18%），氘代二甲基亚砜打核磁，附图4为其核磁谱图。

实施例二

使用实施例一合成的乏氧响应性蛋白修饰聚合物修饰蛋白核糖核酸酶A（RNase），具体如下：

对蛋白RNase上赖氨酸的伯胺基团进行偶氮苯修饰，将RNase（5 mg）和化合物4（5 mg）分别溶解在NaHCO₃溶液（0.1 M，pH 8.5）和二甲亚砜（DMSO）中，将两者混合，室温搅拌10小时，之后将混合物超滤（MWCO ＝ 3.5 kDa）纯化，并冻干（-80℃），获得偶氮苯修饰后的RNase（RPAB），用于以下测试。

对比例一

制备带有甲氧基的羟基偶氮苯：羟基偶氮苯（0.4 g，1.75 mmol）溶于无水丙酮（40mL），之后加入碳酸钾（0.726 mg，5.26 mmol）和溴乙酸甲酯（0.28 mL，1.83 mmol），反应混合室温搅拌12小时。混合物用乙酸乙酯（100 mL）稀释，水（2×50 mL），盐水（50 mL）洗涤，MgSO₄干燥。在减压下蒸发溶剂后，通过硅胶柱色谱（乙酸乙酯/正己烷 = 4/6），得到带有甲氧基的羟基偶氮苯（457 mg，产率67%），氘代二甲基亚砜打核磁，附图5为其核磁谱图。

制备不含PEG的乏氧响应性蛋白修饰聚合物：带有甲氧基的羟基偶氮苯（0.19 g，0.65 mmol）溶于二氯甲烷（15 mL）中，随后加入活化的分子筛（0.1 g），并将混合物搅拌10分钟。在0 ^oC下，加入N，N-二异丙基乙胺（0.35 mL，2.01 mmol）和4-二甲氨基吡啶（10 mg，0.08 mmol）后，继续缓慢加入溶于二氯甲烷（3 mL）的对硝基苯基氯甲酸酯（0.471 g，2.35mmol）溶液。0 ^oC下反应1小时，室温再反应4小时。减压蒸发溶剂，残留物通过硅胶柱色谱（乙酸乙酯/正己烷 ＝ 2/8）分离，得到为橙色固体的对照组小分子蛋白修饰物（153 mg，产率22%），氘代氯仿打核磁，附图6为其核磁谱图。

将RNase（5 mg）和对照组小分子蛋白修饰物（5 mg）分别溶解在NaHCO₃溶液（0.1M，pH 8.5）和二甲亚砜（DMSO）中，将两者混合，室温搅拌10小时，之后将混合物超滤（MWCO＝ 3.5 kDa）纯化，并冻干（-80℃），获得对照偶氮苯修饰后的RNase，用于测试时无法溶于去离子水，即对照偶氮苯修饰后的RNase加入去离子水中（10 mg/mL），呈现浑浊液。

实施例三

将RPAB（10 mg/mL）溶于去离子水中，得到澄清溶液，再加入Na₂S₂O₄（155 mM）处理6小时，得到Na₂S₂O₄处理的RPAB，用于本实施例以及以下实施例。

通过MALDI-TOF测定Na₂S₂O₄处理前后RPAB的分子量变化。结果见图7，参见（a），与乏氧响应性蛋白修饰聚合物反应后，RNase分子量从13600分别增加到14998、16194、17537和18733 Da，表明每个RNase分子上都修饰了1到4个偶氮苯链，分别对应RPAB1、RPAB2、RPAB3、RPAB4；参见（b），为RNase分子量；参见（c），当用Na₂S₂O₄处理后，RPAB分子量几乎恢复至RNase的初始分子水平，证明了修饰前后偶氮苯化学键的可逆性。

实施例四

使用溴化乙锭（EB）对上述Na₂S₂O₄处理的RPAB以及RPAB进行酶活性测定；将EB（0.5 μg/mL，1 μL）加入到PBS缓冲液（pH 7.4，997 μL）中作为空白对照；将RNase加入到PBS缓冲液（pH 7.4，997 μL）中作为阳性对照。

分别在每组孔中加入PBS缓冲液（pH 7.4，997 μL）、RNA（10 mg/mL，2 μL）和EB（0.5μg/mL，1 μL），不停震荡，在5分钟平衡期内使得荧光强度稳定。之后继续分别加入RNase以及Na₂S₂O₄处理前后的RPAB（1 μg），溶液在震荡下继续孵育5分钟，期间通过荧光分光光度法（λ_ex ＝ 510 nm，λ_em ＝ 590 nm）监测EB荧光变化。结果见图8。由于检测RNase降解RNA的过程中，EB与反应底物（RNA）结合复合物的荧光强度会产生变化。加入RNase后酶催化RNA底物降解，荧光强度逐渐降低。而RPAB显示出最小的酶活性，Na₂S₂O₄处理后酶活性又可以完全得以恢复，进一步说明RNase的活性功能可以通过偶氮苯化学偶联和乏氧偶氮苯的断裂来进行调节。

实施例五

通过圆二色谱（CD）分析化学修饰前后蛋白的二级结构是否受到影响。将RPAB溶于去离子水，制备最终蛋白浓度为100 μg/mL的溶液，此外，游离RNase溶液100 μg/mL作为对照组。通过圆二色光谱仪（CD/J-815，日本）分析RPAB的二级结构。结果见图9。RPAB的CD光谱与RNase的光谱一致，说明化学修饰和乏氧处理的过程中都不会改变蛋白本身的二级结构，确保修饰过程的可行性。

实施例六

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析偶氮苯裂解前后RNase的跑胶情况。将5 × 样品缓冲液（10% SDS（w/v），30% 甘油（v/v），0.02% 溴酚蓝（w/v），TrisHCl（250 mM），pH 6.8）在65 ^oC加热持续3分钟后，样品蛋白（1 mg/mL, 60 μL）上样至SDS凝胶（5% 浓缩凝胶+15% 分离凝胶）胶孔里，调电压至220V，60分钟进行电泳。电泳结束，将凝胶取下，放入固定溶液（25% 异丙醇（v/v），10%乙酸的水溶液（v/v））中，之后用考马斯亮蓝染色溶液染色过夜（10%乙酸（v/v），0.006%考马斯亮蓝的水溶液（w/v））。在脱色液中脱色，每隔30分钟换一次脱色液，至少换3次。结果见图10。相比于RNase条带，RPAB整体迁移至分子量更高的新条带处。用Na₂S₂O₄处理RPAB后，RNase条带又重新出现，也说明了合成的偶氮苯聚合物与RNase之间化学修饰过程的可逆性。

本发明通过MALDI-TOF对RPAB分子量进行分析，与PAB反应后，RNase分子量从13600分别增加到14998、16194、17537和18733 Da，表明每个RNase分子上都修饰了1到4个偶氮苯链；当用Na₂S₂O₄处理后，RPAB分子量几乎恢复至RNase的初始分子水平，证明了修饰前后偶氮苯化学键的可逆性。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺钠凝胶电泳（SDS-PAGE）实验中，相比于RNase条带，RPAB整体迁移至分子量更高的新条带处；用Na₂S₂O₄处理RPAB后，RNase条带又重新出现，也说明了PAB与RNase之间结合和断裂的可逆过程。为了进一步说明修饰前后对蛋白活性的调控，采用溴化乙锭（EB）荧光法，检测RNase降解过程中EB与反应底物（RNA）结合复合物的荧光强度变化，加入RNase后，由于酶催化RNA底物降解，荧光强度逐渐降低，而RPAB显示出最小的酶活性，Na₂S₂O₄处理后酶活性又可以完全得以恢复，说明RNase的活性功能可以通过PAB化学偶联和乏氧偶氮苯的断裂来调节。最后，RPAB的CD光谱与RNase的光谱一致，也证明结合和乏氧处理的过程中都不会改变蛋白本身的二级结构，因此证实了含有偶氮苯修饰的RNase既可以通过偶氮苯的修饰使蛋白暂时失活，也可以通过乏氧的高度选择性恢复其蛋白功能。

本发明为调节蛋白结构以及蛋白递送提供了一种有效策略，可以利用环境的特异性控制化学键，进而控制蛋白活性，以实现治疗效果的最大化；进行了一些实验探索性靶向蛋白修饰体系，可以有效的调节蛋白性能，保证对正常细胞不产生毒性作用。