阅读说明：本技术 一种工程化组装蛋白聚糖及其制备方法和应用 (Engineered assembly proteoglycan and preparation method and application thereof ) 是由 李福川 王文爽 韩乃寒 许莹莹 石立冉 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于蛋白质工程技术领域,涉及工程化组装蛋白聚糖及其制备方法和应用。一种工程化组装蛋白聚糖,其特征在于：包括带有醛基蛋白聚糖核心蛋白,及标记有修饰基团的糖胺聚糖侧链。一种工程化组装蛋白聚糖的制备方法,包括：制备带有醛基的蛋白聚糖核心蛋白；在糖胺聚糖侧链上标记修饰基团；所述修饰基团为肼基、氨氧基、羟胺基；将带有修饰基团的糖胺聚糖侧链通过修饰基团与醛基之间的化学反应组装到蛋白聚糖核心蛋白上。本发明的工程化组装蛋白聚糖及其制备方法,首次解决了具有特定结构GAG侧链的PGs的工程化构建问题,可以在体外和体内实现具有任意组成和结构GAGs糖链与特定PGs核心蛋白的组装,为具有特定GAG侧链的PGs构效关系研究和规模化制备奠定了基础,在相关蛋白聚糖类生物制剂和医药产品开发中具有重要应用价值。(The invention belongs to the technical field of protein engineering, and relates to engineered assembled proteoglycan, a preparation method and application thereof. An engineered assembled proteoglycan, comprising: comprises an aldehyde proteoglycan core protein and a glycosaminoglycan side chain marked with a modifying group. A method of preparing an engineered assembled proteoglycan, comprising: preparing proteoglycan core protein with aldehyde group; labeling a modification group on a glycosaminoglycan side chain; the modifying group is a hydrazine group, an aminoxy group or a hydroxylamine group; and (3) assembling the glycosaminoglycan side chain with the modification group on the proteoglycan core protein through a chemical reaction between the modification group and the aldehyde group. The engineering assembly proteoglycan and the preparation method thereof solve the engineering construction problem of PGs with GAG side chains with specific structures for the first time, can realize the assembly of GAGs sugar chains with any composition and structure and specific PGs core protein in vitro and in vivo, lay a foundation for the research and large-scale preparation of the structure-activity relationship of the PGs with specific GAG side chains, and have important application value in the development of related proteoglycan biological preparations and medical products.)

一种工程化组装蛋白聚糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，涉及工程化组装蛋白聚糖及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白聚糖(Proteoglycans，PGs)是一类结构极为复杂的生物大分子，它是由一条或多条糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)侧链共价连接到核心蛋白上而形成的，常常存在于细胞膜表面及细胞外基质(Extracellular matrix，ECM) 中。PGs参与了如细胞黏附与迁移(1，2)、细胞信号传导(1，3-8)、细胞***(9)、组织形态发生(10-12)、炎症(13，14)和癌症(15)等一系列生理和病理过程。依据PGs 在细胞中的存在位置，可以分为细胞内、细胞表面、细胞周及细胞外四类。细胞内最主要的蛋白聚糖-Serglycin常存在于肥大细胞的颗粒中，作为生物粘合剂帮助肥大细胞颗粒储存大部分细胞内蛋白酶，还可以结合及调节多种炎症相关的趋化因子、细胞因子和生长因子的生物活性(16)。细胞表面的PGs主要分为跨膜PGs和锚定在细胞膜表面的PGs两类，其中syndecan、CSPG4、bataglycan和 phosphacan为跨膜PGs，而glypican则通过GPI锚定在细胞膜表面。Syndecan 具有多种多样的生物学功能，包括组织形态发生、参与外泌体的摄取(17)，介导动脉粥样硬化脂蛋白的清除(18)，可溶性syndecan-1可以促进骨髓瘤在体内的生长(19)等。CSPG4促进肿瘤血管的生成(20)，参与严重假膜性结肠炎的发病(21) 等。Bataglycan参与调解生殖及胎儿生长等多种功能(22)，并是多种癌症公认的抑癌因子(23)。Glypican参与了血管再生及肿瘤生长，其中Glypican-3还是肝癌早期诊断的标志物。细胞周蛋白聚糖Perlecan和Agrin参与调节细胞黏附(24，25)、脂质代谢(26)、血栓形成和细胞死亡(27，28)、血管和软骨生物力学(29，30)、皮肤和软骨内骨形成(31，32)、骨刺形成(33)。细胞外蛋白聚糖主要包括aggrecan、 versican、neurocan和brevican四类，其中aggrecan参与滑膜关节和关节软骨的形态形成(34)，并且是骨关节炎的生物标志物(35)；versican常参与细胞的黏附、迁移及炎症发生(36-38)；neurocan可抑制神经突的生长，在成人中枢神经系统的机械损伤和缺血性损伤部位表达量增加(39，40)；brevican与胶质瘤的发生、神经组织损伤和修复以及阿尔茨海默病有关(41)。上述这些生物学功能使得PGs在疾病诊断及治疗中具有重要的作用。

前期的研究表明，GAG链在PGs的生物学功能中起着关键作用。根据GAG 二糖单位的不同，GAG又被分为透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS)，硫酸软骨素/硫酸皮肤素 (Chondroitin Sulfate/DermatanSulfate，CS/DS)，硫酸角质素(Keratan Sulfate， KS)。其中，HA、CS/DS和Hep/HS是由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和己糖胺(N-乙酰氨基半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖)形成的二糖单位重复组成的，而KS是由中性N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖形成的二糖单位重复组成的。HA是唯一一类不含有硫酸基团的GAG，它虽然不以PGs的形式存在，但是可以与一些PGs以非共价形式结合形成更大分子的聚合体。除HA外，其他的GAG糖链常常由于各种修饰酶的作用而变得异常复杂，主要表现为D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，糖链中不同部位羟基(-OH) 和氨基(-NH₂)的硫酸化，以及己糖胺二位氨基的乙酰化等。GAG侧链长度、种类、数量及修饰程度的不同，核心蛋白分子大小及结构的差异赋予PGs功能的多样性，不同的结构具有不同的功能。与核酸和蛋白质不同，GAG以非模板依赖性的方式合成，不能通过基因工程手段选择性地扩增具有特定结构的GAG 链。这些原因都限制了结构均一、功能确定的蛋白聚糖的制备及构效关系研究。

利用分子生物学手段对PGs核心蛋白上的糖基结合位点进行突变是研究PGs 侧链功能的传统方法，该方法仅能阐明GAG侧链的数量对PGs功能的影响，不能解释不同种类或长度的GAG链对PGs作用的影响(42)。近期有研究报道，通过基因编辑手段对细胞中与GAG合成相关的酶进行敲除或过表达，从而对细胞合成GAG的种类和修饰模式进行调控，但该方法并不能对合成GAG糖链的特异性结构进行精确控制，更不能对特定蛋白聚糖的GAG侧链的组成和结构进行选择性精确调控，因此该技术并不能解决特异结构GAG侧链对特定PGs生物学功能的影响问题(43)，更没有解决具有特异结构GAG侧链PGs的工程化制备及应用问题。

甲酰甘氨酸(Formylglycine，fGly)是硫酸酯酶活性位点的关键氨基酸，是在硫酸酯酶翻译过程中或翻译后，经fGly-生成酶(fGly-generating enzyme，FGE) 催化由相应的半胱氨酸(Cys)残基转化而来(44，45)。研究发现GFE可以专一性识别硫酸酯酶的一个短的共有保守序列CXPXR(其中X可以是脯氨酸外的任何氨基酸)，并氧化序列中的Cys残基成为含醛基的fGly，该序列可以被重组到目的蛋白中，通过与FGE共转染或体外催化，在目的蛋白的特定位置引进带有醛基的fGly，高活性且在蛋白中稀有的醛基为目的蛋白的点特异性修饰提供了理想的反应位点(46)。在弱酸性(pH4-6)甚至生理条件下，醛基标记蛋白可在室温下被含有氨氧基、肼基或羟胺的分子所修饰。

上述醛基标记技术已被应用于蛋白的点特异性修饰，包括蛋白荧光标记和生物素化、抗体-药物缀合物制备，以及蛋白的糖基化等。在这些应用中蛋白修饰分子的结构都相对简单，与之相比，带高负电荷且结构极为复杂的糖胺聚糖分子对醛基修饰蛋白的点特异性修饰一直未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种新型工程化组装蛋白聚糖及其制备方法及应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：工程化组装蛋白聚糖，包括带有醛基的蛋白聚糖核心蛋白，及标记有修饰基团的糖胺聚糖侧链。

进一步的，所述的修饰基团为肼基、氨氧基、羟胺基。

本发明解决其技术问题还提供了一种工程化组装蛋白聚糖的制备方法，该方法包括：

制备带有醛基的蛋白聚糖核心蛋白；

在糖胺聚糖侧链上标记修饰基团；所述修饰基团为肼基、氨氧基、羟胺基；

将带有修饰基团的糖胺聚糖侧链通过修饰基团与醛基之间的化学反应组装到蛋白聚糖核心蛋白上。

进一步的，带有醛基的蛋白聚糖核心蛋白的制备方法包括：

将蛋白聚糖核心蛋白糖基化位点突变成可转化为醛基的氨基酸序列；

利用fGly-生成酶催化所述的氨基酸序列使其转化为醛基。

作为本发明的一种优选方式，所述的可转化为含有醛基的氨基酸序列为 CXPXR，其中X为脯氨酸除外的任何氨基酸。

进一步的，所述的化学反应是指醛基与肼基、氨氧基或羟胺基的反应。

本发明还提供了所述工程化组装蛋白聚糖在制备癌症诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述工程化组装蛋白聚糖在制备药物中的应用。

本发明还提供了所述工程化组装蛋白聚糖的制备方法在制备癌症诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述工程化组装蛋白聚糖的制备方法在制备药物中的应用。

本发明的工程化组装蛋白聚糖及其制备方法和应用，与现有技术相比，具有的有益效果为：

首次解决了具有特定结构GAG侧链的PGs的工程化构建问题，可以在体外和体内实现具有任意组成和结构GAGs糖链与特定PGs核心蛋白的组装，为具有特定GAG侧链的PGs的构效关系研究和规模化制备奠定了基础，在相关蛋白聚糖类生物制剂和医药产品开发中具有重要应用价值。

附图说明

图1：GPC3成功带上醛基；

图2：GAG寡糖还原端标记上肼基；

其中A，HA二糖；B，Hep二糖；C，HA二糖标记后质谱谱图；D，HA二糖标记前质谱谱图；E，Hep二糖标记后质谱谱图；F，Hep二糖标记前质谱谱图；

图中1，HA标记二糖；2，HA二糖；3，Hep标记二糖；4，Hep二糖；

图3：GAG寡糖成功连接到GPC3核心蛋白上；

图4：细胞膜表面GPC3侧链的工程化安装；

图5：糖链长度对Wnt3A细胞信号传导的影响；

图6：不同GAG对Wnt3A细胞信号传导的影响；

图7：GPC3介导Wnt3A的内吞；

图8：GPC3与Frizzled-7相互作用分析。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

实施例1、醛基标记的GPC3氨基酸序列

将GPC3糖基结合位点附近的氨基酸序列突变为LCTPSR，进而FGE可以将Cys转化为fGly。根据突变位点的不同，携带一个醛基的GPC3分别命名为 GPC3-S495C和GPC3-S509C，而携带两个醛基的突变蛋白命名为GPC3-O。GPC3 氨基酸序列的F494位点到C499位点突变为LCTPSR被命名为GPC3-S495C，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。而氨基酸序列的G508位点到G513位点突变为LCTPSR被命名为GPC3-S509C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述两个位置均被突变的GPC3-O的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1

MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGL KWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMEL KFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVS LYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLK VFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRM WYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVN GMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRFA YYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPV AENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKL KHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDEEGLCTPSRGDDEDECIGGSGDGMIKVKN QLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAIS VVCFFFLVH-

SEQ ID NO.2

MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGL KWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMEL KFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVS LYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLK VFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRM WYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVN GMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRFA YYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPV AENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKL KHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDEEGFESGDCGDDEDECILCTPSRMIKVKN QLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAIS VVCFFFLVH-

SEQ ID NO.3

MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGL KWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMEL KFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVS LYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLK VFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRM WYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVN GMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRFA YYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPV AENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKL KHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDEEGLCTPSRGDDEDECILCTPSRMIKVKN QLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAIS VVCFFFLVH-

实施例2、肼基标记的GAG寡糖及醛基标记的GPC3的制备

为了验证GPC3可以成功的带上了醛基，将带有醛基的GPC3突变体与带有肼基的生物素(Biotin-LC-Hydrazide)进行反应。随后将反应产物加入到被GPC3 抗体包被的96孔板中，室温放置1-3小时，孵育结束后，用PBS洗涤1-5次，用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的亲和素检测GPC3上的生物素。结果如图1所示，共转染FGE质粒的GPC3突变体具有更明显的结合亲和素的能力。此外，具有两个糖基结合位点的GPC3-O突变体具有比其他两个突变体更高的亲和素结合能力。这表明，这两个糖基结合位点成功地标记上了活性醛基基团。

同时，制备肼基标记的GAG寡糖链。用相应的GAG裂解酶对GAG进行部分降解得到一系列的寡糖，然后利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)对各寡糖进行收集，将分离得到的寡糖组分与过量的已二酸二酰二肼反应。为了确定寡糖是否被肼基基团成功标记，我们对HA和Hep 二糖标记前后进行了高效液相和质谱法(Mass spectrometry，MS)分析。HPLC 结果显示，约50％的二糖被己二酰肼标记(图2A，2B)。为了进一步证实糖确实标记上了肼基，在负离子条件下我们对HPLC上的两个主峰进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。HA二糖的两个组分分别为534.1933和378.0934m/z，这与标记前后HA二糖的分子量是相符的(图2C，2D)。图2F中在247.4936和287.4736 m/z处显示了两个信号峰，这分别可以指认为含有两个和三个硫酸基团的Hep二糖。相应地，图S3E中325.5426和365.5227m/z中的两个信号峰指认为肼基标记的两个和三个硫酸基团的Hep二糖。同样，CS和DS寡糖也可以被成功标记。

实施例3、GAG侧链与GPC3的体外连接

GPC3核心蛋白结构较为复杂，且醛基位于GPC3氨基酸序列的中间，因此确定寡糖链能够成功地连接到核心蛋白是很有必要的。将转染了FGE和GPC3 突变体的293T细胞进行裂解，然后将肼标记的GAG寡糖组分加入细胞裂解液中反应2-6小时。标记前后的蛋白样品用Western Blot进行检测，一抗选用GPC3 的鼠单抗(实验室采用常规方法自制)，二抗选用HRP或AP标记的抗小鼠的抗体。如图3所示，对于含有两个醛基的GPC3-O，约50％的蛋白标记上一个寡糖链，20％的GPC3标记上两个寡糖链，随着寡糖分子量的增加，标记效率逐渐降低。这一结果表明，GAG寡糖可以很好地与带有醛标记的GPC3组装，这对 GPC3构效关系研究及活性专一、副作用小的PGs相关诊断试剂盒和药物开发具有重要作用。

实施例4、细胞膜表面GPC3侧链的工程化安装。

将293T细胞接种于24孔板中，并转染GPC3-O载体和FGE载体。转染后第2天在培养基中分别添加肼标记的GAG寡糖链(pH值调整为5-7)。4-12小时后，细胞裂解并进行WesternBlot进行检测，一抗选用GPC3的鼠单抗(实验室自制)，二抗选用HRP或AP标记的抗小鼠的抗体。如图4所示，经过肼基标记HS寡糖处理的细胞裂解液显示了与野生型GPC3相似的弥散条带，细胞裂解液经过DEAE-阴离子交换柱纯化后可以显著增强弥散条带的含量。此外，肼基标记HS十四糖处理过的细胞裂解液中分别检测到3条带，这三条带分别为含 0、1、2条HS侧链的GPC3。同样的，两条含有HS侧链的GPC3也可以通过 DEAE-阴离子交换柱来浓缩。这个结果表明肼基标记的HS寡糖可以成功地结合到活细胞表面表达的含有醛基的GPC3-O核心蛋白上。

实施例5、采用本发明的方法在核心蛋白上组装不同长度的糖链对Wnt3A 细胞信号传导的影响；

将293T细胞接种于24孔板中，并转染GPC3-O和FGE表达载体及细胞信号传导相关载体。转染后第2天在培养基中分别添加肼标记的HS寡糖链(pH 值调整为5-7)，放置4-12小时。然后，细胞在Wnt3A条件培养基或对照培养基中再孵育24小时。最后，细胞被裂解并测定荧光素酶活性。每项实验至少进行五次，每次三个平行。如图5所示，随着组装的HS链长度的增加，GPC3促进Wnt3A细胞信号转导的能力增强，当HS链长度达到十四糖(DP14)时，促进细胞信号传导的能力达到最强，糖链长度大于十四糖后促进Wnt3A细胞信号传导的活性没有显著变化，这表明十四糖是GPC3刺激Wnt3A信号最高活性所需的HS侧链最小尺寸。

实施例6、采用本发明的方法制备的工程化组装蛋白聚糖，不同GAG对 Wnt3A细胞信号传导的影响；

将293T细胞接种于24孔板中，并转染GPC3-O和FGE表达载体及细胞信号转导所需载体。转染后第2天在培养基中分别添加肼标记的GAG十四糖(pH 值调整为5-7)，放置4-12小时。然后含有肼基标记的GAG十四糖及Wnt3A 条件培养基将细胞再孵育24小时。最后，细胞被裂解并测定荧光素酶活性。每项实验至少进行五次，每次三个平行。如图6所示，与没有侧链的GPC3ΔGAG 相比，组装有GAG侧链的GPC3-O(除HA外)均具有更明显刺激Wnt3A信号的能力。含有两条CS和DS侧链的GPC3对Wnt3A的刺激作用相似，比无糖链的GPC3ΔGAG高约30％。连有两条HS侧链的GPC3对Wnt信号传导的影响大约是GPC3ΔGAG的283％，而连有Hep侧链的GPC3对Wnt信号的刺激能力大约是GPC3ΔGAG的326％。这一结果表明，GAG侧链中硫酸根的数量及二糖组成影响了GPC3在Wnt细胞信号传导中的作用。

实施例7、工程化组装后的GPC3介导Wnt3A的内吞

研究表明，GPC3通过与Wnt3A相互作用并介导Wnt3A内吞，从而刺激 Wnt信号通路(47)。为了验证工程化组装后的GPC3是否同样具有与野生型GPC3 相同生物学功能，将细胞接种于多聚赖氨酸处理的载玻片上，并转染GPC3-O或对照载体和FGE表达载体。转染两天后，加入生物素和肼标记HS寡糖链(bioHS)，放置4-12小时。放置结束后，用含1-5％BSA的DMEM在4℃条件下放置0.5-1 小时，随后加入Wnt3A或者对照条件培养基并在相同的温度下放置1-3小时。为了研究GPC3-Wnt3A内吞作用，细胞用PBS清洗1-3次，加入预热的DMEM 并转移到37℃中孵育0-60分钟。孵育结束后，用PBS清洗3-5次并用4％多聚甲醛固定。细胞固定结束后进行免疫染色，细胞首先用0.1％Trion X-100处理 15-60分钟，用5％脱脂奶粉再封闭1小时。最后加入相应地一抗及荧光标记的二抗。结果如图7所示，这些细胞转移至37℃放置30或60分钟时，GPC3和 Wnt3A从细胞膜内吞到了细胞质和细胞核周围。结果表明，GPC3-bioHS能够介导Wnt3A的内化，从而激活Wnt3A信号。

实施例8、GPC3与Frizzled-7相互作用分析

众所周知，细胞表面的PGs通过与各种生长因子、形态因子及其受体相互作用来调节细胞信号(48)。然而，传统的方法很难直观地证明PGs与靶蛋白，尤其是表达在细胞表面的复杂糖蛋白之间的相互作用(49，50)。

在本实施例中，利用糖蛋白的代谢糖标记和PGs的工程化组装两种策略，建立了一种新的方法来测定PGs与其靶向蛋白在活细胞表面的相互作用。将 HEK293T细胞接种于10cm细胞培养板上，共转染GPC3-O、FGE载体和FZD-7 载体。一天后，培养上清中加入终浓度为20-400μM叠氮基标记的葡萄糖胺放置 12-36小时。之后在新的不含FBS的培养上清中加入0.5-2μM的肼基标记的HS 寡糖链和终浓度为20-400μM叠氮基标记的葡萄糖胺。细胞孵育过夜后，细胞用含250mM三氮基***甲基胺(Tris[(1-benzyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methyl]amine， TBTA)、50mM CuSO₄，500mM L-抗坏血酸钠(L-Ascorbic Acid SodiumSalt，SA) 的PBS室温条件下孵育1-4h。最后用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解20-60分钟。细胞裂解液进行Western Blot检测，一抗FZD-7兔抗体，二抗用HRP或AP标记二抗孵育，最后用增强型化学发光试剂检测蛋白条带。结果如图8所示，以FZD-7抗体为探针，含叠氮基团的FZD-7可以与带有叠氮基寡糖链的GPC3结合，结合效率约为20％。经肝素酶(Hepase)III处理后，带有叠氮基寡糖链的GPC3与FZD-7结合产物中的GPC3脱落。这些结果证明了 GPC3与FZD-7之间具有相互作用。

实施例9、工程化组装的GPC3在肝癌早期诊断试剂盒中的应用

GPC3在胚胎发育阶段各种组织中被广泛表达，但在成年后因DNA甲基化而沉默。近年来，GPC3被发现在约75％的肝细胞癌中专一性表达，但在肝脏的正常组织和良性病变中不表达，是比甲胎球蛋白(AFP)更为特异的肝细胞癌生物标志分子。因此我们可以通过微生物大规模制备工程化组装的GPC3，并将其作为标准用于肝癌早期诊断试剂盒中。

用30-100μl浓度为10-50ng/ml的GPC3专一性抗体αGCN铺于96孔板上，然后用1％BSA对其进行封闭。封闭结束后用PBS清洗1-5次，然后加入溶在 PBS中不同浓度的工程化组装的GPC3及病人样品，室温放置1-3小时，孵育结束后，用PBS洗涤1-5次；加入GPC3专一性兔多抗，室温放置1-3小时，孵育结束后，用PBS洗涤1-5次；加入相对应的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗兔的多抗，室温放置10-30min，PBS洗涤3-7次，最后加入相对应的底物，并测定吸光值。通过吸光值读数从而对肝癌早期病人进行诊断。

实施例10、工程化组装的蛋白聚糖在药物研发中的应用

核心蛋白聚糖(Decorin)是最简单的蛋白聚糖，它含有一个核心蛋白和一个 DS糖链，它在抑制眼结膜下瘢痕形成中具有重要作用。在本发明中，我们利用工程化组装的Decorin制备抗瘢痕凝胶眼药水。具体步骤如下：在70-90℃，搅拌条件下向去离子水中加入0.8-1.2％的低酰基吉兰糖胶，制成液体凝胶。然后将凝胶溶液温度降至40℃，并加入溶于PBS中的工程化组装的Decorin溶液，最终使得吉兰糖的终浓度为0.9％，并使1ml凝胶溶液中含0.2-0.3μg的工程化组装的Decorin。因此，本发明首次提供了一种研究PGs与糖蛋白的相互作用的新颖、方便、廉价方法。

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