具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，下面通过具体实施方式并且结合附图来详细描述本发明的构思和机理分析等，但是本发明并不因此而受任何限制。

需要说明的是，本发明中的数值范围都包括端值以及端值之间的任何点值。例如，数值范围1～10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；数值范围0.1～0.9包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9。

本文所述的术语“生物大分子”是指生物体细胞内存在的蛋白质、多肽、核酸、多糖等大分子。每个生物大分子内有几千到几十万个原子，分子量从几万到几百万以上。生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，蛋白质和多肽的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸，多糖的组成单位是单糖。从化学结构而言，蛋白质和多肽是由α-L-氨基酸脱水缩合而成的，核酸是由嘌呤和嘧啶碱基，与糖D-核糖或2-脱氧-D-核糖、磷酸脱水缩合而成，多糖是由单糖脱水缩合而成。

本文所述的术语“含有醛基的生物大分子”是指含有一个或多个醛基的上述生物大分子。

本文所述的术语“蛋白质”是由氨基酸首尾相连缩合而成的共价多肽链。蛋白质包括天然蛋白质和合成蛋白质。每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象，即蛋白质的结构。蛋白质的分子结构可划分为四级：(1)一级结构：组成蛋白质多肽链的线性氨基酸序列；(2)二级结构：依靠不同氨基酸之间的C＝O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为α螺旋和β折叠；(3)三级结构：通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构；(4)四级结构：用于描述由不同多肽链(亚基)间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。除了这些结构层次，蛋白质可以在多个类似结构中转换，以行使其生物学功能。对于功能性的结构变化，这些三级或四级结构通常用化学构象进行描述，而相应的结构转换就被称为构象变化。

本发明中，常用的蛋白质包括但不限于：(1)绿色荧光蛋白(GFP)，其为一种β-桶状蛋白1，由238个氨基酸组成，具有如下SEQ ID NO.1的氨基酸序列，分子量为约27kDa；GFP是从水晶水母Aequorea victoria分离而来；GFP可通过能量转移，将水母发光蛋白通过化学作用发出的蓝色荧光转变为绿色荧光2。(2)抗表皮生长因子受体纳米抗体，其具有如下SEQID NO.2的氨基酸序列，分子量为约18.00834kDa。(3)抗β2微球蛋白的纳米抗体，其具有如下SEQ ID NO.3的氨基酸序列，分子量为18.45833kDa。这些蛋白质都可购自生工生物工程(上海)股份有限公司，它们的氨基酸序列分别如下：

绿色荧光蛋白的SEQ ID NO.1的氨基酸序列：

GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVR GEGEGDATNGKLTLKFICTT GKLPVPWPTLVTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGTYKTRAEVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNFNSHNV YITADKQKNG IKANFKIRHN VEDGSVQLADHYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSVLSKDPNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELYK GGGGSLCTPSR

抗表皮生长因子受体纳米抗体的SEQ ID NO.2的氨基酸序列：

AEFQVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQPQPQPQPQPNPTTEHHHHHHGGGGSLCTPSR

抗β2微球蛋白的纳米抗体的SEQ ID NO.3的氨基酸序列：

AQVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTDSRYCMAWFRQAPGKEREWVARINSGRDITYYADSVKGRFTFSQDNAKNTVYLQMDSLEPEDTATYYCATDIPLRCRDIVAKGGDGFRYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQPQPQPQPQPNPTTEHHHHHHGGGGSLCTPSR

本文所述的术语“多肽”是指由三个或三个以上氨基酸分子组成的肽，肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。多肽的分子量低于10,000Da，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。另外，有文献把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(也称小分子肽)；10～50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质。本领域中，任何多肽都可作为本发明所研究的多肽，本领域技术人员能够根据需要选择合适结构的多肽以赋予相应的功能效果。

本文所述的术语“米氏酸”具有如下通式II：

其中，R₁为具有碳数1至50的烷基、具有碳数2至50的环烷基、具有碳数2至50的烯基、具有碳数2至50的炔基、具有碳数6至50的芳基或杂芳基，并且杂原子选自N、O、S和P；R₅为-(CH₂)_nCOOH，n为1～60、优选1～30、更优选1～20和最优选1～10的正整数；并且R₁和R₅各自都可被R₄取代，R₄为氟、氯、溴、碘、具有碳数1至50的烷基、具有碳数2至50的环烷基、具有碳数6至50的芳基或杂芳基，并且杂原子选自N、O、S和P。

本文所述的术语“米氏酸的酰胺衍生物”具有如下通式I：

其中，R₁为如上所述；R₂为-(CH₂)_nCONHR₃，并且n为1～60、优选1～30、更优选1～20和最优选1～10的正整数，R₃为氢、具有碳数1至50的烷基、具有碳数2至50的环烷基、具有碳数2至50的烯基、具有碳数2至50的炔基、具有碳数6至50的芳基或杂芳基，并且杂原子选自N、O、S和P；R₁、R₂和R₃各自都可被上述R₄取代。

本发明中，常见米氏酸的酰胺衍生物包括但不限于，例如具有如下结构的米氏酸酰胺衍生物：

(其中，R基可为任何功能分子，如荧光团、药物等)；

本文所述的术语“偶联反应”是由两个有机(生物)化学单位进行某种化学反应而得到一个有机(生物)分子的过程。这里的化学反应包括格氏试剂与亲电体的反应，锂试剂与亲电体的反应，芳环上的亲电和亲核反应等。本文中的偶联反应一般是指蛋白质或多肽的醛基偶联反应。

根据本发明，蛋白质或多肽的醛基包括通过蛋白质或多肽的N端氧化反应或转胺反应得到的醛基、通过酶法得到的蛋白质或多肽的醛基标签以及蛋白质或多肽中含有醛基的非天然氨基酸。另外，根据本发明，蛋白质或多肽的醛基偶联包括荧光团、化疗药物、放疗药物、多肽、蛋白、核酸、亲和标签的偶联以及蛋白质的固载。固载载体包括琼脂糖凝胶、四氧化三铁磁性微球、二氧化硅微球以及金属表面。

对于本发明其他术语来说，除非另外说明，否则本领域技术人员通常能够理解其在本领域的通常含义。

本领域中，米氏酸和醛基反应属于常见有机合成反应，但并未给予本发明相应启示，这是本发明人出乎意料的首次发现。原因如下：

首先，本发明中所提到的米氏酸衍生物类型尚未有文献报道，而专利EP0578849A1中仅公开了一种1，3-二氧六环-4，6-二酮衍生物，其中2号环碳原子上连接的两个基团分别是C_1-5烷基或苯基和氢或C_1-4烷基。

其次，虽然米氏酸及其衍生物和醛基反应在有机合成领域有大量应用，但与蛋白质醛基反应尚未有报道。有机合成中米氏酸结构是用作合成原料，而本发明中米氏酸结构是提供与蛋白质醛基反应的官能团，从而实现蛋白质的功能化衍生，因此米氏酸结构在有机合成和本发明中所起的作用明显不同。

而且，由于蛋白质的特殊微环境和空间位阻，其醛基性质和小分子醛基有较大差异，因此有机合成中的醛基反应无法给予蛋白质醛基反应以启示。例如，有机合成中醛基和氨基反应十分迅速并且可以使用催化剂提高反应速率，相反，在蛋白质中醛基和氨基反应非常缓慢并且催化剂没有效果(参见非专利文献：J.Am.Chem.Soc.2011，133，16127-16135)。因此，根据常见的有机合成反应想到本发明的生物大分子(包括蛋白质和多肽)醛基偶联反应存在不可逾越的技术障碍，因而本发明所取得的有益效果是难以从现有技术中预料到的。

特别地，蛋白质偶联物在诸多领域都扮演着关键角色。例如，在生物成像领域中将蛋白质偶联成像分子用于靶向成像和特异性识别；在肿瘤治疗领域中，将抗体分子偶联化疗药物用于肿瘤的靶向杀伤；在生物检测领域中，将蛋白质固载到载体上从而制备成蛋白质芯片，实现高通量、高特异性的目标物检测。当前蛋白质偶联的主要挑战主要是如何在实现蛋白质偶联的同时保证蛋白质的结构和功能不被破坏，并且保证偶联物的均一性和可重现性。传统的蛋白质偶联通常采用蛋白质内源的氨基酸(如赖氨酸和半胱氨酸)的侧链基团作为偶联基团，但是由于这些氨基酸在蛋白质中广泛存在，因此会导致蛋白质的随机偶联造成蛋白质的结构和功能易受影响、偶联物均一性差和重现性差等问题。而醛基在蛋白质中并不常见，通过在蛋白质的特定位置中引入醛基并且将其作为偶联的基团可实现蛋白质的定点偶联。蛋白质的定点偶联可以克服传统蛋白质偶联方法的缺点，从而最小程度上影响蛋白质的结构和功能，并且能够保证偶联物的均一性和可重现性。与本发明形成鲜明对比的是，现有的醛基修饰技术大多采用基于氨基、肼基或氧胺基的亲核试剂作为醛基的偶联试剂，但其具有反应条件剧烈、反应速率慢和产物稳定性低等缺点。对此，本发明开发出如本文所述的新的蛋白质醛基偶联策略。

通过本发明人上述出乎意料的发现，解决了现有技术存在的缺点，例如如上所述，现有蛋白质醛基偶联策略的反应条件剧烈、反应效率低和产物不稳定等技术问题；实现了蛋白质的可控定点修饰，克服了现有技术中的产物不均一、对蛋白质结构和功能影响大以及反应重现性差等技术问题。

基于上述相同原因，本发明人也首次出乎意料地发现使用带有米氏酸结构的载体对蛋白质进行固载的新用途。蛋白质固载的优点是：蛋白质固载能够提高蛋白质的稳定性，有利于蛋白质的分离和回收再利用，或者赋予材料一定的生物功能。常见的实例如：固定化酶、抗体芯片等等。

另外，基于上述相同原因，本发明人也首次出乎意料地发现蛋白醛基偶联方法还可应用于蛋白质修饰化合物(如荧光团、化疗药物、放疗药物、多肽、蛋白、核酸以及亲和标签)中。

下面结合附图进一步详细描述本发明的优选实施方案，但本发明的保护范围并不因此而受任何限制。

醛基偶联反应

如图1所示，根据本发明的一个优选实施方案，带有醛基的蛋白质与米氏酸酰胺衍生物发生偶联反应。特别地，带有醛基的蛋白质与米氏酸酰胺衍生物(其中，R基可为任何功能分子，如荧光团、药物等)在2.5～10.5的pH和-20℃～70℃的温度下进行醛基偶联反应。反应过程中，米氏酸酰胺衍生物的1,3-二氧六环-4,6-二酮的2号环碳原子的周围电子受到环上羰基氧和醚键氧以及环的侧链上酰胺基的吸引而带正电荷，然后该带正电荷的2号环碳原子进攻蛋白质上醛基上的羰基，最终得到蛋白质醛基偶联物

特别地，对于米氏酸酰胺衍生物来说，R为常见的与蛋白质偶联的功能团，包括荧光团、化疗药物、放疗药物等。例如，在荧光团和化疗药的这些结构中，通常都包含烷基、苯环、双键等。另外，与酰胺键直接相连的烷基数量只要≥1即可，优选为1～60和1～30、更优选1～20和最优选1～10的正整数。

事实上，只要具有米氏酸结构母核即可与带有醛基的生物大分子例如蛋白质或多肽发生醛基偶联反应。

而且，该醛基偶联反应的反应条件比较温和，考虑到蛋白质的醛基偶联转化率，反应温度在-20℃～70℃范围内，优选-10℃～60℃和-0℃～50℃、更优选10℃～40℃并且最优选25℃～37℃；pH在2.5～10.5的范围内，优选为3～10和4～9、更优选4～7、更进一步优选6～7并且最优选6.5。相较于其它醛基偶联方法，该反应具有反应条件温和，反应速率快，偶联产物稳定的优点。另外，从蛋白质的醛基偶联转化率的角度来说，时间为2～24小时、优选4～24小时、更优选6～24小时并且最优选12～24小时。

醛基偶联转化率与pH之间的关系

在不同pH下的蛋白质的醛基偶联转化率如图4所示。从图4可以看出，蛋白质的醛基偶联转化率从高到低所对应的pH范围依次为：6～7、5～6、4～5、7～8和8～9。

醛基偶联反应对蛋白质的结构和功能的影响

另外，从图5可以看出，无论是在酸性、中性还是碱性pH条件下，所得蛋白质醛基偶联物都未发生明显水解，这从在不同pH下所得偶联物的实测分子量以及在相同pH下的实测分子量与理论分子量的关系能够得以证实(参见图5A、5B和5C以及图17A、17B和17C)。

另外，可通过圆二色光谱测定带有醛基的蛋白质与米氏酸衍生物的偶联对蛋白质结构和功能的影响。特别地，将蛋白质偶联产物稀释到10mM磷酸盐缓冲液中，最终浓度为0.03mg/ml，并且加入到1mm比色皿中进行圆二色光谱扫描。圆二色测定方法所用仪器是MOS-500圆二色光谱仪(Bio-Logic Science Instrument)；操作参数是光谱扫描波长范围为190nm-250nm，扫描步长为1nm。如图6和图18所示，所得到的圆二色光谱在醛基偶联之前和之后没有发生明显变化，说明带有醛基的蛋白质与米氏酸衍生物的偶联反应未对蛋白质结构产生显著影响。因此，带有醛基的蛋白质与米氏酸衍生物的偶联反应未对蛋白质结构和功能产生不利影响。

蛋白质的固载

本发明中，常见的固载载体包括琼脂糖凝胶、四氧化三铁磁性微球、二氧化硅微球以及金属表面。根据本发明的一个优选的实施方案，本发明采用固相合成方法合成含有米氏酸结构的固载琼脂糖凝胶载体(参见图7，其反应条件典型地是常温常压，pH为6.5)。

特别地，将合成前体、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基亚砜/磷酸盐缓冲液(pH 7.4)1：1溶液中。将此溶液加入到氨基活化的凝胶中，室温翻转混匀。反应完成后，依次用水、1M氯化钠溶液、水清洗凝胶，并且将凝胶储存在20％乙醇溶液中，放置保存待用。

将固载载体用固载缓冲液清洗。将带有醛基的蛋白质溶解于MES缓冲液(pH 6.5)中并且加入到固载载体中。将混合液在室温条件下反转摇匀并且定时取样。通过BCA法测定固定化前后上清液中的蛋白浓度差从而确定固载蛋白量。所测得的不同时间点蛋白质固载量(参见图8)。

通过蛋白质固载，能够提高蛋白质的稳定性，有利于蛋白质的分离和回收再利用，或者赋予材料一定的生物功能。

向蛋白质中的醛基引入

关于带有醛基的蛋白质，其是通过向蛋白质中引入醛基所形成的。向蛋白质中引入醛基的方式很多，包括但不限于通过蛋白质的N端氧化反应或转胺反应得到的醛基、通过酶法得到的蛋白质的醛基标签以及蛋白质中非天然氨基酸所含的醛基。

例如，通过使用甲酰甘氨酸生成酶来产生醛基。具体地，甲酰甘氨酸生成酶将蛋白质中的半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸，从而产生醛基，如下图所示：

由此可知，当蛋白质中成功引入醛基之后，即，不带醛基的蛋白质转化为带有醛基的蛋白质之后，分子量减小了约18。因此，通过测定分子量的减小量是否为约18(例如17～19)，能够证实是否向蛋白质中成功引入了醛基。

如图2A至2C所示，图2A是绿色荧光蛋白的表达纯化电泳图(如下述实施例所述)，用于确定成功制备绿色荧光蛋白。图2B是从分子量的角度进一步确定所制备的绿色荧光蛋白是正确的，其中实测分子量(29765.79)与理论分子量(29766.32)相吻合。而且，通过图2B与图2C的分子量相比较所得的变化量(对于实测分子量的变化量，29765.79-29747.61＝18.18；对于理论分子量的变化量，29766.32-29748.22＝18.1)，来证实已向蛋白质中成功引入醛基。

米氏酸衍生物的制备

如图3所示，根据本发明的一个优选实施方案，在常温常压下，在酰胺缩合剂(例如2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)的存在下，米氏酸与H₂N-R进行缩合反应，得到米氏酸酰胺衍生物

酰胺缩合剂

通常情况下，酰胺化反应比较难发生，需要加入缩合剂来促进反应进行。其反应原理是先活化羧基，然后再与胺反应得到酰胺。

对于酰胺缩合剂，常用的酰胺缩合剂种类有以下四种：(1)活性酯，例如羰基二咪唑(CDI)。(2)碳二亚胺类缩合剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)。(3)鎓盐类缩合剂，从盐的种类来分，主要有两类，即碳鎓盐和磷鎓盐；例如，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/盐(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯/盐(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/盐(HCTU)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯/盐(TSTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐(TNTU)、O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(四氢吡咯基)碳鎓六氟磷酸盐(HAPyU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-二吡咯基脲六氟磷酸酯/盐(HBPYU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)、六甲基磷酰胺(HMPA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)等。(4)有机磷类缩合剂，例如氰代磷酸二乙酯(DECP)、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)等。(5)其它缩合剂，例如三苯基磷-多卤代甲烷、三苯基磷-六氯丙酮、三苯基磷-NBS、3-酰基-2-硫噻唑啉、三(2,6-二甲氧基苯基)铋等。

本发明中，常用的酰胺缩合剂可选自2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N,N,-四甲脲六氟磷酸酯、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，优选2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。

测定方法

(一)电泳测量：

1.按下表1配制15％分离胶。分离胶凝聚完全后，将水倒出，用干净的滤纸吸干残余的水。配制4％浓缩胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。浓缩胶凝聚后，拔出梳子。安装电泳槽，上下槽分别加入适量Tris-甘氨酸电泳缓冲液。避免胶底产生气泡。

表1.分离胶与浓缩胶配方

2.向100μl电泳样品中加入25μl 5×上样缓冲液，沸水浴10min。向电泳胶中每孔加入5μl电泳样品。

3.打开电泳仪，浓缩胶段电压使用92V，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电压提高至120V，待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时结束电泳，关闭电源，取出凝胶。

4.染色与脱色：用双蒸水将电泳后的胶面冲洗干净，倒入染色液(染色液和脱色液配方如下表2所示)，在90℃水浴锅中放置20～30min；之后用双蒸水冲洗干净并倒入脱色液，在平衡脱色摇床上进行脱色，脱色完成后使用凝胶成像系统ChemiDoc XRS+(美国BIORAD公司)进行照相分析。

表2.染色液和脱色液配方

(二)圆二色光谱测量：

将偶联产物通过Amicon 15毫升超滤离心管4500g离心从而将背景溶液置换为10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，蛋白浓度为0.3mg/ml。将300μl蛋白溶液加入到1mm光程比色皿中，放入多功能圆二色光谱仪MOS-500(法国BioLogic Science Instruments公司)中扫描190-250nm之间的圆二色光谱，扫描步长为1nm，狭缝宽度为5nm。使用Biokine与Dicroprot软件联用分析所测得的圆二色光谱比计算出摩尔椭圆率，计算出在不同波长下的摩尔椭圆率并且绘制曲线(例如图6)。通过比较偶联前后曲线的变化可以得到偶联没有对蛋白质的构象造成影响。

(三)摩尔椭圆率的定义以及摩尔椭圆率和圆二色测定之间的关联性：

在实验中测试圆二色谱时得到的原始CD谱数据一般都是以毫度mdeg表示(Y轴)。对于蛋白质来说,文献中通常都使用摩尔椭圆率为纵坐标，单位为deg.cm².dmol-1。摩尔椭圆率相对于原始的mdeg单位考虑到比色皿的光程、蛋白质的浓度和蛋白质的氨基酸残基数量，其计算公式如下：

其中X为圆二色光谱所测得的原始数据，单位是medg，l是光程，c是蛋白质的浓度，m是蛋白质的氨基酸残基总数。摩尔椭圆率就是将所有的实验参数都考虑进去，使得在不同实验条件下得到的数据具有可比性。在实验中的转换是通过Biokine与Dicroprot软件联用实现的。

(四)圆二色光谱和蛋白质结构的关系：

蛋白质的肽键在检测波长为190～250nm之间的区间内有圆二色性,蛋白的圆二色光谱图可以反映蛋白质二级结构的变化。

实施例

下面通过实施例详细描述本发明。但是，本发明并不受这些实施例的限制，本领域技术人员可以在本发明的范围内，对这些实施例进行各种修改、变化和变型。

以下实施例中，除非另外说明，否则所述方法均为常规方法；如无特殊说明，所述材料和试剂都可从商业途径获得。

实施例1：在绿色荧光蛋白中引入醛基

将合成带有醛基标签的绿色荧光蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，生工生物工程(上海)股份有限公司合成)并克隆至pET28a(+)表达载体中，然后转化入大肠杆菌T7Shuffle(DE3)中，并且在Terrific Broth培养基中进行培养和诱导表达。8000×g离心5分钟收集菌体，并且用破碎缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.4，500mM氯化钠，20mM咪唑)重悬菌体。使用高压匀浆破碎仪(AH-NANO，ATS Engineering limited)进行细胞破碎，并且用8000×g离心30分钟收集细胞破碎上清液和细胞碎片。利用金属离子亲和层析柱HisTrap HP5ml(GE Healthcare)进行细胞破碎上清蛋白纯化，将纯化后的FGE使用Ultra-1510K超滤管(Millipore)超滤浓缩至10mg/ml并且换液至磷酸盐缓冲盐溶液(pH 7.4)，并且于-80℃中冻存待用。如图2A所示，通过对诱导表达后的菌体、细胞破碎上清液、细胞碎片以及纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，确定目的蛋白的成功表达。通过高分辨液质联用分析，确定目的蛋白表达正确(实测分子量：29765.79，理论分子量：29766.32，如下表7所示)。

将0.1mM带有醛基标签的绿色荧光蛋白加入到三乙醇胺缓冲液中(50mM三乙醇胺，50mM氯化钠，2mM二硫苏糖醇，0.01mM硫酸铜，pH 9.0)中，并且加入0.01mM甲酰甘氨酸生成酶和在室温条件下孵育24h。反应完成后，使用Ultra-15 10K超滤管(Millipore)将绿色荧光蛋白换液浓缩至磷酸盐缓冲盐溶液(pH 7.4)，并且于-80℃中冻存待用。如图2B和2C、表7所示，通过高分辨液质联用确定醛基的成功引入(实测分子量：29747.61，理论分子量：29748.22)。

SEQ ID NO.1的氨基酸序列：

GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVR GEGEGDATNGKLTLKFICTT GKLPVPWPTLVTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGTYKTRAEVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNFNSHNV YITADKQKNG IKANFKIRHN VEDGSVQLADHYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSVLSKDPNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELYK GGGGSLCTPSR

实施例2：米氏酸衍生物和带有醛基的绿色荧光蛋白的偶联反应

(1)米氏酸衍生物的制备

米氏酸衍生物合成路径如图3所示。将合成前体(99毫克)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(190.12毫克)溶解于2毫升二甲基甲酰胺，加入66.07微升2,4,6-三甲基吡啶并且在室温搅拌15分钟。另外，将带有氨基的化合物H₂N-R(其中R为荧光团)溶解于1毫升二甲基甲酰胺，加入132.15微升2,4,6-三甲基吡啶，将此溶液缓慢加入到反应液中搅拌反应2小时。通过硅胶柱层析和制备液相色谱纯化即获得产物。

(2)米氏酸衍生物和带有醛基的蛋白质的偶联反应

在室温条件下，将0.1mM带有醛基的绿色荧光蛋白溶解于50mM MES缓冲液中，加入1mM米氏酸衍生物并且在不同pH条件下进行反应3小时。采用高分辨液质联用对产物进行分析。如图4所示，米氏酸在近中性条件下(pH 6.5)具有最高的偶联效率(其通过偶联转化率为表示)。绿色荧光蛋白的醛基偶联转化率随着pH变化的关系如表3所示。

表3.关于绿色荧光蛋白的醛基偶联转化率与pH之间的实验数据汇总

从上表3可知，从蛋白质的醛基偶联转化率的角度来说，pH优选为4-9、更优选4-7和最优选6-7，特别是6.5。

将获得的米氏酸衍生物和蛋白质醛基的偶联产物通过超滤换液至酸性(pH 2.8)，中性(pH 7.0)和碱性(pH 10.0)溶液中，在室温条件下孵育48h，并且通过高分辨液质联用确定偶联产物是否发生水解。如图5A、5B和5C所示，醛基偶联产物在酸性，中性和碱性条件下都没有发生明显的水解。

另外，通过圆二色光谱测定醛基和米氏酸衍生物的偶联对蛋白质结构的影响。将偶联蛋白产物稀释到10mM磷酸盐缓冲液中，最终浓度为0.03mg/ml，并且加入到1mm比色皿中进行圆二色光谱扫描。如图6所示，所得到的圆二色光谱在反应前后没有发生明显变化，说明醛基和米氏酸衍生物的偶联没有对蛋白质结构产生显著影响。

另外，将0.1mM带有醛基的绿色荧光蛋白溶解于50mM MES(pH 6.5)缓冲液中，加入1mM米氏酸衍生物并且在不同温度条件下进行反应3小时。采用线性离子阱-高分辨液质联用仪LTQ Orbitrap XL(购自Thermo Scientific科技有限公司)对产物进行分析。绿色荧光蛋白的醛基偶联转化率随着温度变化的关系如表4所示。

表4.关于绿色荧光蛋白的醛基偶联转化率与温度之间的实验数据汇总

从上表4可知，从蛋白质的醛基偶联转化率的角度来说，温度优选为-10℃～60℃和-0℃～50℃、更优选10℃～40℃并且最优选25℃～37℃。

另外，将0.1mM带有醛基的绿色荧光蛋白溶解于50mM MES缓冲液(pH 6.5)中，加入1mM米氏酸衍生物并且在室温条件下进行反应不同时间。采用线性离子阱-高分辨液质联用仪LTQ Orbitrap XL(购自Thermo Scientific科技有限公司)对产物进行分析。绿色荧光蛋白的醛基偶联转化率随着时间变化的关系如表5所示。

表5.关于绿色荧光蛋白的醛基偶联转化率与时间之间的实验数据汇总

从上表5可知，从蛋白质的醛基偶联转化率的角度来说，时间优选为2～24小时、更优选4～24小时和6～24小时并且最优选12～24小时。

实施例3：使用带有米氏酸结构的载体对蛋白质进行固载

如图7所示，采用固相合成方法合成含有米氏酸结构的固载琼脂糖凝胶载体。将25毫克合成前体、0.77毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1.15毫克N-羟基琥珀酰亚胺溶解于2毫升二甲基亚砜/磷酸盐缓冲液(pH 7.4)1:1溶液中。将此溶液加入到1g氨基活化的凝胶中，室温翻转混匀2.5小时。反应完成后，依次用10倍体积的水、1M氯化钠溶液、水清洗凝胶，并且将凝胶储存在20％乙醇溶液中，放置于4℃保存待用。

将0.1g固载载体用10倍体积的固载缓冲液(50mM MES，pH 6.5)清洗。将带有醛基的绿色荧光蛋白(0.2ml，7mg/ml)溶解于MES缓冲液(pH 6.5)中并且加入到固载载体中。将混合液在室温条件下反转摇匀并定时取样。通过BCA法测定固定化前后上清中的蛋白浓度差从而确定固载蛋白量。所测得的不同时间点蛋白质固载量如图8和下表6所示。

表6.在不同时间点的蛋白质固载量的实验数据汇总

从上表6和图8可知，蛋白质固载能够提高蛋白质的稳定性，有利于蛋白质的分离和回收再利用，或者赋予材料一定的生物功能。常见的蛋白质固载例如固定化酶、抗体芯片等。

实施例4：在抗表皮生长因子受体纳米抗体中引入醛基

除了将实施例1中的绿色荧光蛋白替换为抗表皮生长因子受体纳米抗体(蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，生工生物工程(上海)股份有限公司合成)和米氏酸衍生物如图9所示制备之外，其他相应的方法步骤与实施例1相同。通过对诱导表达后的菌体、细胞破碎上清液、细胞碎片以及纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，确定目的蛋白的成功表达。通过高分辨液质联用分析，确定目的蛋白表达正确(实测分子量：18008.34，理论分子量：18008.58，如下表7和图10所示)。另外，通过高分辨液质联用确定醛基的成功引入(实测分子量：17990.99，理论分子量：17990.58，如下表7和图10所示)。

SEQ ID NO.2的氨基酸序列：

AEFQVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQPQPQPQPQPNPTTEHHHHHHGGGGSLCTPSR

实施例5：米氏酸衍生物和带有醛基的抗表皮生长因子受体纳米抗体的偶联以及该抗体偶联物在细胞成像方面的用途

1.偶联：

抗表皮生长因子受体纳米抗体可以靶向表皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞，通过将荧光团偶联到该蛋白上能够实现肿瘤细胞的高效、高特异性识别。本实验中，将带有荧光基团的米氏酸衍生物加入到带有醛基的抗表皮生长因子受体纳米抗体溶液中进行反应，如图9所示。反应条件为：pH 6.5、室温，反应时间为12小时。反应完成后，将反应溶液加入到Amicon 15毫升超滤离心管中，4500g离心换液，将偶联产物置换于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。通过线性离子阱-高分辨液质联用仪LTQ Orbitrap XL(购自Thermo Scientific科技有限公司)测定偶联前后的蛋白质分子量，结果与理论分子量相吻合(偶联前理论分子量：18538.22，实测分子量：18537.74；偶联后理论分子量：18458.33，偶联后实测分子量：18458.99)。

以与实施例2相同的方式，验证上述抗表皮生长因子受体纳米抗体偶联产物在不同pH下的稳定性(如图17所示，图17A的pH为7，图17B的pH为2.8，图17C的pH为10.0；还如下表10所示)。由上可知，在pH为7.4下，抗表皮生长因子受体纳米抗体偶联产物的实测分子量为18458.99，而在pH为7、2.8和pH 10.0下，所述偶联产物的实测分子量分别为18537.68、18537.49和18537.99。因此，抗表皮生长因子受体纳米抗体偶联产物在不同pH下的实测分子量变化无明显变化；同理，所述偶联产物在不同pH下的理论分子量变化也无明显变化。这说明上述抗表皮生长因子受体纳米抗体偶联产物在不同pH下的结构是稳定的，其功能也未受不利影响。

以与实施例2相同的方式，通过圆二色光谱验证上述抗表皮生长因子受体纳米抗体在偶联前后对该抗体结构没有造成影响(如图18所示)。

2.细胞成像：

将数量约5×10⁴的表皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞A431细胞接种于DMEM培养基中(添加1％青霉素和链霉素，以及10％胎牛血清)并且在细胞培养箱中培养过夜。将偶联产物(浓度为1μM)加入到培养基中并且在37℃孵育1小时。之后用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，并且使用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000)在405nm激发波长下进行细胞成像。如图11所示，该偶联产物能够实现表皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞的靶向成像。

实施例6：在抗β2微球蛋白的纳米抗体中引入醛基

除了将实施例1中的绿色荧光蛋白替换为抗β2微球蛋白的纳米抗体(蛋白序列如SEQ ID NO.3所示，生工生物工程(上海)股份有限公司合成)之外，其他方法步骤与实施例1都相同。通过对诱导表达后的菌体、细胞破碎上清液、细胞碎片以及纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，确定目的蛋白的成功表达。通过高分辨液质联用分析，确定目的蛋白表达正确(实测分子量：18458.99，理论分子量：18458.33，如下表7和图13所示)。另外，通过高分辨液质联用确定醛基的成功引入(实测分子量：18439.73，理论分子量：18440.33，如下表7和图13所示)。

SEQ ID NO.3的氨基酸序列：

AQVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTDSRYCMAWFRQAPGKEREWVARINSGRDITYYADSVKGRFTFSQDNAKNTVYLQMDSLEPEDTATYYCATDIPLRCRDIVAKGGDGFRYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQPQPQPQPQPNPTTEHHHHHHGGGGSLCTPSR

实施例7：米氏酸衍生物和带有醛基的抗β2微球蛋白的纳米抗体的偶联以及该抗体偶联物在化疗药物方面的用途

1.偶联：

抗表皮生长因子受体纳米抗体可以靶向表皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞，通过将化疗药物偶联可以实现肿瘤细胞的靶向杀伤。偶联反应如图12所示，其反应过程与实施例5相同。通过线性离子阱-高分辨液质联用仪LTQ Orbitrap XL(购自ThermoScientific科技有限公司)测定偶联前后的蛋白质分子量，结果与理论分子量相吻合(偶联前理论分子量：18538.22，实测分子量：18537.74；偶联后理论分子量：18700.25，偶联后实测分子量：18700.52；如图13所示)。

2.肿瘤细胞杀伤：

将数量约5×10⁴的表皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞A431细胞接种于DMEM培养基中(添加1％青霉素和链霉素，以及10％胎牛血清)并且加入到96孔板中。在培养箱中培养过夜后，在每孔中加入不同浓度(0.02-2.5μM)的偶联物并在培养箱中继续培养过夜。将MTT(噻唑兰)溶解于磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，并且在96孔板中每孔加入200μl。将细胞继续置于培养箱中培养4小时，而后倒掉培养基并加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，并用酶标仪(Bio-Rad microplate reader)测定每孔在570nm处的吸收。细胞存活率由以下公式计算得出：

绘制的细胞存活曲线图如图14所示，该偶联物能够高效地实现表皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞的靶向杀伤。

MTT法测定细胞存活率的检测原理概述如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并且沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

另外，图15显示基于引入醛基后的绿色荧光蛋白、抗表皮生长因子受体纳米抗体和抗β2微球蛋白的纳米抗体分别在偶联荧光团后的蛋白的质谱图；下表8显示基于引入醛基后的绿色荧光蛋白、抗表皮生长因子受体纳米抗体和抗β2微球蛋白的纳米抗体分别在偶联荧光团之前和之后的蛋白的分子量数据汇总；下表9显示基于引入醛基后的绿色荧光蛋白、抗表皮生长因子受体纳米抗体和抗β2微球蛋白的纳米抗体分别在偶联化疗药物之前和之后的蛋白的分子量数据汇总。

表7.绿色荧光蛋白、抗表皮生长因子受体纳米抗体和抗β2微球蛋白的纳米抗体分别在引入醛基之前和之后的蛋白的分子量数据汇总

表8.基于引入醛基后的绿色荧光蛋白、抗表皮生长因子受体纳米抗体和抗β2微球蛋白的纳米抗体分别在偶联荧光团之前和之后的蛋白的分子量数据汇总

表9.基于引入醛基后的绿色荧光蛋白、抗表皮生长因子受体纳米抗体和抗β2微球蛋白的纳米抗体分别在偶联化疗药物之前和之后的蛋白的分子量数据汇总

表10.不同pH条件下抗表皮生长因子受体纳米抗体偶联荧光团产物的稳定性数据

以上通过具体实施例对本发明的优选实施方案进行了详细描述和说明。本领域技术人员应该理解的是，本发明并不限于上述描述的优选实施方案和具体实施例。在不脱离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员能够对本发明的实施方案进行修改、替换或改变，其同样克服了本发明客观存在的技术问题、实现了本发明的目的和有益的技术效果。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种生物大分子偶联物及其制备方法和用途

<130> 2021-08-16

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg

1 5 10 15

Gly Ser His Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro

20 25 30

Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val

35 40 45

Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys

50 55 60

Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val

65 70 75 80

Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His

85 90 95

Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val

100 105 110

Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg

115 120 125

Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu

130 135 140

Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu

145 150 155 160

Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln

165 170 175

Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp

180 185 190

Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly

195 200 205

Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser

210 215 220

Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu

225 230 235 240

Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr

245 250 255

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg

260 265

<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ala Glu Phe Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser

20 25 30

Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg

35 40 45

Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu

115 120 125

Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Cys Thr Pro Ser Arg

165

<210> 3

<211> 168

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Ser Arg

20 25 30

Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

35 40 45

Val Ala Arg Ile Asn Ser Gly Arg Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Thr Asp Ile Pro Leu Arg Cys Arg Asp Ile Val Ala Lys Gly

100 105 110

Gly Asp Gly Phe Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro

130 135 140

Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu His His His His His His Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg

165