阅读说明：本技术 用于nk细胞转导的方法 (Methods for NK cell transduction ) 是由 R·巴里 M·格兰青 W·伦格 N·默克 V·胡珀特 于 2018-12-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了使用假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒将生物材料转移至激活的NK细胞中的体外方法,其包括a)NK细胞的激活,和b)将所述假型化逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒添加至所述激活的NK细胞的步骤,其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白,由此将生物材料转移至所述激活的NK细胞中。优选地,通过将IL-1家族细胞因子添加至NK细胞来进行NK细胞的激活。(The present invention discloses an in vitro method for transferring biological material into activated NK cells using a pseudotyped retroviral vector particle or a virus like particle thereof, comprising a) activation of NK cells, and b) a step of adding said pseudotyped retroviral vector particle or a virus like particle thereof to said activated NK cells, wherein said pseudotyped retroviral vector particle or a virus like particle thereof comprises a modified baboon endogenous retrovirus (BaEV) envelope glycoprotein capable of binding to and fusing with a hematopoietic cell membrane, thereby transferring biological material into said activated NK cells. Preferably, the activation of NK cells is performed by adding IL-1 family cytokines to NK cells.)

用于NK细胞转导的方法

技术领域

本发明总体地涉及将生物材料转移至细胞中的领域，特别是涉及将生物材料转移至激活的自然杀伤(NK)细胞中。

背景技术

自然杀伤细胞(下文也缩写为“NK细胞”)是能够检测并破坏病毒感染的细胞和恶性退化的细胞(也称为肿瘤细胞)的独特淋巴细胞群体。另外，NK细胞在接触肿瘤细胞时产生和分泌细胞因子。这些功能特征使得NK细胞成为有吸引力的用于治疗癌症的药物。临床试验强调了NK细胞的临床使用的潜能(Miller等，2005；Rubnitz等，2010；Childs&Berg2013)。

为患者使用供体NK细胞(“同种异体使用”)需要细胞分离方法以将所需的NK细胞效应与不需要的、反向指示的非NK细胞(例如T细胞)的效应分开。这些方法已经很成熟(Leung 2014)，并且可以在封闭的无菌系统中自动化进行(Apel等，2013)。

遗传操纵是一种有前景的策略以进一步改进涉及多种临床意义(例如在癌症治疗中)的NK细胞特性(Childs&Carlsten，2015年)。例如，表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞的使用是有前途的用于癌症的治疗选择，如使用CAR T细胞的临床试验中所证明的。CAR NK细胞可以是CAR T细胞的良好替代品，然而，原代NK细胞的遗传操纵代表了一项重大的技术挑战(Klingemann 2014)。

转染方法，如电穿孔，导致有效的转基因递送，但转基因表达是瞬时的。因此，在需要持久作用时，NK细胞的转染不能用于临床应用。此外，转染导致高的细胞死亡率，这代表了另一个主要缺点。

另一方面，基于病毒载体的NK细胞转导是持久性遗传修饰的一种选择。NK细胞的逆转录病毒转导是可能的，但需要高的病毒滴度，而效率仍然很低(Suerth等，2015)。甚至更重要的是，由于逆转录病毒载体的插入诱变，逆转录病毒途径的临床使用是涉及临床研究中揭示的遗传毒性作用的关键安全问题(Aiuti&Roncarolo 2009；Aiuti等，2009)。

然而，在逆转录病毒载体的组内，慢病毒载体的遗传毒性较小，且代表了用于临床应用的更安全选择(Montini等，2009；Papayannakos和Daniel，2013)。不幸的是，即使在用不同的细胞因子组合刺激后并使用高的慢病毒载体滴度，也只能转导约10％的NK细胞，这可以通过NK细胞的抗病毒防御机制来解释(Sutlu等，2012)。使用高的慢病毒载体滴度以及硫酸鱼精蛋白和BX795(TBK1/IKKe复合物的抑制剂)，可以将这种转导效率提高至约40％(Sutlu等，2012)。然而，TBK1是有丝分裂必不可少的，且一般已知BX795引起细胞周期停滞，从而导致非增殖细胞(Pillai等，2015；Bai等，2015)。因此，关键的和不希望有的副作用使BX795不适合用于临床NK细胞转导，其中迫切需要稳定的转导和适当的NK细胞功能性，包括稳健的细胞增殖。

在WO2013/045639A1中，公开了使用用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒载体转导静止HSC以及静息T和B细胞的方法。

总之，可以临床上应用于治疗的NK细胞的有效和持久的遗传修饰的方法和/或病毒载体颗粒系统代表了当前技术无法满足的迫切需求。

发明内容

令人惊讶地，据发现在激活后，通过使用逆转录病毒载体颗粒，如本文公开的用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体颗粒，可以有效地转导原代人NK细胞，甚至不需要NK细胞抗-病毒防御机制的抑制剂，而静息NK细胞不能被这些载体颗粒有效地转导。转导甚至在低逆转录病毒载体颗粒滴度(如慢病毒载体颗粒滴度)下也是可检测的，并且可以达到90％以上，这是使用迄今为止报道的其他病毒载体颗粒未看到的。与现有技术的方法相比，使用低载体颗粒滴度导致更好的实用性。例如，本文公开的具有修饰的狒狒包膜蛋白的慢病毒载体颗粒具有比具有VSV-G包膜蛋白的载体颗粒高得多的转导效率(高7-10倍)。本文公开的转导方法不会触发细胞死亡或显示出对转导的NK细胞的其他毒性作用。此外，该方法不影响NK细胞有丝分裂，因此转导的NK细胞长期是高度增殖性的，其水平与未转导的对应物相同。综上，所使用的假型化逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)不存在不希望的副作用及其临床顺应性特性使得本文公开的方法对于用于治疗应用的NK细胞的稳定遗传修饰是独特的。

出乎预料地，人类NK细胞的激活和本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的逆转录病毒载体颗粒的使用导致高频率的转导NK细胞。优选地，通过可溶性形式或表面结合的刺激剂或者通过饲养细胞(包括饲养细胞的部分，如膜颗粒)来激活NK细胞。更优选地，NK细胞通过至少一种生长因子如细胞因子，或生长因子如细胞因子的组合，例如，共同-γ链细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或IL-1家族细胞因子(包括但不限于IL-1α、IL1β、IL-18、IL-33、IL-36、IL37和IL38)来激活。甚至更令人惊讶地，可以通过将不同的细胞因子与IL-1家族细胞因子组合在一起来进一步提高转导效率，例如，将IL-2和/或IL-15与IL-1家族细胞因子(如IL-18、IL-33或IL-1β)组合在一起。将IL-1家族细胞因子(如IL-18、IL-33或IL-1β)添加至其他公知的激活NK细胞的细胞因子导致NK细胞的短期激活，从而允许比使用现有技术的NK激活方法更早地有效转导NK细胞，即，在不存在IL-1家族细胞因子的情况下。这是令人惊讶的发现：在本文公开的条件下，用本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒载体颗粒转导的激活NK细胞的百分比不仅非常高，而且还保持稳定几周而不减少转基因表达。转基因表达的持续时间可以在例如2、4、6、8或更多周内维持。生物材料也可以通过本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒样颗粒而不是病毒载体颗粒转移至激活的NK细胞中。

甚至更令人惊讶地，在激活和转导这些NK细胞之前从包含CX3CR1阴性和CX3CR1阳性NK细胞的样品富集CX3CR1阴性NK细胞导致了使用如本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化病毒载体颗粒的优异的增殖和转导。可以通过从包含CX3CR1阳性和CX3CR1阳性细胞的样品或NK细胞群体分离CX3CR1阳性和CX3CR1阴性细胞来实现CX3CR1阴性NK细胞的富集。

也可以完全作为自动化过程，优选在GMP条件下的封闭系统中，来实施本文公开的激活NK细胞的转导方法。

附图说明

图1：BaEV假型化载体允许高的NK细胞转导，如通过GFP表达所证明的，但NK细胞需要被激活。

图2A：实验中使用的CD3⁺T细胞和CD3^-/CD56⁺NK细胞从PBMC分离，从而产生高度纯化的细胞群体。

图2B：用VSV-G假型化慢病毒载体进行T细胞转导是有效的，而其甚至在高滴度下对于NK细胞是非常无效的。

图2C：用VSV-G假型化慢病毒载体转导NK-92细胞系与原代NK细胞相似地是无效的，但令人惊讶地，NK-92用BaEV假型化载体可以有效地转导。

图2D：用狒狒包膜假型化慢病毒载体可以非常有效地转导T细胞和激活的原代NK细胞两者。

图3A：令人惊讶地，用IL-33短期激活NK细胞允许比在IL-33的情况下使用BaEV假型化载体具有更高的NK细胞转导率。

图3B：与BaEV假型化载体相似，用IL-33的短期激活NK细胞提高了NK细胞的转导率，甚至在使用VSV-G假型化的慢病毒载体时。

图4：以与IL-33相似的方式，用IL-18激活NK细胞提高了NK细胞的转导率。

图5：用BaEV假型化载体转导的激活NK细胞显示出与未转导的NK细胞相同的扩增速率，证明了转导本身不诱导细胞死亡且不影响细胞增殖。

图6：用BaEV假型化载体转导NK细胞后的转基因表达是长期稳定的。

图7A：NK细胞的激活和BaEV假型化的使用允许非常高的转导率，这使得有可能产生具有高CAR表达的NK细胞。

图7B：不同的靶细胞显示出对于表面标志物CD19的不同表达谱，使其成为用于表达CD19-CAR的NK细胞的功能性测试的合适靶标。

图7C：转导方法允许产生表达CD19-CAR的NK细胞，其具有通过K562细胞的杀灭证明的未改变的高细胞毒性潜能，和通过CD19阳性RS4；11和Raji细胞的杀灭证明的显著提高的CD19-特异性细胞毒性活性。

图8：天然的以及激活的NK细胞进行western印迹以检查狒狒包膜受体ASCT2的表达。激活的而不是天然的NK细胞表达用于狒狒包膜ASCT2的受体。

图9A：细胞增殖和转导试验显示出仅增殖性的而非静止的NK细胞是狒狒假型化慢病毒载体可转导的。

图9B：NK细胞的增殖性和可转导的子集是CD56^亮。相反，非增殖性和非可转导的NK细胞是CD56^暗。

图10：增殖的和转导的、增殖性但非转导的及静止的NK细胞子集之间几种NK细胞受体的比较显示出静止的NK细胞与增殖性NK细胞相比显著不同的表型。增殖性细胞是更高CD56亮(bright)的，具有较低CD16表达、较高激活受体NKp30、NKp44和NKG2D表达以及较高TRAIL和NKG2A表达的趋势。

图11A-B：NK细胞的增殖和静止子集的细胞表面蛋白的标志物筛选。将来自5个供体的NK细胞用于通过流式细胞术分析371个表面标志物。与静止NK细胞的直接比较，增殖性和GFP阳性NK细胞以较高水平表达32个标志物和以较低水平表达5个标志物(图11A)。对于增殖性和可转导NK细胞子集的最明显标志物是不存在CX3CR1表达和高频率的强烈表达TRAIL的细胞(图11A和11B)。

图12A：在转导和培养之前，使用MACS分选基于CX3CR1表达来分离不同的NK细胞子集。在没有分选的情况下，来自供体的血液来源NK细胞中CX3CR1的表达为86％，且CX3CR1^negNK细胞是14％。分选后，CX3CR1^neg NK细胞的平均频率通过对于CX3CR1富集降至2％，而另一方面，标志物的耗尽导致91％CX3CR1^neg NK细胞群体的富集。

图12B：在差异分选的NK细胞级分培养后不久，我们观察到了显著的增殖差异。在未分选的、CX3CR1富集(CX3CR1阳性)和CX3CR1耗尽(CX3CR1阴性)的NK细胞子集中，NK细胞增殖的百分比分别为28、11和81。

图12C：NK细胞的CX3CR1^neg级分是高度可转导的。在分选的NK细胞级分转导后2天，未分选的、CX3CR1^富集和CX3CR1^耗尽NK细胞子集的转导率分别为21％、7％和69％。

图13：使用BaEV-假型化慢病毒载体和IL-1β的NK细胞的慢病毒转导后十天嵌合抗原受体(CAR)的表达。

具体实施方式

在一个方面中，本发明提供了使用假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒将生物材料转移至激活的NK细胞中的体外方法，所述方法包括步骤：

a)NK细胞的激活，和

b)将所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒添加至所述激活的NK细胞，

其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白，由此将生物材料转移至所述激活的NK细胞中。

所述方法，其中所述NK细胞是人NK细胞。

所述方法，其中待激活的所述NK细胞处于包含NK细胞的样品中，例如，全血样品或外周血单核细胞(PBMC)样品(例如，其可以获自棕黄层)。

所述方法，其中在所述NK细胞的激活前，NK细胞可以从包含CX3CR1阳性和CX3CR1阴性NK细胞的群体或样品针对CX3CR1阴性NK细胞进行富集。

可以通过在分离过程中从包含CX3CR1阳性和CX3CR1阴性NK细胞的群体或样品耗尽CX3CR1阴性细胞来进行所述CX3CR1阴性NK细胞或CX3CR1阴性NK细胞子集/亚群的富集，其中耗尽的部分是包含CX3CR1阴性细胞的目标部分，例如，通过分离方法来分离，如细胞分离方法，例如，(Miltenyi Biotec GmbH)，或者荧光激活细胞分选，如使用抗CX3CR1抗体或其片段的流式细胞术。

CX3CR1阴性NK细胞亚群(或CX3CR1阴性NK细胞)优先用如本文公开的方法转导，因为其实现了非常高的转导率(参见实施例9)。

所述方法，其中步骤a)中待激活的所述NK细胞是CX3CR1阴性NK细胞。优选地，所述CX3CR1阴性NK细胞包含低于20％，15％，10％，5％或1％的在包含用于在本文公开的方法内激活的NK细胞的组合物中的CX3CR1阳性细胞。

包含能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒是本领域公知的并且例如公开于WO2013/045639A1中。

所述假型化逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒，其中所述能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白可以是：

嵌合包膜糖蛋白，其包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体或由其组成；或修饰的BaEV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒可以至少包含：嵌合包膜糖蛋白，其包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体或由其组成；或修饰的BaEV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。

所述方法，其中可以通过对所述NK细胞添加至少一种细胞因子或饲养细胞或饲养细胞的膜颗粒或使用NK细胞激活试剂来实现所述NK细胞的所述激活。通常，2-3天后，NK细胞激活的作用导致NK细胞增殖。

所述方法，其中所述至少一种细胞因子选自共同-γ链细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或IL-1家族细胞因子，包括但不限于IL-1a(IL-1α)、IL-1b(IL-1β)、IL-18、IL-33、IL-36、IL37和IL38。

所述至少一种细胞因子可以是IL-2。

所述至少一种细胞因子可以是IL-15。

所述细胞因子可以是IL-2和IL15。

所述方法，其中激活NK细胞的细胞因子或细胞因子的组合(如IL-2和/或IL-15)与IL-1家族细胞因子组合，由此导致与没有IL-1家族细胞因子的情况下的激活相比，所述NK细胞的更早激活(“短期激活”)。

所述方法，其中所述NK细胞的激活通过添加细胞因子的组合来实现，所述细胞因子组合包含至少一种激活NK细胞的细胞因子和IL-1家族细胞因子，由此导致NK细胞的短期激活。

所述方法，其中所述细胞因子的组合是IL-2和/或IL-15和IL-1家族细胞因子。一种或多种激活NK细胞的细胞因子(如IL-2和/或IL-15)与IL-1家族细胞因子(如IL-18或IL-33)一起使用导致短期激活，其缩短了例如用于NK细胞激活的培养过程的开始和允许使用本文公开的逆转录病毒载体颗粒有效转导激活的NK细胞的起始点之间的时间段。令人惊讶地，IL-1家族细胞因子与一种或多种激活NK细胞的细胞因子(如IL-2和/或IL-15)的组合以及用本文公开的逆转录病毒颗粒的转导导致与逆转录病毒颗粒转导到在较长过程(即，没有得益于由IL-1家族细胞因子(如IL-8、IL-33或IL-1β)的存在诱导的短期激活过程)中激活的NK细胞中相比更高的转导率。

所述IL-1家族细胞因子可以选自IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-36Ra、IL-36α、IL37、IL-36β、IL-36γ、IL38和IL-33。

优选地，所述IL-1家族细胞因子可以是IL-18、IL-33或IL-1β。

所述方法，其中所述IL-1家族细胞因子是IL-18，由此导致在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时(1天)、28小时、36小时、42小时或48小时(2天)内的短期激活。

所述方法，其中所述IL-1家族细胞因子是IL-33，由此导致在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时(1天)、28小时、36小时、42小时或48小时(2天)内的短期激活。

例如，在细胞培养系统开始时将IL-1家族细胞因子(如IL-18、IL-33或IL-1β)与已知激活NK细胞的其他细胞因子一起加入包含NK细胞的培养基中导致在添加所述IL-1家族细胞因子后所述NK细胞早至1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时(1天)、28小时、36小时、42小时或48小时(2天)的激活。因此，将IL-1家族细胞因子添加至NK细胞，优选在细胞培养基中，导致在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时(1天)、28小时、36小时、42小时或48小时(2天)内的NK细胞短期激活。

可以将上述细胞因子以本领域技术人员公知的且常用的浓度给予包含所述NK细胞的细胞培养基。

所述方法，其中所述NK细胞的所述激活可以通过对所述NK细胞添加一种IL-1家族细胞因子而没有其他细胞因子或者饲养细胞或者饲养细胞的膜颗粒或者用NK细胞激活试剂来实现。

所述方法，其中所述NK细胞的所述激活可以通过对所述NK细胞添加一种IL-1细胞因子以及饲养细胞或饲养细胞的膜颗粒或使用NK细胞激活试剂来实现。

所述方法，其中通过所述假型化逆转录病毒颗粒的NK细胞的转导效率为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

所述方法，其中如果所述NK细胞用所述逆转录病毒载体转导，所述生物材料是一个或多个核酸。

所述方法，其中所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒是慢病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

所述方法，其中所述方法在封闭系统中以自动化过程进行。

在另一个方面，本发明提供了一种用于通过将生物材料体内转移至激活的NK细胞中来治疗患有病症的人的假型化逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含能够与造血细胞膜结合并融合的本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白，由此将生物材料转移至所述激活的NK细胞中。

所述病症可以是用所述NK细胞可以治疗或可治疗的病病。

在再一个方面，本发明提供了用于通过将生物材料体内转移至激活的NK细胞中来治疗患有病症的人的组合物的组合，所述组合包含

a)包含至少一种激活NK细胞的细胞因子的第一组合物，和

b)包含假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的组合物，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含本文公开的能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白。

所述病症可以是用所述NK细胞可以治疗或可治疗的病症。

所述组合物的组合，其中所述第一组合物包含细胞因子的组合，其包含至少一种激活NK细胞的细胞因子和IL-1家族细胞因子。

所述组合物的组合，其中所述细胞因子的组合包含IL-2和/或IL-5和IL-1家族细胞因子。

所述组合物的组合，其中所述IL-1家族细胞因子是IL-18、IL-33或IL-1β。

所述组合物的组合，用于制备工程化的NK细胞。

所述组合物的组合，其中所述生物材料是编码嵌合抗原受体的核酸。

在另一个方面，本发明提供了假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒用于将生物材料转移至激活的NK细胞中的用途，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含如本文公开的能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒用于制备工程化NK细胞的用途。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的用途，其中所述生物材料是编码嵌合抗原受体的核酸。

在再一个方面，本发明提供了通过本文公开的方法可获得的转导的和/或工程化的NK细胞。

所述工程化的NK细胞，其中所述NK细胞工程化以表达嵌合抗原受体。

在一个方面，本发明提供了通过本文公开的方法获得的工程化NK细胞的药物组合物。

所述药物组合物，其中所述工程化NK细胞表达嵌合抗原受体。

在另一个方面，本发明提供了用于NK细胞的短期激活的细胞因子的组合，其包含至少一种激活NK细胞的细胞因子和IL-1家族细胞因子。

所述细胞因子的组合可以是IL2和/或IL-15和IL-1家族细胞因子。

所述IL-1家族细胞因子可以是IL-18、IL-33或IL-1β。

本文中关于本发明的一个方面(例如，本发明的第一方面)限定的所有定义、特征和实施方式在作出必要修正的情况下也适用于本文公开的本发明的其他方面的情况。

定义

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

逆转录病毒科是具有逆转录成DNA中间体的单链、二倍体、正义RNA基因组的病毒科，所述DNA中间体随后被整合至宿主细胞基因组中。逆转录病毒科来源的病毒是具有80-120nm直径的包膜的颗粒。

(逆转录-/慢-/γ逆转录-)病毒载体是源自相应病毒家族的复制缺陷型病毒颗粒。它们含有Gag和Pol蛋白、单链RNA基因组并且通常用源自其他病毒的异源包膜蛋白假型化，例如，用本文公开的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化。所述病毒载体的RNA基因组不含任何病毒基因来产生病毒后代，但含有有效包装以及DNA中逆转录需要的psi元件和LTR。DNA中间体可以含有在合适启动子(例如，CMV启动子)控制下的目标基因，并且目标基因在所述DNA整合至宿主细胞的基因组中时表达。进入宿主细胞、递送RNA基因组、目标基因的整合和表达的过程称为转导。基于γ逆转录病毒或慢病毒的病毒载体的最小需求已经在本领域有充分描述。

此外，已经研发了整合酶缺陷型逆转录病毒载体(ID-RV)，其不能在宿主细胞基因组中整合逆转录病毒载体基因组。ID-RV源自常规逆转录病毒载体，但不含逆转录病毒整合酶或含有突变形式的逆转录病毒整合酶。进入宿主细胞中时，逆转录病毒载体基因组在胞质中逆转录，递送至核中，但不稳定地整合至宿主细胞基因组中。ID-RV是瞬时表达目标基因的有用工具。逆转录病毒载体和转导的定义还延伸至整合缺陷型逆转录病毒载体及其应用。

慢病毒是在人和其他哺乳动物物种中引起慢性和致死的疾病(其特征在于长的潜伏期)的逆转录病毒科的属。最出名的慢病毒是人免疫缺陷病毒HIV，其可以有效地感染未分裂的细胞，因此慢病毒衍生的逆转录病毒载体是最有效的基因递送方法之一。

γ逆转录病毒科是逆转录病毒科的属。代表性的种是鼠白血病病毒和猫白血病病毒。

病毒样颗粒(VLP)类似于病毒颗粒，但不感染或转导，因为它们不包含编码病毒样颗粒的蛋白质的病毒遗传物质。特别地，逆转录病毒载体情况中的VLP不包含psi阳性核酸分子。一些病毒样颗粒可以含有不同于它们的基因组的核酸。病毒结构蛋白(如包膜或衣壳)的表达可以导致病毒样颗粒(VLP)的组装。与逆转录病毒载体一样，VLP也可以使用与用于逆转录病毒载体的相同包膜构建体假型化。VLP可以用于递送蛋白质，可以将核酸递送至靶细胞的细胞质。特别地，VLP可用作疫苗。

本文使用的术语“VLP摄入”是指VLP结合于靶细胞膜，由此将核酸分子、蛋白质或肽释放至靶细胞中。

本文使用的术语“激活”是指用提高靶细胞功能、增殖和/或分化的细胞诱导生理变化。

本文使用的术语“假型化”或“假型化的”是指带有源自具有包膜的其他病毒的包膜糖蛋白的载体颗粒。本发明的慢病毒载体或载体颗粒的宿主范围因此可以根据糖蛋白使用的细胞表面受体的类型而扩展或改变。

为了产生逆转录病毒载体组配载体颗粒需要的gag、pol和env蛋白通过包装细胞系，例如HEK-193T，反式提供。这通常通过用一个或多个含有gag、pol和env基因的质粒转染包装细胞系来完成。对于假型化载体的产生，env基因(其最初源自与gag和pol基因以及与RNA分子或表达载体相同的逆转录病毒)交换为不同包膜病毒的包膜蛋白。

狒狒内源性逆转录病毒或BaEV是以多个前病毒拷贝存在于狒狒DNA中的C型逆转录病毒。在WO2013045639A1中，详细描述了野生型BaEV包膜糖蛋白(非修饰的BaEV包膜糖蛋白)和具有限定突变(修饰)的BaEV包膜糖蛋白，其以高于野生型BaEV糖蛋白的水平整合在慢病毒表面上。

本文使用的术语“BaEV包膜糖蛋白”是指野生型形式的BaEV包膜糖蛋白或所述野生型BaEV包膜糖蛋白的突变体，其与所述野生型BaEV包膜糖蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同，条件是所述突变糖蛋白保留野生型糖蛋白与造血细胞膜结合并融合的能力。

优选地，野生型BaEV包膜糖蛋白由序列SEQ ID NO:1组成。如本领域技术人员已知的，BaEV包膜糖蛋白由胞质尾结构域、跨膜结构域和胞外结构域构成。包膜糖蛋白序列中对应于胞质尾结构域、跨膜结构域和胞外结构域的区域可以由技术人员容易地确定。通常，胞质尾结构域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸530至564之间。通常，跨膜结构域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸507至529之间。通常，胞外结构域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸1至506之间。

在本发明的特定实施方式中，BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。

在本发明的情况中，表述“融合抑制性R肽”是指包膜糖蛋白的胞质尾结构域的C-末端部分，其带有酪氨酸内吞信号-YXXL-(SEQ ID NO:2)并且其在病毒粒成熟过程中被病毒蛋白酶切割，因此增强包膜糖蛋白的膜融合。BaEV包膜糖蛋白的融合抑制性R肽通常位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸547至564之间。

因此，在特别优选的实施方式中，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽的修饰BaEV包膜糖蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或由其组成。

在另一个特定实施方式中，BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域被鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域替代。

鼠白血病病毒包膜糖蛋白优选是4070A株的包膜糖蛋白。

在本发明的情况中，术语“MLV包膜糖蛋白”是指野生型形式的MLV包膜糖蛋白或所述野生型MLV包膜糖蛋白的突变体，其与所述野生型MLV包膜糖蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％相同，条件是所述突变糖蛋白保留野生型包膜糖蛋白与病毒核心蛋白(特别是与慢病毒核心蛋白)相互作用的能力。

包膜糖蛋白序列中对应于胞质尾结构域的区域可以由技术人员容易地确定。通常，MLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域位于野生型MLV包膜糖蛋白的氨基酸622和654之间。

因此，在特别优选的实施方式中，包含BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与MLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体或由其组成的嵌合包膜糖蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。

如本文预期的，表述“生物材料”是指一种或多种易于改变细胞的结构和/或功能的化合物。在本发明的情况中，优选的是生物材料是一个或多个核酸，其在慢病毒载体颗粒的情况中可以包含在载体颗粒的基因组内。

如本文预期的，“转移”是指在与靶细胞结合时，载体颗粒或载体样颗粒最初将生物材料递送至靶细胞的膜或细胞质的能力。在本文中，靶细胞通常是NK细胞。

本文使用的术语“自然杀伤细胞(NK细胞)”通常是人NK细胞，并且定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)和构成从共同淋巴祖细胞分化的第三类细胞-产生B和T淋巴细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，它们随后在此处进入循环中。NK细胞在表型上、按照起源和按照相应的效应子功能不同于自然杀伤T细胞(NKT)；通常，NKT细胞活性通过分泌IFNγ促进NK细胞活性。与NKT细胞相反，NK细胞不表达T细胞抗原受体(TCR)或泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B细胞受体，但它们通常在人类中表达表面标志物CD16(FcγRIII)和CD56，在C57BL/6小鼠中表达NK1.1或NK1.2。高达80％的人类NK细胞也表达CD8。可以从癌症患者建立持续生长的NK细胞系，并且常见的NK细胞系例如是NK-92、NKL和YTS。

术语“滴度”或“转导效率”用作就载体颗粒转导其靶细胞的能力表征和比较载体颗粒的手段。因此，具有“提高的滴度”或“提高的转导效率”的载体颗粒能够在给定的载体颗粒量下与具有相同量的其他载体颗粒相比转导更高数量的细胞。

本文使用的术语“激活的NK细胞”是指细胞通过刺激条件而与天然的、新鲜分离的、未激活的NK细胞相比的变化，从而其本身呈现改变的基因表达谱或改变的细胞信号传导，导致与未激活的NK细胞相比具有不同的细胞特性的NK细胞。“激活的NK细胞”可以例如提高某些表面受体(如NKp44、NKG2D、DNAM-1或TRAIL)的表达，或改变细胞因子受体的表达，例如上调CD25。激活的NK细胞可以将其细胞周期阶段从G0期的静止细胞的变化到G1、S或G2期，或可以开始增殖或更快地增殖。

术语“CX3CR1阴性NK细胞”或“CX3CR1^neg NK细胞”或“CX3CR1^-NK细胞”或“CX3CR1耗尽的NK细胞”或“CX3CR1^耗尽NK细胞”是指在其细胞表面上不表达标志物CX3CR1的NK细胞群体。

CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)，也称为fractalkine受体或G-蛋白偶联受体13(GRP13)，是人类中由CX3CR1基因编码的蛋白质。顾名思义，这种受体结合趋化因子CX3CL1(也称为神经趋化蛋白(neurotactin)或fractalkine)。

本文使用的术语“短期激活”是指通过将Il-1家族细胞因子例如添加至包含待激活的NK细胞的细胞培养基而与使用例如已知激活NK细胞的不同细胞因子但没有IL-1家族细胞因子的标准NK细胞激活相比更快地激活NK细胞的可能性。在IL-1家族存在下，在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时(1天)、28小时、36小时、42小时或48小时(2天)后已经发生NK细胞激活。

术语“NK细胞激活试剂”是指已经偶联一种或多种对NK细胞提供激活信号的刺激剂(如针对CD2和CD335的刺激抗体)的分子如颗粒、珠子或纳米基质。这样的NK细胞激活试剂的实例是Miltenyi Biotec的NK细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach，德国，订购编号no.130-094-483)或EP2824112B1中所描述的纳米基质。

白细胞介素-1家族(IL-1家族)是11种细胞因子的组，其在调节对感染或无菌侵害的免疫和炎性反应中起着重要作用。

所述IL-1家族细胞因子是IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-36Ra、IL-36α、IL-37、IL-36β、IL-36γ、IL-38和IL-33。如本文公开的，将IL-1家族细胞因子添加至使用例如其他细胞因子的标准(现有技术)NK细胞激活过程中加速了NK细胞激活，从而导致NK细胞的短期激活。

IL-1家族细胞因子还可以是其变体，其具有一些删除、添加或置换的氨基酸而同时仍然保留细胞因子的功能。因此，这个定义中包括在氨基酸序列水平上具有至少70％，或至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的野生型细胞因子氨基酸序列的变体。在本发明的情况中，可以使用本领域公知的用于氨基酸序列的比对程序采用成对比对来测定“序列同一性”。

IL-1家族细胞因子也可以是在氨基酸序列水平上与所述全长细胞因子(“Il-1家族细胞因子或其功能片段”)的对应部分具有至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的序列同一性的全长细胞因子的功能性片段。

通常，所有氨基酸变异(即，Il-1家族细胞因子的氨基酸的置换、添加或消除)包括在这个定义下，其不导致本文公开的IL-1家族细胞因子的特性的损失。

本文所述的术语“表达”定义为在细胞中由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“饲养细胞”是指添加至靶细胞(即，此处的自然杀伤细胞)培养物中以支持其存活和/或生长的细胞。饲养细胞提供完整和功能性的细胞外基质和基质相关的因子，并且将已知和未知的细胞因子分泌至条件培养基中。饲养细胞通常是生长停滞的以防止其在培养物中增殖，但维持其存活。生长停滞可以通过有效剂量的辐照或用有效剂量的化学物质(如丝裂霉素C)处理来实现。存在几种饲养细胞，包括辐照的外周血单核细胞(下文也缩写为“PBMC”)、耗尽NK细胞的PBMC、癌细胞系、遗传工程化的癌细胞系和通过自然感染Epstein-Barr病毒(在下文也缩写为“EBV”)而永生化的淋巴细胞。

如本文所用的，术语“培养”包括提供NK细胞维持所需的化学和物理条件(例如温度，气体)，以及生长因子。通常，培养NK细胞包括为NK细胞提供扩增(增殖)的条件。可以支持NK细胞扩增的化学条件的实例包括但不限于缓冲剂、血清、营养素、维生素、抗生素、细胞因子和其他生长因子，其常规地提供于(或可以手动给予到)适合于NK细胞扩增的细胞培养基中。在一个实施方式中，NK细胞培养基包括补充有5％人血清AB型(Life Technologies)，500U/mL IL-2(Miltenyi)和10ng/mL IL-15(Miltenyi)的NK MACS Research培养基(Miltenyi Biotec GmbH)。适用于扩增NK细胞的其他培养基是本领域公知的。

如本文使用的，术语“细胞培养基”包括提供NK细胞维持所需的化学条件的液体。可以支持NK细胞扩增的化学条件的实例包括但不限于溶液、缓冲剂、血清、血清组分、营养素、维生素、细胞因子和常规地提供于(或可以手动给予到)细胞培养基中的其他生长因子。如本领域已知的适用于培养NK细胞的培养基包括NK MACS(Miltenyi)、TexMACS(Miltenyi)、CellGro SCGM(CellGenix)、X-Vivo 10、X-Vivo 15、BINKIT NK Cell InitialMedium(Cosmo Bio USA)、AIM-V(Invitrogen)、DMEM/F12、NK Cell Culture Medium(upcyte technologies)。如本文使用的术语“IL-2”和“IL-15”是指细胞因子白细胞介素-2和白细胞介素-15及其衍生物，例如，IL-2superkine、IL-2白喉毒素融合蛋白或IL-15Rαsushi。

术语IL-2和/或IL-15一般是指与IL2和IL15的杂三聚受体结合的细胞因子4α-螺旋束家族的成员，其共有共同的γ链和IL2/IL15Rβ(也称为IL2Rβ，CD122)。

如本文使用的，术语“(重复地)添加有效浓度的IL-2和/或IL-15”是指所述细胞培养基中1U/mL至5000U/mL，优选10U/mL至1000U/mL，更优选50至500U/mL的IL-2浓度，和/或是指所述细胞培养基中0.1至1000ng/mL，优选1至200ng/mL，更优选10至100ng/mL的IL-5浓度。通常，IL-2和/或IL-15的浓度在培养过程中随时间降低，因此IL-2和/或IL-15可以重复地添加至细胞培养基中以将细胞因子的水平维持在有效浓度。常规地，可以通过细胞培养基更换将IL-2和/或IL-15再次添加至细胞培养物中。在这一情况中，“重复地”是指在整个培养过程中至少一个重复。不是必需在培养过程开始时添加IL-2和/或IL-15，但至少在第一次培养基更换时添加，即，在7天后。但尽管如此，在培养过程开始时添加IL2和/或IL-15是有利的。

如本文使用的，术语“扩增”或“增殖”是指细胞生长和细胞数量的倍增。如本文使用的，扩增或增殖涉及培养过程中发生的NK细胞的数量增加。

如本文使用的，术语“培养过程”或“培养”是指NK细胞的培养和扩增，其中培养过程(即NK细胞扩增)的开始日(开始点)定义为第0天。培养过程可以根据操作者的需要持续尽可能长的时间，并且只要细胞培养基具有允许细胞存活和/或生长和/或增殖的条件，可以进行培养过程。

如本文所用，术语“培养过程的开始”是指通过向细胞培养基添加生长因子(如IL-2和/或IL-15)来开始扩增过程，即，启动细胞以开始其增殖过程。IL-1家族细胞因子(如IL-18或IL-33)的添加加速NK细胞的激活过程，并为有效转导做准备，因此IL-1家族细胞因子应与其他公知的激活NK细胞的细胞因子一起给予培养基。优选地，有效浓度的IL-1家族细胞因子只一次添加到细胞培养基中。或者，有效浓度的IL-1家族细胞因子重复添加(例如，两次或更高频率地)至所述细胞培养基中。

如本文使用的，术语“(重复地)添加有效浓度的IL-1家族”是指所述细胞培养基中的所述IL-1家族细胞因子的浓度为1U/mL至5000U/mL，优选10U/mL至1000U/mL，更优选50至500U/mL。如本文使用的术语“饲养细胞的膜颗粒”是指含有饲养细胞的NK细胞刺激表面分子的饲养细胞的膜制备物。可以利用饲养细胞的膜颗粒来避免活饲养细胞的可能缺点。饲养细胞的膜颗粒可以通过使用氮空化作用裂解和破坏细胞，然后通过密度梯度离心分离和纯化细胞膜级分来产生，如Oyer等示例性描述的(Oyer 2015)。通常，在本文公开的方法中，饲养细胞可以用所述饲养细胞的膜颗粒代替。优选地，膜颗粒以可通过使用的活饲养细胞获得的这些量相当的量来使用。优选地，所使用的膜颗粒的浓度可以在100和400μg/mL之间，更优选150至250μg/mL之间。膜颗粒的添加可以与活饲养细胞的添加相同的频率进行。

如本文使用的术语“工程化的细胞”和“遗传修饰的细胞”(在本文尤其是指NK细胞)可以互换使用。该术语表示含有和/或表达外源基因或核酸序列，其转而改变细胞或其后代的基因型或表型。该术语尤其是指细胞可以通过本领域公知的重组方法来操纵以稳定或瞬时地表达肽或蛋白质的事实，所述肽或蛋白质在天然状态的这些细胞中不表达。如本文使用的术语“封闭系统”是指降低细胞培养物污染的风险而同时进行培养过程(如引入新的材料并进行细胞培养步骤，如细胞的增殖、分化、激活和/或分离)的任何封闭系统。这样的系统允许在GMP或GMP-样条件(“无菌”)下操作，从而获得临床上适用的细胞组合物。本文示例性地使用CliniMACS (Miltenyi Biotec GmbH，德国)作为封闭系统。该系统在WO2009/072003中公开。但是无意将本发明的方法的使用限于Prodigy。如本文中所使用的术语“自动化方法”或“自动化过程”是指通过使用设备和/或计算机和计算机软件来自动化的任何过程，否则将或可以由操作员手动执行。已经自动化的方法(过程)需要较少的人工干预和花费较少的人力时间。在一些情况下，如果在没有任何人工支持或干预的情况下执行本方法的至少一个步骤，则本发明的方法是自动化的。优选地如果本文公开的方法的所有步骤均在没有人支持或干预的情况下进行，则本发明的方法为自动化的。优选地，自动化过程在诸如Prodigy的封闭系统上实施。CAR包含对特定靶抗原特异性的抗体的单链可变片段(scFv)，其通过铰链和跨膜区与细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞激活部分包括与细胞触发(例如CD3ξ)部分串联的细胞共刺激(例如CD28、CD137、OX40、ICOS和CD27)结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR移植细胞以非HLA限制性方式直接识别靶细胞上的所需抗原。

实施方式

在本发明的一个实施方式中，用逆转录病毒载体颗粒(例如，慢病毒载体颗粒)将转基因核酸(例如，编码嵌合抗原受体的核酸)转移至激活的NK细胞中，所述病毒载体颗粒用能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化。

所述假型化的逆转录病毒载体颗粒，例如，慢病毒载体颗粒，可以包含嵌合包膜糖蛋白(其包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体或由其组成)，或修饰的BaEV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。

包含NK细胞的细胞培养基中的NK细胞被激活，例如，通过将IL-2和/或IL-15添加至培养基中。2至5天后，NK细胞激活的作用导致NK细胞增殖。随后，所述的假型化逆转录病毒载体颗粒，例如，慢病毒载体颗粒，可以加入培养基中，即加入激活的NK细胞中。激活的NK细胞被所述的载体颗粒转导，在培养基中扩增并表达转基因，例如，嵌合抗原受体。

这些工程化的NK细胞可以用于治疗需要的受试者。

在本发明的另一个实施方式中，用逆转录病毒载体颗粒(例如，慢病毒载体颗粒)将转基因核酸(例如，编码嵌合抗原受体的核酸)转移至激活的NK细胞中，所述病毒载体颗粒用能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化。

所述假型化的逆转录病毒载体颗粒(例如，慢病毒载体颗粒)可以包含嵌合包膜糖蛋白(其包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体或其组成)，或修饰的BaEV包膜糖蛋白(其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽)。

通过将IL-2和/或IL-15和IL-1家族细胞因子(例如，IL-18或IL-33)添加至培养基中激活包含NK细胞的细胞培养基中的NK细胞。在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时(1天)、28小时、36小时、42小时或48小时(2天)后，NK细胞被激活。随后所述的假型化逆转录病毒颗粒(例如，慢病毒载体颗粒)加入培养基中，即加入激活的NK细胞中。激活的NK细胞被所述载体颗粒转导，在培养基中扩增并表达转基因，例如，嵌合抗原受体。

这些工程化的NK细胞可以用于治疗需要的受试者。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是通过使用临床规模的细胞分离器(CliniMACS plus，Miltenyi Biotec，德国)的CD3耗尽和CD56富集纯化的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以通过在完全封闭的系统(CliniMACS Miltenyi Biotec，德国)中包括全部磁性标记步骤的CD3耗尽和CD56富集来纯化。

这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是通过负向磁性细胞分离从人类血液样品(如PBMC)纯化的NK细胞。NK细胞通过使用与结合非NK细胞的抗体或其片段的混合物偶联的磁珠来分离。随后将包含富集的NK细胞群体的负性级分加入适于NK细胞激活以及随后的转导的细胞培养基中，即，培养基包含Il-2和/或IL-15和/或IL-18。

这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是通过例如WO2013076070A1(NK细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec)中公开的负向磁性细胞分离和红细胞沉淀从人类全血纯化的NK细胞。

这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为NK细胞的纯化亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为纯化的CX3CD1阴性NK细胞亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为纯化的KLRG1或CD57阴性NK细胞亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为纯化的NKG2C阳性NK细胞亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为纯化的记忆样NK细胞亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为细胞因子诱导的记忆样NK细胞的NK细胞。这些NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为对单一KIR分子阳性或对特异性KIR分子阳性的纯化的NK细胞亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是作为对病毒肽特异性的纯化的NK细胞亚群的NK细胞。这些纯化的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是针对细胞因子和趋化因子分泌亚群富集的NK细胞。这些富集的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是使用荧光激活细胞器分离的亚群的NK细胞。这些分离的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是使用基于微芯片的细胞分选器(如MACSQuant(Miltenyi Biotec GmbH))分离的亚群的NK细胞。这些分离的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，可以用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)。

在本发明的一个实施方式中，可以用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞以表达结合标记的蛋白质(如生物素化的抗体)的嵌合抗原受体(CAR)。

在本发明的一个实施方式中，可以用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞以表达T细胞受体(TCR)。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以表达一种或多种趋化因子受体的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以表达与天然产生的相比较高或较低亲合力形式的NK细胞受体的NK细胞。所述NK细胞受体可以选自CD16、CD314/NKG2D、CD335/NKp46、NKp44、NKp30、CD226/DNAM-1或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KillerImmnoglobulin-like receptor)。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以表达免疫调节分子如PD-L1、CTLA-4、LAG-3、CD39或CD73的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以获得提高的或降低的抑制性受体，如KIR分子、NKG2A、PD-1或A2AR，的表达的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以产生细胞因子如IL-2或IL-15的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以表达肽治疗剂或蛋白质治疗剂如治疗性抗体的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，包含NK细胞群体的细胞培养基中的所述NK细胞可以是可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导以表达用于细胞追踪的蛋白质(如用于荧光追踪的GFP，或用于使用荧光素的化学发光追踪的荧光素酶)的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，在本领域技术人员已知的封闭系统中进行由NK细胞分离、NK细胞激活和NK细胞转导组成的方法。在再一个实施方式中，封闭系统是连接于细胞处理装置的一次性管道装置。在再一个实施方式中，所述细胞处理装置是CliniMACS(Miltenyi Biotec)。在再一个实施方式中，在第二封闭系统中以更大的体积进一步培养转导的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，在约200至1000升体积中大规模下转导后扩增所述NK细胞，从而为大量患者提供遗传修饰的NK细胞的临床产品。

在本发明的一个实施方式中，所述转导的NK细胞冷冻保存。将冷冻保存的NK细胞的等份试样解冻并在所述培养过程中进一步培养，从而允许从冷冻的细胞库开始生产转导的NK细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述NK细胞通过有限稀释从单个NK细胞扩增，用于产生表型均一的NK细胞产物。这种均一的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，所述NK细胞是从肿瘤活检样品分离的肿瘤浸润NK细胞。这些分离的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，所述NK细胞在细胞培养过程中从脐带血CD34+造血祖细胞产生。这些产生的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，所述NK细胞在细胞培养过程中从诱导的多能干细胞产生。这些产生的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，所述NK细胞从针对高NK细胞功能性选择的供体血液分离。这些分离和选择的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

在本发明的一个实施方式中，所述NK细胞从脐带血分离。这些分离的NK细胞可用本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒转导。

实施例

实施例1：令人惊讶地，用狒狒包膜糖蛋白(BaEV)假型化的慢病毒载体在NK细胞预 激活时显示出原代NK细胞的高转导效率。

对于从棕黄层的NK细胞分离，使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)通过标准密度梯度离心进行外周血单核细胞(PBMC)制备。将NK细胞分离试剂盒-人(MiltenyiBiotec)用于从PBMC的NK细胞未接触富集。将分离的NK细胞分成三个组，激活它们不同的持续时间并用含有GFP的BaEV假型化的慢病毒载体转导。按照制造商的实验方案，所有转导用10ng/ml vectofusin(Miltenyi Biotec)和spinoculation进行。第一组NK细胞在分离后立即转导(无激活)。第二组NK细胞在含有5％AB血清、500U/ml IL-2和10ng/ml IL-15的NKMACS培养基(Miltenyi Biotec)培养1天(在IL-2+IL-15中激活1天)，并随后转导。第三组NK细胞在含有5％AB血清、500U/ml IL-2和10ng/ml IL-15的NK MACS培养基(MiltenyiBiotec)中培养2天(在IL-2+IL-15中激活2天)，并随后转导。作为用于每个转导组的对照，除了没有添加病毒载体(未转导)，NK细胞在与转导的细胞相同的条件中培养。转导后三天，非激活的NK细胞显示出仅2.44％的转导(无激活，图1左下图)。另一方面，在含有5％AB血清、500U/ml IL-2和10ng/ml IL-15的NK MACS培养基(Miltenyi Biotec)中培养1天和2天的NK细胞组分别显示出14.59％和22.61％的GFP表达(图1，转导的，中和右下图)。在每个组中，非转导的NK细胞未显示出任何GFP表达(图1，上图，非转导的)。

实施例2：激活的NK细胞用BaEV的转导显著高于用VSV-G转导，是长时间稳定的，且 不诱导细胞死亡

按照实施例1中所述的分离原代NK细胞，从而产生纯的CD3^-和CD56⁺NK细胞(图2A)。根据用户手册，使用来自Miltenyi的抗CD4的MicroBeads和抗CD8的MicroBeads从相同血液样品分离T细胞，从而产生纯的CD3阳性T细胞(图2A)。分离后，NK细胞在含有5％AB血清、10ng/ml IL-15和500U/ml IL-2的NK MACS培养基中激活2天。分离后，T细胞根据用户手册在来自Mitenyi的含有200U/mL IL-2和T细胞Transact人的TexMACS培养基中激活2天。随后，用含有编码GFP表达的慢病毒载体的上清液转导激活的原代T细胞和NK细胞以及NK-92细胞系，该载体用VSV-G包膜假型化或用BaEV假型化。用VSV-G假型化的病毒颗粒转导后三天，NK细胞仅显示出约2％GFP表达，即使在高病毒滴度下，而T细胞在相同条件下显示出约77％的高GFP表达(图2B)。这个观察证实了VSV-G假型化慢病毒载体的NK细胞转导是无效的，而其对其他细胞类型(包括T细胞)是起作用的。令人惊讶地，用BaEV假型化病毒载体转导NK细胞系NK-92后3天，观察到接近100％的高GFP表达，而用VSV-G的GFP表达(与原代NK细胞相似)是无效的(图2C)。NK-92细胞在含有200U/mL IL-2的NK MACS培养基中的激活条件下维持。与对NK-92的观察相符，使用BaEV假型化载体进行转导时，令人惊讶地60％高比率的激活原代NK细胞表达GFP，达到了与T细胞相当的转导率(图2D)。重要地，意味着细胞数量随着时间增加的扩增率对于未转导的NK细胞和用BaEV假型化的载体转导的NK细胞是相当的，表明转导方法不诱导细胞死亡，也不影响NK细胞的增殖(图5)。这不同于用于遗传修饰的其他方法，如电穿孔，其中处理引起高的细胞死亡水平。此外，用于遗传修饰的其他方法，如电穿孔，只允许转基因的瞬时表达。值得注意的是，用BaEV假型化的慢病毒载体转导后，表达转基因的NK细胞的始终高的百分比在数周内是稳定的(图6)。

实施例3：令人惊讶地，NK细胞用IL-33的短期激活允许比没有IL-33的情况下更高 的NK细胞转导率

按照实施例1中所述的分离原代NK细胞。将纯化的NK细胞在含有IL-2(500U/mL)和IL-15(10ng/ml)，或者IL-2(500U/mL)、IL-15(10ng/ml)和IL-33(30U/mL)的具有5％AB血清的NK MACS培养基中激活2天。在第2天，细胞用含有目标基因的用狒狒(BaEV)(图3A)或VSV-G(图3B)假型化的慢病毒载体转导。如实施例1中所述的进行转导。未转导的细胞在与转导的细胞相同的条件下培养。转导后，将细胞在不含IL-33的培养基中培养。在转导后第3天、第8天和第14天，用针对目标基因产物的特异性单克隆抗体检测转导的NK细胞中的转基因表达。转导后第3天的转基因表达，在没有IL-33的情况下和使用IL-33的情况下分别是16.62％和21.27％(图3A，左下图)。转导后第8天的转基因表达，在没有IL-33的情况下和使用IL-33的情况下分别是32.59％和45.03％(图3A，中图)。转导后第14天，转基因表达在没有IL-33的情况下和使用IL-33的情况下分别是33.66％和60.17％(图3A，右下图)。这一结果表明NK细胞用IL-33预刺激对转导具有加性效应。未转导的NK细胞显示出非常低的抗体染色水平(低于1％，图3A，上图)。尽管用VSV-G包膜假型化的慢病毒载体与狒狒假型化的载体相比显示出显著更低的转导效率，然而IL-33的加性效应仍然是明显的(图3B)。

实施例4：IL-18提高了NK细胞转导率，与IL-33相似，表明了IL-1家族细胞因子的 一般作用

从3个不同供体，按照实施例1中所述分离原代NK细胞。分离后，将来自相同供体的NK细胞在含有5％AB血清、10ng/mL IL-15和500U/mL IL-2以及添加20ng/mL IL-18或不含IL-18的NK MACS培养基中激活2天。随后，用用BaEV假型化的编码GFP的慢病毒载体转导激活的原代NK细胞。转导后，将细胞在不含IL-18但含IL-2和IL-15的培养基中培养。转导后三天，NK细胞在未用IL-18预激活时显示出平均40％的GFP表达，而用IL-18预激活时来自相同供体的NK细胞显示出明显更高的66％的GFP表达(图4)。

实施例5：BaEV假型化慢病毒载体的使用使得可能用特异性杀灭CD19阳性靶细胞 的CD19CAR有效转导激活的NK细胞

表达CAR的T细胞在针对CD19+B细胞白血病的治疗的临床试验中导致非常积极的结果。因为CAR NK细胞可以是CAR T细胞的替代，我们用针对CD19的CAR转导NK细胞，作为NK细胞转导的一个示例性应用。按照实施例1中所述的，从4个不同供体分离原代NK细胞。分离后，将来自相同供体的NK细胞在含有5％AB血清、10ng/mL IL-15和500U/mL IL-2的NK MACS培养基中激活2天。随后，用编码CD19-CAR的慢病毒载体转导激活的原代NK细胞。使用的“CD19B”CAR构建体及其在VSV-G转导后T细胞中的表达之前有描述(Schneider等，2017)。对于NK细胞的转导，产生了用于这个构建体的用BaEV假型化的慢病毒载体并使用。转导后七天，分析了CAR表达和NK细胞毒性。详细地，NK细胞在无血清培养基中孵育48h后，通过重组人CD19Fc(R&D Systems)，25μg/mL的结合30min及使用鼠APC缀合的抗Fc的mAb(MiltenyiBiotec)通过流式细胞术的检测来测定CD19-CAR表达。平均地，来自不同供体的NK细胞中的CD19-CAR表达为70％，一些供体达到了90％的转导率(图7A)。通过基于流式细胞术的测定分析不同靶细胞系的靶细胞杀灭。靶细胞用CellTrace Violet(Life Technologies)标记，并且每孔2×10³个细胞接种于96-孔圆底平板中。随后，添加作为对照的培养基或不同NK-靶标比率的NK细胞。24h后，通过流式细胞术定量CellTrace Violete阳性靶细胞。将含有NK细胞的样品和相应的不含NK细胞的样品中的活的靶细胞之间的差异定义为杀死的靶标。K562细胞不表达CD19(图7B)，但可以认为它们是标准靶标以测试由于它们对NK细胞天然细胞毒性的敏感性引起的NK细胞一般细胞毒性潜力。如预期的，CAR NK细胞和未转导的NK细胞都以非常相同的剂量依赖性方式非常有效地杀灭NK细胞，证明了非CD19-依赖性的天然细胞毒性不受转导的影响(图7C)。与K562细胞相反，RS4；11细胞表达CD19(图7B)，但它们对NK细胞天然细胞毒性完全不敏感。因此，未转导的NK细胞不能杀灭RS4；11细胞，而CD19-CARNK细胞与K562细胞同样有效地杀灭RS4；11，证明了所用的CD19CAR的高功能性和特异性(图7B)。Raji细胞是CD19阳性的(图7B)，但不同于RS4；11，它们对激活的NK细胞天然细胞毒性是敏感的，尽管与K562细胞一样达到较低的程度。因此，未转导的NK细胞已经能够以剂量依赖性方式杀灭Raji细胞，尽管通过CD19CAR NK细胞的Raji细胞杀灭明显更高，表明了CD-19特异性杀灭的加性效应。总之，用BaEV假型化慢病毒载体转导NK细胞使得可能有效产生表达CD19CAR的NK细胞，具有提高的白血病靶细胞的CD19特异性杀灭。

实施例6：激活的而非天然的NK细胞表达狒狒包膜ASCT2的受体。

通过在含有IL-2和IL-15的NK MACS培养基(Mitenyi Biotec GmbH)中生长2天来激活NK细胞。将天然的和激活的细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解并使用抗ASCT2的抗体进行蛋白质印迹分析。这个结果表明了狒狒包膜ASCT2的受体只在NK细胞激活后表达(图8)，但不在天然NK细胞中表达，表明了NK细胞需要激活以用狒狒假型化的慢病毒载体转导。

实施例7：增殖性而非静止的NK细胞是可转导的。

NK细胞用增殖染料标记，充分洗涤并随后用包含GFP的狒狒假型化慢病毒载体转导。在开始增殖和转导后4天通过流式细胞术测定细胞增殖和转导。结果表明只有增殖性的而非静止的NK细胞是可用狒狒假型化慢病毒载体转导的(图9A)。GFP转导的NK细胞用抗CD56抗体染色并对三组NK细胞(GFP+、GFP-增殖的、静止的)进行门控以测定CD56表达的水平(图9B)。所有增殖的和转导的NK细胞是CD56^亮，而非转导的静止NK细胞是CD56^暗，表明CD56^暗NK子集是非增殖性的和非可转导的。接着，我们进一步在增殖的且转导的、增殖的但非转导的和静止的NK细胞子集间比较其他NK细胞受体(图10)。NK细胞用增殖染料标记，充分地洗涤并随后用含有GFP的狒狒假型化慢病毒载体转导。转导后第4天，细胞用抗不同NK细胞受体的单克隆抗体染色，并使用流式细胞术测定表达。显示了不同子集之间通常已知的NK细胞标志物的表达(图10)。NKp46、DNAM-1、CD94和NKG2C的表达在所有不同的NK细胞子集之间是相当的。在增殖性细胞的级分内，GFP⁺和GFP^-细胞之间不同NK细胞标志物表达的差异不是显著的。然而，根据几个标志物的表达，静止的NK细胞与增殖性NK细胞相比具有显著不同的表型。增殖性细胞是更CD56亮的，具有较低的CD16表达，较高的激活受体NKp30、NKp44和NKG2D的表达以及较高的TRAIL和NKG2A的表达的趋势(图10)。

实施例8：CX3CR1^neg NK细胞子集是高度增殖性的和可转导的。

将来自5个供体的NK细胞用于通过流式细胞术分析371个表面标志物。分析了静止的NK细胞和增殖性NK细胞的标志物分布之间的差异，其进一步分成GFP表达群体和GFP阴性群体。从筛选中，确定了在不表达GFP的静止NK细胞与可以转导并表达GFP的增殖性NK细胞之间最佳区分的标志物。总体上，在与静止NK细胞的直接比较中，增殖性和GFP阳性的NK细胞以较高水平表达32个标志物和以较低水平表达5个标志物(图11A)。在这些标志物中，一些不仅在表达水平上不同，而且表达特异性标志物的NK细胞的频率也不同。最明显的是在增殖性和GFP阳性的NK细胞中不存在CX3CR1表达和高频率的强烈表达TRAIL的细胞。

实施例9：CX3CR1^neg NK细胞子集是用狒狒假型化慢病毒载体可高度转导的并且可 以用作标志物。

从与增殖和转导最相关的表面分子，选择CX3CR1用于进一步的研究以测试是否这种标志物可以在具有不同的增殖和转导能力的NK细胞子集直接区分。在转导和培养之前，使用MCAS分选基于它们的CX3CR1表达分离不同的NK细胞子集。在没有分选的情况下，来自不同供体的血液来源NK细胞中的CX3CR1表达为86％，意味着只有小部分的全部NK细胞的约14％不表达CX3CR1(图5A)。分选后，通过针对CX3CR1的富集，CX3CR1^neg NK细胞的平均频率可以降至2％，而另一方面，标志物的耗尽导致91％的CX3CR1^neg NK细胞(图12A)。在不同分选的NK细胞级分的培养和转导后不久，我们观察到关于转基因表达和增殖速率的显著差异(图12B、12C)。在未分选的级分中，增殖和GFP表达率分别为28％和21％。同时，具有边缘含量的CX3CR1阴性细胞的CX3CR1富集级分只含有11％的增殖和7％的GFP阳性细胞。令人印象深刻地，在具有高起始频率的CX3CR1^neg NK细胞的CX3CR1耗尽级分中，已经有81％是增殖的，和69％是GFP阳性的。即使在CX3CR1富集级分内，主要在其余的CX3CR1^neg细胞中观察到增殖和GFP表达(图12C)。总而言之，实验鉴定了可以用BaEV假型化LV有效转导的高度增殖性NK细胞的子集。这个NK细胞子集可以通过不存在CX3CR1表达来明确限定并且这个特征可以用于可转导NK细胞的预先富集。

实施例10：IL-1β提高NK细胞转导率。

从外周血单核细胞(PBMC)分离新鲜的NK细胞并用IL-2/IL-15或IL-2/IL-15/IL-1β(IL-1beta)刺激三天。在激活后第2天，用3的感染复数(MOI)转导淋巴细胞。第二天，细胞洗涤并在IL-2/IL-15存在下继续扩增另外7天。为了检测遗传修饰的NK细胞的频率，细胞用生物素化的抗独特型抗体标记，所述抗体特异性地靶向CAR的scFv结构域。使用抗生物素-PE二级mAb标记来进行生物素缀合物的检测。在每个点图中显示出阳性细胞的百分比，表明了用IL-2、IL-15和IL-1β刺激的新鲜NK细胞导致了与没有IL-1β的IL-2/IL-15相比更优的转导率(68％vs 52％)。结果是3个独立实验的代表。

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