阅读说明：本技术 一种湖羊血清提取工艺 (Hu sheep serum extraction process ) 是由 陈争上 徐宁 华金玲 陈�胜 王立克 周玉刚 于 2020-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种湖羊血清提取工艺,提取工艺包括：原液制备、菌液灭活、免疫抗体制备、免疫、采血、精制血清。其中从动物血浆提取免疫球蛋白时,包括步骤：S1、取免疫血浆,加入硫酸铵,使硫酸铵终质量分数为45-50％,待硫酸铵全部溶解后离心,取沉淀；S2、加水复溶,再次加入硫酸铵盐析,取沉淀加水溶解、离心,取上清液得免疫球蛋白溶液；S3、向免疫球蛋白溶液中加水至动物免疫血浆的初始体积,加入甲苯,用酸调节剂调节溶液pH值至3.6-4.5,加入胃蛋白酶,25℃水浴条件下酶解3-5h,然后用碱调节剂调节pH值至5.0-5.4,取上清液纯化,得抗体的血清溶液。本发明的血清提取工艺结合盐析、柱层析和凝胶过滤等方法,得到的抗体纯度高,溶解快,异物蛋白低。(The invention provides a Hu sheep serum extraction process, which comprises the following steps: preparing stock solution, inactivating bacteria liquid, preparing immune antibody, immunizing, collecting blood, and refining serum. Wherein the immunoglobulin is extracted from animal plasma, comprising the steps of: s1, taking immune plasma, adding ammonium sulfate to make the final mass fraction of the ammonium sulfate be 45-50%, centrifuging after the ammonium sulfate is completely dissolved, and taking the precipitate; s2, adding water for redissolving, adding ammonium sulfate for salting out, taking the precipitate, adding water for dissolving, centrifuging, and taking supernatant fluid to obtain immunoglobulin solution; s3, adding water into the immunoglobulin solution to the initial volume of animal immune plasma, adding toluene, adjusting the pH value of the solution to 3.6-4.5 by using an acid regulator, adding pepsin, carrying out enzymolysis for 3-5h at 25 ℃ in a water bath, adjusting the pH value to 5.0-5.4 by using an alkali regulator, and taking the supernatant to purify to obtain the serum solution of the antibody. The serum extraction process combines the methods of salting out, column chromatography, gel filtration and the like, and the obtained antibody has high purity, quick dissolution and low foreign protein.)

一种湖羊血清提取工艺

技术领域

本发明涉及抗血清提取技术领域，具体为一种湖羊血清提取工艺。

背景技术

莱姆病(Lyme disease LD)是由蜱叮咬传播的一种动物源性、自然疫源性疾病，是新发现的人畜共患传染病，其病原体为伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，现有饲养湖羊的环境中，由于湖羊经常在野外觅食，在被外界蜱叮咬传播莱姆病的现象经常发生，给饲养企业造成很大的损失和管理难度，所以需要一种在患病山羊身上提取免疫蛋白的工艺，来给群体羊群提供注射免疫的血清。

在生物科技快速发展的今天，动物血清的用途愈来愈广泛。有些免疫血清、特制血清价值非常高，所以如何多快好省提取羊抗血清便是当今生物科技领域非常重要的课题之一。现有技术中已有很多抗血清的提取方法，大多采用静脉取血，虽然可以有效提取抗血清，但是仍然存在一些问题，如单位体重采血量、全血中血清量以及单位体重血清量均较低等问题。

发明内容

针对现有的技术方案存在的问题，本发明的目的在于提供一种湖羊血清提取工艺。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：。

一种湖羊血清提取工艺，其用于对湖羊莱姆病血清抗体的提取，其包括步骤：

(1)原液制备：将患病湖羊莱姆病血清菌株接种到固体培养基；

(2)菌液灭活：提取上述固体培养基的患病湖羊新鲜毒液，低温离心，取上清液真空冷冻干燥；混合同类型的干燥湖羊血液作为免疫抗原，测定疾病病毒传染力；将所述免疫抗原用0.2-0.25μm滤膜过滤除菌，并进行灭活处理；将所得混合菌液添加0.2％甲醛，放37℃摇床灭活24h，摇床速度控制在120r/min，灭活后进行灭活检验，确认无菌生长后，得到灭活菌液；

(3)免疫抗体制备：将灭活后的菌液8000r/min，离心10min，去除上清，留下菌体，达到去除毒素和浓缩的效果，将菌体用生理盐水冲下，配置成1000亿cfu/mL的抗原液；

(4)免疫：试血，用抗原液血清对健康湖羊进行免疫；

(5)采血：免疫血浆效价达到要求时进行采血，并离心分离血浆；

(6)精制血清：从湖羊血浆提取免疫球蛋白，收集抗体，脱盐、冻干，即得所述具有莱姆病血清抗体的血清。

进一步的，步骤(5)中，离心的条件为2000-2500rpm，离心时间为15-30min。

进一步的，步骤(6)从动物血浆提取免疫球蛋白时，包括步骤：

S1、取湖羊超免疫血浆，加入硫酸铵，使硫酸铵终质量分数为45-50％，待硫酸铵全部溶解后离心，取沉淀；

S2、加水复溶，再次加入硫酸铵盐析，取沉淀加水溶解，透析、离心，取上清液得免疫球蛋白溶液；

S3、向免疫球蛋白溶液中加水至动物免疫血浆的初始体积，加入甲苯，用酸调节剂调节溶液pH值至3.6-4.5，加入胃蛋白酶，25℃水浴条件下酶解3-5h，然后用碱调节剂调节pH值至5.0-5.4，50℃下保温30min，待温度降至45℃以下，取上清液纯化，得具有莱姆病血清抗体的血清溶液。

进一步的，所述S1步骤中，用硫酸铵首次盐析过程中离心的条件为3000-4000rpm，离心时间为30-60min。

进一步的，所述S2步骤中，用硫酸铵再次盐析时，使硫酸铵最终质量分数为33％；透析时，采用截留分子量大于500的透析袋透析至少三次，透析时间为30min；离心的条件为4000-6000rpm，离心时间为20-30min。

进一步的，甲苯的加入量为使甲苯在体系中的终质量分数为0.2％；所述胃蛋白酶的加入量为0.2g/L溶液；所述酸调节剂为5mol/L盐酸；所述碱调节剂为4mol/L NaOH溶液。

进一步的，所述S3步骤中，所述上清液纯化时，用柱层分离除去杂蛋白；柱层析过程中，用1.0mol/L硫酸铵溶液和0.05mol/L磷酸钠溶液淋洗1.5个柱床体积后，用注射用水进行梯度洗脱，收集活性峰，即得纯化上清液。

进一步的，疏水柱层析之前，用2mol/L硫酸铵溶液将层析液的电导率调节至50-70ms/cm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

针对现有技术中采用抽取解析法利用静脉取血，单位体重采血量、全血中血清量以及单位体重血清量均较低等问题，首先，本发明采用盐析法，利用在免疫血浆中加入硫酸铵，进行快速盐析，其提取的溶解速度明显提高；其次，对提取的免疫球蛋白进行柱层析；用1.0mol/L硫酸铵溶液和0.05mol/L磷酸钠溶液淋洗1.5个柱床体积后，用注射用水进行梯度洗脱，收集活性峰，得到高纯度的抗体；最终，配合凝胶过滤，收集的免疫球蛋白异物蛋白低，相对现有技术的提取工艺具有明显的进步。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

一种湖羊血清提取工艺，其提取步骤如下：

(1)取经过抗原免疫的湖羊，通过双侧颈动脉插管取血。

(2)用250ml玻璃瓶收集血液，每瓶的血液量为40ml。

(3)提取上述血液，低温离心，离心的条件为2000rpm，离心时间为15min，取上清液真空冷冻干燥；混合同类型的干燥湖羊血液作为免疫抗原，测定疾病病毒传染力；将所述免疫抗原用0.2μm滤膜过滤除菌，并进行灭活处理；将所得混合菌液添加0.2％甲醛，放37℃摇床灭活24h，摇床速度控制在120r/min，灭活后进行灭活检验，确认无菌生长后，得到灭活菌液。

(4)免疫抗体制备：将灭活后的菌液8000r/min，离心10min，去除上清，留下菌体，达到去除毒素和浓缩的效果，将菌体用生理盐水冲下，配置成1000亿cfu/mL的抗原液。

(5)将收集的抗原液及时放入与采血动物相同体温的水浴中1小时，血清析出后及时取出。

(6)取上述湖羊超免疫血浆，加入硫酸铵，使硫酸铵终质量分数为45％，待硫酸铵全部溶解后离心，取沉淀；离心的条件为4000rpm，离心时间为60min。

(7)加水复溶，再次加入硫酸铵盐析，取沉淀加水溶解，透析、离心，取上清液得免疫球蛋白溶液；使硫酸铵最终质量分数为33％；透析时，采用截留分子量大于500的透析袋透析至少三次，透析时间为30min；离心的条件为4000rpm，离心时间为20min。

(8)向免疫球蛋白溶液中加水至动物免疫血浆的初始体积，加入甲苯，用酸调节剂调节溶液pH值至4.5，加入0.2g/L胃蛋白酶，25℃水浴条件下酶解3-5h，然后用碱调节剂调节pH值至5.0，50℃下保温30min，待温度降至45℃以下，取上清液纯化，得具有莱姆病血清抗体的血清溶液。

(9)上清液纯化时，用柱层分离除去杂蛋白；柱层析过程中，用1.0mol/L硫酸铵溶液和0.05mol/L磷酸钠溶液淋洗1.5个柱床体积后，用注射用水进行梯度洗脱，收集活性峰，即得纯化上清液。

实施例2

一种湖羊血清提取工艺，其提取步骤如下：

(1)取经过抗原免疫的湖羊，通过双侧颈动脉插管取血。

(2)用500ml玻璃瓶收集血液，每瓶的血液量为60ml。

(3)提取上述血液，低温离心，离心的条件为2500rpm，离心时间为20min，取上清液真空冷冻干燥；混合同类型的干燥湖羊血液作为免疫抗原，测定疾病病毒传染力；将所述免疫抗原用0.25μm滤膜过滤除菌，并进行灭活处理；将所得混合菌液添加0.2％甲醛，放37℃摇床灭活24h，摇床速度控制在120r/min，灭活后进行灭活检验，确认无菌生长后，得到灭活菌液。

(4)免疫抗体制备：将灭活后的菌液8000r/min，离心10min，去除上清，留下菌体，达到去除毒素和浓缩的效果，将菌体用生理盐水冲下，配置成1000亿cfu/mL的抗原液。

(5)将收集的抗原液及时放入与采血动物相同体温的水浴中1小时，血清析出后及时取出。

(6)取上述湖羊超免疫血浆，加入硫酸铵，使硫酸铵终质量分数为45％，待硫酸铵全部溶解后离心，取沉淀；离心的条件为4000rpm，离心时间为60min。

(7)加水复溶，再次加入硫酸铵盐析，取沉淀加水溶解，透析、离心，取上清液得免疫球蛋白溶液；使硫酸铵最终质量分数为33％；透析时，采用截留分子量大于500的透析袋透析至少三次，透析时间为30min；离心的条件为4000rpm，离心时间为20min。

(8)向免疫球蛋白溶液中加水至动物免疫血浆的初始体积，加入甲苯，用酸调节剂调节溶液pH值至4.0，加入0.2g/L胃蛋白酶，25℃水浴条件下酶解3-5h，然后用碱调节剂调节pH值至5.0，50℃下保温30min，待温度降至45℃以下，取上清液纯化，得具有莱姆病血清抗体的血清溶液。

(9)上清液纯化时，用柱层分离除去杂蛋白；柱层析过程中，用1.0mol/L硫酸铵溶液和0.05mol/L磷酸钠溶液淋洗1.5个柱床体积后，用注射用水进行梯度洗脱，收集活性峰，即得纯化上清液。

实施例3

(1)取经过人载脂蛋白抗原免疫的湖羊，通过双侧颈动脉插管取血；

(2)用250ml玻璃瓶收集血液，每瓶的血液量为40ml；

(3)将收集的血液及时放入与采血动物相同体温的水浴中1小时，血清析出后及时取出；

(4)及时吸取析出的血清，并室温静置，反复多次吸取瓶中析出的血清。下面通过上述实施例的数据采集对本发明的效果进行评价。其中，表1为实施例3(常规方法)所得抗血清各指标结果；表2为实施例1所得抗血清各指标结果；表3为实施例2所得抗血清各指标结果。

表1

表2

表3

综上数据分析，采用本发明盐析法，利用在免疫血浆中加入硫酸铵，进行快速盐析，对提取的免疫球蛋白进行柱层析，用注射用水进行梯度洗脱，收集活性峰，得到高纯度的抗体；最终，配合凝胶过滤，收集的免疫球蛋白异物蛋白低，相对现有技术的提取工艺具有明显的进步。全血中血清量得到明显提高了，血清效价基本不影响。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。