具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

一种通经草多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)取干燥的通经草粉末，按照料液比1:40～1:120加入蒸馏水，恒温95℃水浴提取140～180min，离心去除沉淀，得到粗提液；

(2)将步骤(1)所得的粗提液浓缩，得到浓缩液，计量浓缩液体积，加入2倍浓缩液体积的乙醇，4℃冰箱存放15h以上，5000r/min离心5min，取沉淀干燥后得一级粗提物；

(3)将步骤(2)离心所得上清液继续加入步骤(2)所述浓缩液体积2～3倍的乙醇，4℃冰箱放置15h以上，5000r/min离心5min，取沉淀干燥后得二级粗提物；

(4)取步骤(3)所得二级粗提物300毫克，溶解于15ml蒸馏水中，5000r/min离心5min，取上清液过DEAE-Sepharose CL-6B层析柱(直径4.6cm，高35cm)，调节流速为0.9～1.1mL/min，自动部分收集器设定每管收集12mL洗脱液，分三步进行分段洗脱：第一步用蒸馏水洗脱13～18h，第二步使用0.3～0.4mol/L NaCl溶液600mL～1200mL进行洗脱，第三步使用1～2mol/L NaCl溶液1200mL～1800mL进行洗脱，合并第二步收集到的洗脱液，用截留分子量8000的透析袋透析，使用流水和蒸馏水各透析20～28h，将透析液浓缩后冷冻干燥，得到通经草多糖。

实施例1响应曲面法优化通经草多糖的提取工艺

实验方法：采用单因素实验，研究液料比，提取温度和提取时间3个因素对通经草多糖提取率的影响。具体实验是在固定两个因素的实验条件下，考察另1个因素，从而可以得到该因素在不同实验水平下对通经草多糖提取率的影响。

为了优化通经草多糖的提取条件，采用正交试验及响应曲面实验以液料比、提取温度和提取时间为实验因素，称取1g通经草粉末，按照正交表和Box-Behnken方案安排实验。用蒸馏水在某提取温度下按某时间进行提取，离心得到粗提液，采用苯酚硫酸法检测所得粗提液的多糖提取率。

实验结果：

(1)单因素实验结果：通过改变料液比对通经草多糖进行提取，实验结果如图1所示；不同提取时间对通经草多糖提取率的影响，实验结果如图2所示曲线；提取温度对通经草多糖提取率的作用结果如图3所示。根据单因素实验结果，每个因素选取3个实验水平，安排后续正交实验和响应曲面实验。根据单因素实验结果，液料比(A)的三个水平如表1中A列的1、2、3分别确定为40:1、80:1、120:1，提取时间(B)的三个水平如表1中B列的1、2、3分别为100min、140min、180min，提取温度(C)的三个水平如表1中C列的1、2、3分别为65℃、80℃、95℃，通经草多糖提取率代码设定为Y。

(2)正交实验结果：根据正交水平因素表对得到的方案进行试验，结果见表1。

表1通经草多糖提取率正交试验结果

由表1可知，试验结果中同一因素不同水平之间的关系为：A₁>A₂>A₃，B₁>B₃>B₂，C₃>C₁>C₂，其中K₁(A)＝A₁B₁C₁+A₁B₂C₂+A₁B₃C₃＝9.063+8.758+9.655＝27.476，K₁(A)即为A₁条件液料比为40:1的提取率总和，依此类推，取A、B、C三列中K的最大值分别为K₁(A)、K₁(B)、K₃(C)，可以得出，通经草多糖提取率的正交优化实验的最优水平组合为A₁B₁C₃，即料液比1:40，提取时间100min，提取温度95℃。按照最佳提取工艺方案对通经草多糖进行提取，得到实际提取率为9.107％。

(3)响应面试验设计及结果：响应面试验设计方案及试验结果如表2所示。

表2通经草多糖提取率的Box-Behnken试验设计与结果

采用Design-Expert.V11.1.0软件对试验结果进行统计处理，利用数据拟合计算出回归方程模型为Y＝9.09-0.0942A+0.2893B+0.2885C+0.0217AB+0.1288BC-0.0384A²-0.5379B²-0.1669C²。为验证该模型对提取方案进行预测的效果，进一步确定各因素对通经草多糖提取率的影响程度，对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3回归方程方差分析和显著性结果

模型分析结果表明：根据数据结果得出的建议模型为Quadratic模型，此模型的p值为0.0275(<0.05)，回归模型显著，失拟项p为0.9713(>0.05)，失拟项不显著，说明模型对试验结果拟合性较好。方程的R²为0.8108，方程拟合程度较好，R²(pred)(0.5436)和R²(adj)(0.6216)的差值小于0.2，变异系数(C.V.)为3.31％较低，证明预测值与实际值基本相同，以上数据说明可利用此模型来分析和预测通经草多糖的提取率。

不仅方差分析结果可以分析模型是否可用，也可以通过诊断图诊断预测模型是否具有充分性。残差的正态图如图4所示，残差沿直线的分布表明残差服从正态分布。如图5所示(图5中A为残差图，B为预测值与实际值散点图)，所有数据点在可接受范围内(±3)，线性拟合图表明实际收益率和预测收益率之间存在良好的相关性。

通过响应面法优化，软件分析给出提取通经草多糖的最优条件为A(料液比)＝1：40，B(时间)＝155min，C(温度)＝95℃，按此方案进行3次平行试验，测得通经草多糖的平均提取率为9.688％，与理论值相差0.343％。

通过响应曲面法优化通经草多糖提取工艺，建立了提取率预测模型，得到了最佳提取条件。对比正交实验法，使用响应曲面法优化通经草多糖的提取，提取率高，效果更好。

实施例2通经草多糖的分离纯化，包括如下步骤：

(1)取干燥的通经草粉末150g，加入6000mL蒸馏水中，恒温水浴锅95℃水浴提取155min，5000r/min离心5min，去除沉淀，得到粗提液；

(2)将步骤(1)所得的提取液浓缩至120mL，加入240mL无水乙醇，4℃冰箱放置15h以上，5000r/min离心5min，取沉淀干燥后得一级粗提物；

(3)将步骤(2)离心后所得上清液继续加入240mL无水乙醇，冰箱4℃放置15h以上，5000r/min离心5min，沉淀干燥后得二级粗提物；

(4)取步骤(3)所得二级粗提物300毫克，溶解于15ml蒸馏水中，5000r/min离心5min，取上清液上DEAE-Sepharose CL-6B层析柱(直径4.6cm，高35cm)，打开恒流泵，调节流速0.9mL/min，分三步进行分段洗脱：第一步用蒸馏水洗脱13h，不收集洗脱液，第二步使用0.35mol/L NaCl溶液1200mL进行洗脱，自动部分收集器设定每管收集12mL洗脱液，第三步使用1mol/L NaCl溶液1200mL进行洗脱，自动部分收集器设定每管收集12mL洗脱液，使用苯酚-硫酸法和紫外分光光度计分别测定第二步和第三步洗脱液的糖和蛋白质含量，根据糖及蛋白质含量分布情况，合并第二步洗脱液30～50管，用截留分子量8000的透析袋对收集液进行透析，流水和蒸馏水各透析24h，透析液浓缩后冷冻干燥，得到通经草多糖AAP1。

结果：步骤(4)中第二步洗脱曲线如图6所示，第三步洗脱曲线如图7所示。根据图6可以看出洗脱液30～50管检测出一个糖峰(如图6的左半图)，同时也检测出1个蛋白质峰(如图6的右半图)，峰型和管数吻合，说明是结合蛋白。根据图7可以看出，使用更高离子强度的NaCl溶液洗脱，没有检测到糖(如图7的左半图)，只检测到蛋白质(如图7的右半图)，说明通经草多糖AAP1已在第二步洗脱出来。

步骤(4)中第二步洗脱时所使用的NaCl溶液浓度非常重要，浓度过大则离子强度大，随着通经草多糖的洗脱会随之洗脱出其它杂质蛋白，浓度太小则洗脱不出通经草多糖，经试验摸索第二步使用浓度为0.35mol/L的NaCl溶液至关重要。与图6相比，图8是步骤(4)中第二步使用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱结果，可以看出蛋白质分布曲线明显宽于糖分布曲线，两个曲线峰型不一样，说明有杂蛋白。

经步骤(2)和(3)获得一级和二级粗提物，使用一级粗提物经步骤(4)纯化结果如图9所示，从图9可以看出糖和蛋白质分布杂乱，与二级粗提物经步骤(4)纯化后图6结果完全不同。一级粗提物纯化后多糖均一性分析结果如图10所示，图10为一级粗提物经第二步洗脱后的高效液相色谱图。图10显示并非单一峰，也进一步说明一级粗提物经同样方法纯化得到的多糖不是均一性多糖，与本发明所得通经草多糖不同。进一步说明，使用乙醇分级沉淀，得到一级粗提物和二级粗提物，初步将不同的通经草多糖进行分离，再对二级粗提物进一步纯化才能够得到本发明所述的具有抗炎症和抗氧化作用的通经草多糖。

实施例3通经草多糖的特性分析

实验方法：采用高效体积排阻色谱法(HPSEC)鉴定样品AAP1的均一性，色谱柱是sugar ks-804，超纯水为流动相，柱温50℃，流速1mL/min，示差折光检测器检测。根据葡聚糖标准品在sugar ks-804色谱柱的出峰时间，制作分子量标准曲线，计算AAP1的重均分子质量。为了检测样品纯度，取0.5mg/mL的AAP1水溶液进行紫外全光谱扫描(190-800nm)。使用红外光谱(FTIR)法分析样品的主要官能团，确认化合物类型。

为分析AAP1的单糖组成，取20-30mg AAP1用1mol/L硫酸在100℃水解8h，碳酸钡中和后冷冻干燥，得到水解产物。将水解产物经三甲基硅醚化衍生，衍生物上hp-5毛细管色谱柱进行气相色谱分析，采用程序升温160℃→180℃(20℃/min)→220℃(8℃/min,保持2min)→250℃(2min)，检测器温度是280℃。

结果：通经草多糖AAP1的高效体积排阻色谱结果如图11所示。结果显示AAP1在6.082min仅有1个峰出现，该峰峰型尖锐且对称，说明AAP1均一性好，成分单一。经190-800nm紫外全光谱扫描(图12)，AAP1不含有核酸等杂质，纯度高。根据分子质量标准曲线(y＝-4x+6.31，R²＝0.99)，AAP1的HPSEC出峰时间，计算得出AAP1的重均分子质量为480kDa。根据AAP1的气相色谱结果(图13)，参照标准单糖衍生物的GC结果，得出AAP1由葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为2.5:2.14:2.07:1:3.88。图13中1-5波峰分别代表葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖和阿拉伯糖。

实施例4通经草多糖AAP1的抗炎症和抗氧化作用研究

实验方法：

抗炎症作用研究：培养RAW264.7细胞，培养条件是，DMEM完全培养基(含有10％血清和1％双抗)，37℃，5％二氧化碳培养箱，48h传代一次。使用MTT法检测通经草多糖对RAW264.7的细胞毒性，设置600，300，150，75，25和1μg/mL六个质量浓度。使用1μg/mL脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞产生炎症，设置空白组，阴性和阳性对照组，AAP1样品组，提取各组细胞内总RNA，反转录得到cDNA，以持家基因GAPDH为内参基因，实时荧光定量PCR测定CT值，2^-ΔΔCT法计算mRNA相对表达量，上述步骤均按照Promega公司的试剂盒说明书进行。

抗氧化实验研究：将样品配制成浓度为30mg/mL～0.0075mg/mL的水溶液，超氧阴离子清除能力的测定参照Robak的方法，取0.1mL样品液加入1mL含557uM NADH的16mMTris–HCl(pH8.0)，1mL含45uM PMS的16mM Tris–HCl(pH 8.0)，以及1mL含108uM NBT的16mMTris–HCl(pH 8.0)，25℃温浴5min，取出在560nm下测吸光值，按照清除率＝(1-样品管/对照管)×100％计算抑制率。羟自由基清除作用的测定参照Ghiselli等的方法并改进，取0.1mL样品液分别加入0.6mL反应缓冲液(含2.67mM脱氧核糖和0.13mM EDTA)，0.4mM硫酸亚铁0.2mL，2.0mM抗坏血酸0.05mL，以及20mM的H₂O₂ 0.05mL，37℃下温浴15min，取出后加入1％硫代巴比妥酸1mL和2％三氯乙酸1mL，沸水浴15min，立即放在冰上冷却，532nm测吸光值，按照清除率＝(1-样品管/对照管)×100％计算抑制率。DPPH自由基的测定，取50ul样品液，加入100ul 0.3mM DPPH溶液，25℃水浴20min，517nm下测OD，按照清除率＝(1-样品管/对照管)×100％计算抑制率。

实验结果：通过细胞毒实验，确认添加150μg/mL或75μg/mL的通经草多糖AAP1对RAW264.7细胞生长没有毒性。如图14所示，相较于空白组，阴性对照组(LPS)的炎症因子TNF-α、COX-2和iNOS mRNA相对表达量显著增加(P<0.05)，说明添加1μg/mL脂多糖(LPS)在RAW264.7细胞中后，成功建立了炎症模型。图14中，分图A为各组(空白组Control，阴性LPS对照组、阳性DXMS对照组、AAP1两个浓度样品组)对TNF-α表达量影响结果图，分图B为各组对COX-2表达量影响结果图，分图C各组对iNOS表达量影响结果图。APP1-75表示75μg/mL的APP1，APP1-150表示150μg/mL的APP1。

同时在RAW264.7细胞中添加1μg/mL脂多糖和通经草多糖AAP1(75μg/mL或150μg/mL)，与阴性对照组相比，两个浓度的AAP1均能显著降低炎症因子TNF-α的mRNA相对表达量(P<0.05)，经显著性分析，通经草多糖AAP1与阳性对照组(地塞米松，DXMS)对TNF-α表达抑制率无显著差异(P>0.05)，说明AAP1对TNF-α的抗炎效果与DXMS相当。AAP1也能显著降低RAW264.7细胞中炎症因子COX-2的mRNA相对表达量(P<0.05)，且75μg/mL的通经草多糖AAP1对COX-2的抗炎效果最好，优于150μg/mL的通经草多糖。相较于阴性对照组，添加75μg/mL或150μg/mL的AAP1能够显著降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞中iNOS基因的mRNA相对表达量(P<0.05)，且效果与阳性对照组无显著差异(P>0.05)。

通经草多糖AAP1的抗氧化结果如图15所示，以维生素c(Vc)作为阳性对照组，AAP1和Vc对超氧自由基、羟自由基和DPPH自由基的清除作用随浓度的增加而增加，呈现量效关系。通经草多糖AAP1对超氧自由基、羟自由基和DPPH自由基清除作用的EC₅₀分别是307μg/mL、227μg/mL和1.35μg/mL，Vc对以上3种自由基清除作用的EC₅₀分别是463μg/mL、2513μg/mL和4.62μg/mL。图15中，分图A为AAP1和Vc对超氧自由基的清除作用随浓度的增加而增加的曲线图，分图B为AAP1和Vc对羟自由基的清除作用随浓度的增加而增加的曲线图，分图C为相应浓度的AAP1对DPPH清除作用走势图，分图D为相应浓度的Vc对DPPH清除作用走势图。

综上所述，添加75μg/mL或150μg/mL的AAP1能够显著降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、COX-2和iNOS的mRNA相对表达量(P<0.05)，且AAP1对TNF-α和iNOS的抗炎效果与阳性对照组无显著差异(P>0.05)。通过对超氧自由基、羟自由基和DPPH自由基的清除作用研究，通经草多糖AAP1的抗氧化效果优于Vc。

人体因与外界接触，包括呼吸、放射线、空气污染等因素，体内会不断产生自由基，科学研究表明，过量产生的自由基与衰老、心血管疾病、关节炎、癌症等密切关联，所以抗氧化制剂的开发被化妆品、医药企业列为主要的研发方向之一。

炎症因子过多的表达会引起多种疾病，如中枢神经系统疾病、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾患、类风湿性关节炎等。抗炎和抗氧化相辅相成，因为自由基也是导致肌肤产生炎症的“元凶”之一，所以市面上很多化妆品都含有抗炎和抗氧化成分，寻找天然无毒的抗炎和抗氧产品也是市场上最重要的功能性诉求之一。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明权利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。