一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的制备方法及其用途
阅读说明：本技术 一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的制备方法及其用途 (Preparation method and application of 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid amino modified hydroxypropyl chitosan ) 是由 乐琳 曲晓辉 王敏 赵玲玉 彭池方 王周平 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的制备方法及其用途,以壳聚糖(CS)、环氧丙烷、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)作为原料,将氢氧化钠溶液碱化的CS与环氧丙烷反应(25％四甲基氢氧化铵作催化剂,45℃冷凝回流6h),产物经离心、透析和真空冷冻干燥后,得到羟丙基壳聚糖(HPCS),HPCS再与2,4-D在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化下反应,生成2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖衍生物(2,4-D-HPCS)。所制备的2,4-D-HPCS合成方法简单、成本较低、溶解性好、热稳定性好,且对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有很好的抗菌活性,在食品、医药、农业等领域具有应有价值。(The invention discloses a preparation method and application of 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid amino modified hydroxypropyl chitosan, using Chitosan (CS), propylene oxide and 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) as raw materials, reacting the CS alkalized by sodium hydroxide solution with propylene oxide (25% tetramethyl ammonium hydroxide is used as catalyst, condensing and refluxing for 6h at 45 ℃), centrifuging, dialyzing and vacuum freeze-drying the product, obtaining hydroxypropyl chitosan (HPCS), and reacting the HPCS with 2,4-D under the activation of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) to generate the 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid amino modified hydroxypropyl chitosan derivative (2, 4-D-HPCS). The prepared 2,4-D-HPCS has the advantages of simple synthesis method, low cost, good solubility and good thermal stability, has good antibacterial activity on staphylococcus aureus and escherichia coli, and has due value in the fields of food, medicine, agriculture and the like.)
技术领域
本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及到一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的制备方法及其用途。
背景技术
食品添加剂是食品行业中不可或缺的一部分，有着极为广阔的市场和应用，它是为了改善食品品质以及色、香、味，以及保鲜、防腐和加工工艺的需要而加入到食品中的人工合成或天然物质。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和壳聚糖(CS)均是我国允许添加食品中的食品添加剂。
2,4-D是在GB2760-2014中允许的一种食品添加剂，具有防腐抗菌功能。但是2,4-D的水溶性差在一定程度上限制了它的应用范围。
CS是在天然多糖中唯一的碱性多糖，是经过甲壳素在浓碱下处理脱去N-乙酰基的产物，含有游离的氨基，即β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，CS可以通过体内的溶菌酶的作用，分解为葡胺糖，被人体吸收。因为其来源丰富、无毒，并且具有优良的生物相容性等特性，可以很好地用于药物载体。但是CS水溶性相对较差，只能溶于弱酸，不溶于水和有机溶剂，且其抗菌性相对于一般抗菌物质效果较差，由于这两个原因，在很大程度上限制了CS在食品添加剂中的应用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖，所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖，包括I-A所示的任何立体化学异构形式或互变异构形式：
其中，X为R或H；
其中，R为下式I-B的基团，并且于a点同CS的氧原子连接：
其中，Y为下式I-C的基团，并且于d点同CS的2位的氮原子连接：
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的一种优选方案，其中：所述壳聚糖的分子量为100kDa，脱乙酰度为85％。
本发明的再目的是，克服现有技术中的不足，提供一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖的制备方法，包括，
将氢氧化钠溶液碱化的壳聚糖与环氧丙烷反应，25％四甲基氢氧化铵作催化剂，45℃冷凝回流6～8h，产物经离心、透析和真空冷冻干燥后，得到HPCS；
将HPCS再与2,4-D在EDC条件下活化反应，得到2,4-D-HPCS，即2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖。
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖制备方法的一种优选方案，其中：所述活化反应，反应体系为二甲基亚砜。
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖制备方法的一种优选方案，其中：所述活化反应，活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC。
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖制备方法的一种优选方案，其中：所述活化反应，其体系pH为5.5。
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖制备方法的一种优选方案，其中：所述壳聚糖的分子量为100kDa，脱乙酰度为85％。
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖制备方法的一种优选方案，其中：所述HPCS与2,4-D的摩尔比为1:1。
作为本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖制备方法的一种优选方案，其中：所述碱化的壳聚糖，其制备方法包括，
将壳聚糖转移至50％(w/w)NaOH水溶液中，搅拌完全混合后，-18℃保存25h，进行碱化；
解冻后，通过离心除去上层碱液，并转移至含有异丙醇的三颈烧瓶中，室温下剧烈搅拌30min。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种2,4-二氯苯氧乙酸氨基改性羟丙基壳聚糖在医药、食品、化妆品和农业领域的应用。
本发明有益效果：
本发明提供了一种新型物质2,4-D-HPCS的制备方法，本发明的制备方法简单、成本低、提纯方法简便，得到的CS衍生物具有良好的水溶性、热稳定性和抗菌活性，对典型微生物大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均具有良好的抑制作用，在食品、农业等领域都有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是2,4-D-HPCS的合成路线图。
图2A是CS、HPCS、2,4-D-HPCS的紫外可见图谱，图2B是透析不同时间2,4-D-HPCS样品的超纯水的紫外-可见吸收光谱。
图3是CS、HPCS以及2,4-D-HPCS的红外图谱。
图4是CS和本发明实施例中制备的2,4-D-HPCS的1H核磁共振图谱。
图5是CS、HPCS、2,4-D-HPCS的热失重率曲线图(TG)和热失重曲线图的一阶导数图(DTG)。
图6CS、HPCS、2,4-D-HPCS的X射线衍射图谱。
图7CS、HPCS、2,4-D-HPCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌图，其中，CS、HPCS、2,4-D-HPCS对金黄色葡萄球菌(A，a空白，b CS，c HPCS，d 2,4-D-HPCS)和大肠杆菌(B，a空白，b CS，c HPCS，d 2,4-D-HPCS)的抑菌图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明所述的图4 2,4-D-HPCS的制备方法如下：
采用2,4-D和CS作为原料，首先CS经过碱化反应得到HPCS，HPCS再与2,4-D在有机溶剂中反应得到图4 2,4-D-HPCS。其合成路线如图1。
实施例1：
2,4-D-HPCS的制备方法包括如下步骤：
HPCS的制备：
4g壳聚糖转移至50％(w/w)NaOH水溶液30ml；搅拌完全混合后，-18℃保存25h，进行碱化；
解冻后，通过离心除去上层碱液，并转移至含有40ml异丙醇的三颈烧瓶中，室温下剧烈搅拌30min；在搅拌下加入1ml 25％四甲基氢氧化铵、40ml环氧丙烷；室温下继续搅拌1h；持续搅拌之后，45℃回流6h；
结束后自然冷却，过滤，滤饼再溶于超纯水，超纯水透析3天，冷冻12h，真空冷冻干燥36h，得到HPCS。
2,4-D-HPCS的制备：
A:取摩尔比为1:1的碱化壳聚糖和2,4-D,即0.5g碱化壳聚糖溶于30ml超纯水。
B:取0.6g 2,4-D溶于30ml DMSO中，加入0.4g EDC；
将A与B混合，调pH至5.5，室温搅拌24h，超纯水透析三天，冷冻12h，真空冷冻干燥36h，得到2,4-D-HPCS。
使用紫外可见光谱、红外光谱和核磁共振对其结构进行表征，使用TGA和XRD对其性质进行表征。
紫外-可见吸收光谱是一种反映与芳香结构、共轭体系结构特征有关的吸收光谱，可以粗略鉴别有机物结构。
如图2A所示，CS本身没有生色团，在紫外可见光区没有吸收；2,4-D在紫外区290nm处有特征吸收峰(苯环具有的B吸收带)；在终产物2,4-D-HPCS的紫外吸收光谱中，也出现了芳香族化合物的B吸收带，证明2,4-D-HPCS溶液中存在2,4-D；为了验证2,4-D-HPCS溶液在290nm出现吸收是由改性到HPCS分子结构中的2,4-D引起，而不是由溶液中游离的2,4-D引起，通过连续三天对2,4-D-HPCS样品透析袋外的水样做紫外可见吸收光谱分析，如图2B所示，在290nm处的吸收峰逐渐降低，直至与空白水样重合，证明透析袋中已无小分子2,4-D，紫外区的吸收是由改性在HPCS分子结构的2,4-D引起，表示2,4-D-HPCS的成功合成。
红外光谱可提供的信息较多，特征性强，可采用红外光谱法来对化学物质结构进行分析与鉴定。如图3所示，CS的红外光谱中，3000-3700cm-1附近的宽峰属于氨基及羟基，3430cm-1的吸收带宽显然是-OH吸收带，区域中的吸收带1400-4000cm-1是特殊的吸收带，以鉴定各种官能团，1639，1515，1378cm-1分别为CS的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰，1047cm-1为CS环骨架氧桥的伸缩振动；
在HPCS的红外光谱中，HPCS的红外吸收光谱发生了如下变化：位于2917、2877cm-1附近处的亚甲基的C-H不对称伸缩振动吸收峰和对称伸缩振动吸收峰明显增强，羟丙基中存在伯醇结构，使1023cm-1附近的吸收峰有所增强，由此可以判断，HPCS的合成成功；在2,4-D-HPCS的红外光谱中，出现了1457，1278，784，744cm-1等新峰，其中1457，1278cm-1为酯键的C＝O吸收峰及C-O吸收峰，784，744cm-1为苯环在1，2，4位有取代时的吸收峰，从红外可以初步判断目标产物的合成。
图4是CS，HPCS，2,4-D-HPCS的1H核磁共振图谱。在2,4-D-HPCS中，化学位移δ在6.84～7.54处是苯环上未被取代H的化学位移，在HPCS中，化学位移1.0处出现明显的-CH3质子峰的化学位移，证明壳聚糖上引入了羟丙基基团，化学位移δ在3.30处为重水的溶剂峰，δ在2.49处为氘代DMSO的溶剂峰。
图5是CS，HPCS，2,4-D-HPCS的热重(TG)曲线和DTG曲线。CS在在25℃～550℃时存在2个失重阶段。第一次失重主要发生在温度为40℃～160℃，失重率为11.82％；第二次失重发生于190℃～420℃，失重率为35.44％；最快失重速率的温度Tmax＝320℃；HPCS在在25℃～550℃时存在2个失重阶段。第一次失重主要发生在温度为40℃～120℃，失重率为7.15％；第二次失重发生于125℃～420℃，失重率为59.05％；最快失重速率的温度Tmax＝255℃。
2,4-D-HPCS在25℃～550℃时存在2个失重阶段。第一次失重主要发生在温度为30℃～140℃，失重率为10.03％；第二次失重发生于180℃～430℃，失重率为49.51％；最快失重速率的温度Tmax＝300℃。
由此可见，由于改性导致CS晶型结构的改变，2,4-D-HPCS的热稳定性是弱于CS和强于HPCS，其结果与X射线衍射图谱分析结果一致。
图6是CS、HPCS、2,4-D-HPCS的X射线衍射图谱。CS分子可以形成分子间和分子内的氢键，即：3位-OH与另一个N-乙酰基葡萄糖残基的糖苷氧原子、2位-NH2的氮原子与3位-OH、N-乙酰基葡萄糖残基的3位-OH于另一个N-乙酰氨基葡萄糖残基的吡喃环氧原子，这些氢键能够使壳聚糖分子链的刚性变大，结晶性增强。如图6所示，在2θ＝10°的强衍射特征峰对应晶型Ⅰ，2θ＝20°对应的峰则是晶型Ⅱ，这是CS结晶性很强的原因，CS分子中的氢键增强了分子结构的有序性，导致CS的水溶性不好。
第一次改性后，HPCS在10°的衍射峰明显减弱甚至几乎消失，20°附近处的衍射峰也变宽且强度减弱，样品结晶度下降，其原因可能是CS壳聚糖在羟丙基化改性后，结晶度遭到破坏，结构中含有较多的无定型区，同时也使制备的改性产物水溶性得到改善；第二次改性2,4-D后，出峰的位置稍微向右偏移，且峰的强度明显增加，说明在2,4-D-HPCS比HPCS更加规整有序，结晶性能也变强。但与原料CS，峰的强度远低于CS，证明其水溶性也优于CS，根据X射线衍射图谱分析，三种物质的结晶程度由强到弱分别是CS>2,4-D-HPCS>HPCS。
实施例2
表1反应了CS、HPCS、2,4-D-HPCS在不同溶剂中的溶解性，从表1中可以看出，2,4-D-HPCS的溶解性远好于CS、在水、乙酸、乙醇、DMSO中都具有良好的溶解性。
表1 CS、HPCS、2,4-D-HPCS的溶解性
图7是CS、HPCS、2,4-D-HPCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果图。
CS、HPCS、2,4-D-HPCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果如图7所示。其中A组照片为金黄色葡萄球菌在平板上的生长状况，B组照片为大肠杆菌在平板上的生长状况。以空白组(a)为对照，CS(b)和HPCS(c)对这两种常见细菌均有抑制作用，但两者之间差距并不明显，2,4-D-HPCS(d)抑菌效果显著提高且明显优于CS和HPCS，同时CS、HPCS、2,4-D-HPCS对大肠杆菌的抑菌效果强于对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，这一结果可能与不同阳性、阴性微生物的细胞膜结构相关；为了更直观说明CS、HPCS、2,4-D-HPCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果，采用计算抑菌率来说明，表2是空白、CS、HPCS、2,4-D-HPCS对典型微生物大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率。从抑菌率来讲，2,4-D-HPCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别达到84.9％和88.6％，远强于CS和HPCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率。
表2 CS、HPCS、2,4-D-HPCS对典型微生物的抑制作用
本发明提供了一种新型物质2,4-D-HPCS的制备方法，本发明的制备方法简单、成本低、提纯方法简便，得到的CS衍生物具有良好的水溶性、热稳定性和抗菌活性，对典型微生物大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均具有良好的抑制作用，在食品、农业等领域都有很好的应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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