一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法及其分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法及其分离纯化方法 (Preparation method of affinity chromatography medium for separating and purifying alpha-glucosidase and separation and purification method thereof ) 是由 阳文静 游清徽 孙晨松 蔡险峰 徐贤柱 王曼莹 徐婧然 陈妮 陈盈盈 杨尚祝 叶 于 2020-05-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法及其分离纯化α-葡萄糖苷酶的方法,所述亲和层析介质的制备方法包括以下步骤：S1、首先采用脱脂棉作为基质,经高碘酸钠溶液醛基化反应,制备得到醛基化脱脂棉；S2、其次将阿卡波糖作为亲和配基,偶联在步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉上,制备得到偶联产物；S3、再次采用硼氢化钠溶液还原步骤S2制备得到的偶联产物,制备得到稳定的亲和层析介质；S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质用蒸馏水洗涤抽干,储存在乙醇溶液中备用。本发明提供的制备方法原料容易获得、价格低廉、操作简单、提纯方法稳定可靠、具有很大的应用前景和良好的经济、社会效益。(The invention provides a preparation method of an affinity chromatography medium for separating and purifying alpha-glucosidase and a method for separating and purifying the alpha-glucosidase, wherein the preparation method of the affinity chromatography medium comprises the following steps: s1, firstly, adopting absorbent cotton as a substrate, and preparing aldehyde-based absorbent cotton through an aldehyde reaction of a sodium periodate solution; s2, coupling acarbose serving as an affinity ligand to the aldehyde absorbent cotton prepared in the step S1 to prepare a coupling product; s3, reducing the coupling product obtained in the step S2 by adopting a sodium borohydride solution again to prepare a stable affinity chromatography medium; s4, washing the affinity chromatography medium prepared in the step S3 with distilled water, draining, and storing in ethanol solution for later use. The preparation method provided by the invention has the advantages of easily obtained raw materials, low price, simple operation, stable and reliable purification method, great application prospect and good economic and social benefits.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法及其分离纯化α-葡萄糖苷酶的方法。
背景技术
α-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖基转移酶（α-glucosidase，EC.3.2.1.20），系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。α-葡萄糖苷酶能催化α-1,4-糖苷键水解，使小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解。通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可使葡萄糖的生成及吸收减缓，降低餐后血糖峰值，调整血糖水平，在调节糖代谢的同时也调节了脂肪的生成，因此α-葡萄糖苷酶抑制剂成为近年来生物技术领域的研究热点。
传统的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂方法主要是采用微生物（包括黑曲霉和酵母菌等）来源的商品化α-葡萄糖苷酶，这些酶与人体小肠的α-葡萄糖苷酶存在较大的差异性，并不完全适合用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。也有部分研究者采用动物小肠来源α-葡萄糖苷酶粗酶液，试图代替商品化α-葡萄糖苷酶，以保证研究结果更加合理。由于动物小肠来源α-葡萄糖苷酶粗酶液中存在的其他生物大分子特别是蛋白酶类会严重影响α-葡萄糖苷酶的稳定性，使其难以长期保存，所以限制了动物小肠来源α-葡萄糖苷酶的广泛应用。因此，快速高效地从动物小肠中分离纯化α-葡萄糖苷酶，排除其他生物大分子特别是蛋白酶类的影响，对于α-葡萄糖苷酶在科学研究中的应用具有重要意义。
亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点已成为酶和其他蛋白质最有效的分离纯化技术之一。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先采用脱脂棉作为基质，经高碘酸钠溶液醛基化反应，制备得到醛基化脱脂棉；
S2、其次采用阿卡波糖作为亲和配基，偶联在步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉上，制备得到偶联产物；
S3、再次采用硼氢化钠溶液还原步骤S2制备得到的偶联产物，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质用蒸馏水洗涤抽干，储存在乙醇溶液中备用。
其中，所述脱脂棉与所述高碘酸钠的质量比为100:1-5。
优选地，所述脱脂棉与所述高碘酸钠的质量比为100:1.5，100:2，100:2.5，100:3，100:3.5，100:4，100:4.5。
其中，所述醛基化脱脂棉与所述阿卡波糖的质量比为100:1-5。
优选地，所述醛基化脱脂棉与所述阿卡波糖的质量比为100:1.5，100:2，100:2.5，100:3，100:3.5，100:4，100:4.5。
其中，所述偶联产物与所述硼氢化钠的质量比为100:1-5。
优选地，所述偶联产物与所述硼氢化钠的质量比为100:1.5，100:2，100:2.5，100:3，100:3.5，100:4，100:4.5。
其中，所述步骤S1中，醛基化反应的温度为10-50℃，时间为0.5-5h，转速为50-500rpm。
其中，所述步骤S2中，偶联反应的温度为10-40℃，时间为2-30h，转速为50-500rpm。
其中，所述步骤S3中，还原反应的温度为2-6℃，时间为0.5-5h。
其中，所述步骤S4中，所述亲和层析介质储存的温度为2-6℃，所述乙醇溶液的浓度为70-75%。
本发明第二方面提供了一种分离纯化α-葡萄糖苷酶的方法，采用本发明第一方面提供的方法制备得到的亲和层析介质进行分离纯化，包括以下步骤：
（1）将亲和层析介质装入层析柱中，用蒸馏水平衡；
（2）将新鲜动物小肠排空内容物，用2-6℃的冰冷蒸馏水冲洗干净，冰浴下切开小肠，用薄竹片刮取小肠黏膜，加入1-3倍体积，温度为2-6℃的冰冷蒸馏水，匀浆，在温度为4℃，转速为8000rpm条件下，低温离心20 min，取上清液，得到α-葡萄糖苷酶粗酶液；
（3）将步骤（2）中得到的α-葡萄糖苷酶粗酶液加入层析柱中孵育10min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为1-1.5倍柱体积/h，洗脱2h，再使用浓度为1%麦芽糖溶液洗脱α-葡萄糖苷酶，流速为1-1.5倍柱体积/h，洗脱1h；
（4）将步骤（3）中得到的α-葡萄糖苷酶洗脱液装入截留分子量1500的透析袋，放入2-6℃的100倍体积的冰冷蒸馏水透析，每隔8小时换一次冰冷蒸馏水，共换3次；
（5）将步骤（4）中得到的α-葡萄糖苷酶溶液冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶冻干粉，称重后装瓶密封，-20℃冷冻保存。
本发明的有益效果：
亲和配基是亲和层析介质的核心，它决定了亲和层析分离的效率，本发明采用的是阿卡波糖。阿卡波糖结构类似寡糖，是一种“假寡糖”，对α-葡萄糖苷酶有很高的亲和力，可以与α-葡萄糖苷酶高效、可逆地结合，却并不能被α-葡萄糖苷酶水解，而且阿卡波糖所带伯氨基团容易与醛基发生偶联反应，并且可以硼氢化钠进一步还原形成稳定的共价键，此适合作为分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和配基。
本发明提供的用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，具有以下优点：
1、基质脱脂棉容易获得，价格低廉；
2、制备工艺具有操作简单、提纯方法稳定可靠、容易控制及对设备要求低的特点；
3、提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，具有很大的应用前景和良好的经济、社会效益。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取脱脂棉5g置于250mL的三角瓶中，加入50mL浓度为0.002g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为25℃，转速为150rpm进行醛基化反应2h，制备得到醛基化脱脂棉；
S2、将步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为 0.002g/mL的阿卡波糖溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为30℃，转速为150rpm进行偶联反应12h；
S3、再将步骤S2中制备得到的偶联阿卡波糖的脱脂棉转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.002g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为4℃的冰箱内，还原反应2h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于4℃储存在浓度为75%的乙醇溶液中备用。
采用上述方法制备得到的亲和层析介质分离纯化α-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：
（1）取上述方法制备得到的亲和层析介质装入层析柱（Φ2.0cm×10cm）中，用100mL蒸馏水平衡；
（2）将新鲜猪小肠排空内容物，用2-6℃的冰冷蒸馏水冲洗干净，冰浴下切开小肠，用薄竹片刮取小肠黏膜1mL，加入2mL的2-6℃的冰冷蒸馏水，匀浆，4℃，8000 rpm低温离心20min，取上清液，得到2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液；
（3）将步骤（2）中得到的2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为50mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%麦芽糖溶液洗脱α-葡萄糖苷酶，流速为50mL/h，洗脱1h；
（4）将步骤（3）中得到的洗脱液装入截留分子量1500的透析袋，放入2-6℃的5L冰冷蒸馏水透析，每隔8小时换一次冰冷蒸馏水，共换3次；
（5）将步骤（4）中得到的α-葡萄糖苷酶溶液冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶冻干粉，称重后装瓶密封，-20℃冷冻保存。
为了验证实施例1制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果，以实施例1制备得到的α-葡萄糖苷酶粗酶液和α-葡萄糖苷酶冻干粉为对象，测定α-葡萄糖苷酶的比活力，结果见表1。
表1 实施例1制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果
α-葡萄糖苷酶
总蛋白含量
比活力
总酶活
纯化倍数
得率
α-葡萄糖苷酶粗酶液
31.3mg
0.0372U/mg
1.16U
1
100%
α-葡萄糖苷酶冻干粉
0.821mg
1.29 U/mg
1.06U
34.7
91.4%
从表1可以看出，实施例1制备得到的亲和层析介质可以高效分离纯化α-葡萄糖苷酶，纯化倍数为34.6，得率为91.4%。
实施例2
本发明提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取脱脂棉5g置于250mL的三角瓶中，加入50mL浓度为0.003g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为30℃，转速为200rpm进行醛基化反应2h，制备得到醛基化脱脂棉；
S2、将步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为 0.003g/mL的阿卡波糖溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为30℃，转速为200rpm进行偶联反应12h；
S3、再将步骤S2中制备得到的偶联阿卡波糖的脱脂棉转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.003g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为4℃的冰箱内，还原反应2h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于4℃储存在浓度为75%的乙醇溶液中备用。
采用上述方法制备得到的亲和层析介质分离纯化α-葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤：
（1）取上述方法制备得到的亲和层析介质装入层析柱（Φ2.0cm×10cm）中，用100mL蒸馏水平衡；
（2）将新鲜猪小肠排空内容物，用2-6℃的冰冷蒸馏水冲洗干净，冰浴下切开小肠，用薄竹片刮取小肠黏膜1mL，加入2mL的2-6℃的冰冷蒸馏水，匀浆，4℃，8000 rpm低温离心20min，取上清液，得到2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液；
（3）将步骤（2）中得到的2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为50mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%麦芽糖溶液洗脱α-葡萄糖苷酶，流速为50mL/h，洗脱1h；
（4）将步骤（3）中得到的洗脱液装入截留分子量1500的透析袋，放入2-6℃的5L冰冷蒸馏水透析，每隔8小时换一次冰冷蒸馏水，共换3次；
（5）将步骤（4）中得到的α-葡萄糖苷酶溶液冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶冻干粉，称重后装瓶密封，-20℃冷冻保存。
为了验证实施例2制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果，以实施例2制备得到的α-葡萄糖苷酶粗酶液和α-葡萄糖苷酶冻干粉为对象，测定α-葡萄糖苷酶的比活力，结果见表2。
表2 实施例2制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果
α-葡萄糖苷酶
总蛋白含量
比活力
总酶活
纯化倍数
得率
α-葡萄糖苷酶粗酶液
32.8mg
0.0357U/mg
1.17U
1
100%
α-葡萄糖苷酶冻干粉
0.832mg
1.23U/mg
1.02U
34.5
87.2%
从表2可以看出，实施例2制备得到的亲和层析介质可以高效分离纯化α-葡萄糖苷酶，纯化（比活力提高）倍数为34.5，得率为87.2%。
实施例3
本发明提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取脱脂棉5g置于250mL的三角瓶中，加入50mL浓度为0.001g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为35℃，转速为300rpm进行醛基化反应3h，制备得到醛基化脱脂棉；
S2、将步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为 0.002g/mL的阿卡波糖溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为20℃，转速为250rpm进行偶联反应20h；
S3、再将步骤S2中制备得到的偶联阿卡波糖的脱脂棉转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.003g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为3℃的冰箱内，还原反应3h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于2℃储存在浓度为75%的乙醇溶液中备用。
采用上述方法制备得到的亲和层析介质分离纯化α-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：
（1）取上述方法制备得到的亲和层析介质装入层析柱（Φ2.0cm×10cm）中，用100mL蒸馏水平衡；
（2）将新鲜猪小肠排空内容物，用2-6℃的冰冷蒸馏水冲洗干净，冰浴下切开小肠，用薄竹片刮取小肠黏膜1mL，加入2mL的2-6℃的冰冷蒸馏水，匀浆，4℃，8000 rpm低温离心20min，取上清液，得到2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液；
（3）将步骤（2）中得到的2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为50mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%麦芽糖溶液洗脱α-葡萄糖苷酶，流速为50mL/h，洗脱1h；
（4）将步骤（3）中得到的洗脱液装入截留分子量1500的透析袋，放入2-6℃的5L冰冷蒸馏水透析，每隔8小时换一次冰冷蒸馏水，共换3次；
（5）将步骤（4）中得到的α-葡萄糖苷酶溶液冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶冻干粉，称重后装瓶密封，-20℃冷冻保存。
为了验证实施例3制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果，以实施例3制备得到的α-葡萄糖苷酶粗酶液和α-葡萄糖苷酶冻干粉为对象，测定α-葡萄糖苷酶的比活力，结果见表3。
表3 实施例3制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果
α-葡萄糖苷酶
总蛋白含量
比活力
总酶活
纯化倍数
得率
α-葡萄糖苷酶粗酶液
33.5mg
0.0351U/mg
1.18U
1
100%
α-葡萄糖苷酶冻干粉
0.846mg
1.23U/mg
1.04U
35.0
88.1%
从表3可以看出，实施例3制备得到的亲和层析介质可以高效分离纯化α-葡萄糖苷酶，纯化（比活力提高）倍数为35.0，得率为88.1%。
实施例4
本发明提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取脱脂棉5g置于250mL的三角瓶中，加入50mL浓度为0.004g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为40℃，转速为300rpm进行醛基化反应1h，制备得到醛基化脱脂棉；
S2、将步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为 0.003g/mL的阿卡波糖溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为25℃，转速为400rpm进行偶联反应10h；
S3、再将步骤S2中制备得到的偶联阿卡波糖的脱脂棉转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.002g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为5℃的冰箱内，还原反应2h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于2℃储存在浓度为70%的乙醇溶液中备用。
采用上述方法制备得到的亲和层析介质分离纯化α-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：
（1）取上述方法制备得到的亲和层析介质装入层析柱（Φ2.0cm×10cm）中，用100mL蒸馏水平衡；
（2）将新鲜猪小肠排空内容物，用2-6℃的冰冷蒸馏水冲洗干净，冰浴下切开小肠，用薄竹片刮取小肠黏膜1mL，加入2mL的2-6℃的冰冷蒸馏水，匀浆，4℃，8000 rpm低温离心20min，取上清液，得到2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液；
（3）将步骤（2）中得到的2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为50mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%麦芽糖溶液洗脱α-葡萄糖苷酶，流速为50mL/h，洗脱1h；
（4）将步骤（3）中得到的洗脱液装入截留分子量1500的透析袋，放入2-6℃的5L冰冷蒸馏水透析，每隔8小时换一次冰冷蒸馏水，共换3次；
（5）将步骤（4）中得到的α-葡萄糖苷酶溶液冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶冻干粉，称重后装瓶密封，-20℃冷冻保存。
为了验证实施例4制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果，以实施例4制备得到的α-葡萄糖苷酶粗酶液和α-葡萄糖苷酶冻干粉为对象，测定α-葡萄糖苷酶的比活力，结果见表4。
表4 实施例4制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果
α-葡萄糖苷酶
总蛋白含量
比活力
总酶活
纯化倍数
得率
α-葡萄糖苷酶粗酶液
32.9mg
0.0354U/mg
1.16U
1
100%
α-葡萄糖苷酶冻干粉
0.829mg
1.21U/mg
1.00U
34.2
86.2%
从表4可以看出，实施例4制备得到的亲和层析介质可以高效分离纯化α-葡萄糖苷酶，纯化（比活力提高）倍数为34.2，得率为86.2%。
实施例5
本发明提供了一种用于分离纯化α-葡萄糖苷酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取脱脂棉5g置于250mL的三角瓶中，加入50mL浓度为0.005g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为15℃，转速为450rpm进行醛基化反应5h，制备得到醛基化脱脂棉；
S2、将步骤S1制备得到的醛基化脱脂棉置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为 0.005g/mL的阿卡波糖溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为20℃，转速为350rpm进行偶联反应15h；
S3、再将步骤S2中制备得到的偶联阿卡波糖的脱脂棉转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.005g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为4℃的冰箱内，还原反应3h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于3℃储存在浓度为70%的乙醇溶液中备用。
采用上述方法制备得到的亲和层析介质分离纯化α-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：
（1）取上述方法制备得到的亲和层析介质装入层析柱（Φ2.0cm×10cm）中，用100mL蒸馏水平衡；
（2）将新鲜猪小肠排空内容物，用2-6℃的冰冷蒸馏水冲洗干净，冰浴下切开小肠，用薄竹片刮取小肠黏膜1mL，加入2mL的2-6℃的冰冷蒸馏水，匀浆，4℃，8000 rpm低温离心20min，取上清液，得到2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液；
（3）将步骤（2）中得到的2mL的α-葡萄糖苷酶粗酶液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为50mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%麦芽糖溶液洗脱α-葡萄糖苷酶，流速为50mL/h，洗脱1h；
（4）将步骤（3）中得到的洗脱液装入截留分子量1500的透析袋，放入2-6℃的5L冰冷蒸馏水透析，每隔8小时换一次冰冷蒸馏水，共换3次；
（5）将步骤（4）中得到的α-葡萄糖苷酶溶液冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶冻干粉，称重后装瓶密封，-20℃冷冻保存。
为了验证实施例5制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果，以实施例5制备得到的α-葡萄糖苷酶粗酶液和α-葡萄糖苷酶冻干粉为对象，测定α-葡萄糖苷酶的比活力，结果见表5。
表5 实施例5制备得到的亲和层析介质对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果
α-葡萄糖苷酶
总蛋白含量
比活力
总酶活
纯化倍数
得率
α-葡萄糖苷酶粗酶液
33.2mg
0.0348U/mg
1.16U
1
100%
α-葡萄糖苷酶冻干粉
0.835mg
1.22U/mg
1.01U
35.1
87.1%
从表5可以看出，实施例5制备得到的亲和层析介质可以高效分离纯化α-葡萄糖苷酶，纯化（比活力提高）倍数为35.1，得率为87.1%。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。