阅读说明：本技术 一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸亲和材料的制备方法 (Preparation method of agarose boric acid affinity material suitable for purifying fish tropomyosin ) 是由 曹立民 殷佳珞 郑洪伟 林洪 隋建新 王博成 于 2019-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分离技术领域,公开了一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸亲和材料的制备方法,本发明以3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸为功能单体,三(2-氨基乙基)胺为多支化配体,琼脂糖微球为基质材料,制备了一种新的琼脂糖硼酸亲和材料,并将其首次用于鱼类原肌球蛋白的分离纯化中,并用不同的鱼类样品确定了最佳使用条件。结果显示,当琼脂糖浓度为3％,上样平衡液pH为7.4,HAc洗脱液浓度为100mM时,所得原肌球蛋白纯度在90%以上,柱容量约为1.85mg/mL以上。与传统方法相比,此技术可以显著缩短纯化时间(从数天缩减至3-4h),且不使用有机溶剂,产物纯度与传统方法相当。(The invention relates to the technical field of separation, and discloses a preparation method of an agarose boric acid affinity material suitable for fish tropomyosin purification. As a result, it was found that, when the agarose concentration was 3%, the pH of the equilibrium loading solution was 7.4, and the concentration of the HAc eluent was 100mM, the purity of the tropomyosin obtained was 90% or more, and the column capacity was about 1.85mg/mL or more. Compared with the traditional method, the technology can remarkably shorten the purification time (from a plurality of days to 3-4h), does not use organic solvents, and has the product purity equivalent to that of the traditional method.)

一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸亲和材料的制 备方法

技术领域

本发明涉及分离技术领域，尤其涉及一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸亲 和材料的制备方法。

背景技术

食物过敏问题是目前公共卫生安全的主要问题之一，据WHO/IUIS过敏原数据库统计， 原肌球蛋白是许多无脊椎动物(如：虾、蟹、贝类)中的主要过敏原。然而，近几年来，一些鱼类(如：罗非鱼、安康鱼、蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、斑马鱼等)中的原肌球蛋白也被 报道具有致敏性，被认为是一种潜在的过敏原，从而引起了人们的广泛关注。因此，深入了 解原肌球蛋白在鱼类及其他水产品中的致敏机制，合理监测和标注不同食品中的原肌球蛋白， 对有效控制原肌球蛋白引发的过敏性安全问题来说极为重要。

高效的分离、纯化对于了解原肌球蛋白的物理、化学和生物特性具有十分重要的意义， 这也是建立诸如各种免疫测定等分析技术的关键过程。目前常用的提取纯化原肌球蛋白的方 法主要可分为以下几个步骤：首先，使用有机试剂提取以获得蛋白质粗提液，然后以蛋白质 粗提液为原料，采用硫酸铵盐析法或等电点沉淀法获得原肌球蛋白粗品，最后通常会使用层 析技术使原肌球蛋白得到进一步纯化。传统方法的样品处理量较高，但是整个过程耗时较长 (通常2-3天)、步骤较多，纯化效果常常因多步操作而变得不稳定，而且有机试剂的使用会 存在蛋白质变性的风险。因此，发展高效便捷的原肌球蛋白提取纯化方法具有十分重要的意 义。

硼亲和(BA)技术是一种选择性分离富集顺式二羟基化合物有效的手段。主要基于硼 亲和材料与顺式二羟化合物之间的可逆共价结合作用，其主要原理是利用硼酸在较高的pH 环境下(通常pH≥8.5)与顺式二羟基生物分子中的邻二羟基发生共价反应生成五元或六元 的环状化合物；当环境切换为酸性时(通常pH＜3.0)，四面体型的硼原子转化为平面型的硼 原子，此时反应生成的环状化合物发生解离，释放出顺式二羟基生物分子。

在硼亲和材料的制备中材料基质的选择较为关键，材料基质一般分为刚性无机介质和 多糖软质胶。刚性无机介质如硅胶、金属氧化物、多孔玻璃等具有力学强度理想，柱效高等 优点，目前已有报道显示，古淑青等人已利用整体硅胶柱结合苯硼酸集团纯化了巧克力中的 花生、牛奶、大豆、坚果中的主要过敏原。但是，这类基质的非特异性吸附强，应用pH范 围较窄，生物相容性不佳，上述报道中用到的硼亲和材料其上样pH值较高(pH＝11)，在此 pH环境中可能会导致蛋白质变性，大大限制了材料在生物样本中的使用范围。多糖软质胶类 包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖等，其中琼脂糖因其具有理化稳定性、易于修饰性、低毒性及 生物相容性，是应用较广泛的一类分离介质。

本申请人的在先专利CN201811039827.8公开了一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲 和材料的制备方法及其应用，制备方法包括：1)琼脂糖微球的制备；2)环氧化琼脂糖的制备； 3)环氧化琼脂糖的氨基化修饰；4)苯硼酸琼脂糖的制备。该发明制备的基于琼脂糖基的高 柱容量高生物相容性硼亲和材料，其中琼脂糖被选作为基架，聚乙烯亚胺作为超支化配基进 行修饰，同时3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸作为亲和基团。该发明克服了一系列技术问题，成功 将硼亲和材料应用于细胞水平的识别与分离。但是该方法制备所得的亲和材料只是适用于细 菌的分离，将其用于鱼类原肌球蛋白纯化并不能获得理想的效果。原因在于该材料选用聚乙 烯亚胺作为超支化配基，以期增加苯硼酸的修饰率，提高细菌的富集量，但是与本发明方法 中所用的(三(2-氨基乙基)胺相比，修饰完成后的材料表面会有更多裸露氨基，将其应用在复 杂鱼类样本原肌球蛋白的纯化中，会造成大量非特异性吸附，不能得到较高纯度的原肌球蛋 白。综上，有必要开发出中一种专用于鱼类原肌球蛋白纯化的亲和材料。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸 亲和材料的制备方法，本发明以琼脂糖微球作为基质，将其依次进行环氧基、氨基化及硼基 团的修饰。采用三(2-氨基乙基)胺作为多支化配基，硼亲和能力强、pKa值(6.5)低的3，5- 二氟-4-甲酰基苯硼酸为亲和基团，通过优化琼脂糖微球的制备、上样pH环境、洗脱pH环境 等条件得到柱效高、吸附分离性能良好的琼脂糖硼酸亲和材料，并将其首次应用到牙鲆鱼、 罗非鱼、安康鱼及蓝鳍金枪鱼原肌球蛋白的分离纯化中。与传统方法相比，采用本发明硼亲 和材料对鱼类原肌球蛋白进行纯化，可以显著缩短纯化时间(从数天缩减至3-4h)，且不使用 有机溶剂，产物纯度与传统方法相当。

本发明的具体技术方案为：一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸亲和材料的 制备方法，包括以下步骤：

1)琼脂糖微球的制备：将浓度为1.5-4wt％的琼脂糖水溶液加热至完全溶解作为水相；按14-18 g/400mL的比例将司盘80加入到液体石蜡中，在75-85℃恒温水浴中搅拌均匀后作为油相； 在持续搅拌下，按体积比1∶6-6.5将水相加入油相，随后冷却至室温，并持续搅拌使微球成型； 将所得微球分别用石油醚、异丙醇及超纯水于布氏漏斗中真空抽洗，得到琼脂糖微球，置于 乙醇溶液中保存备用。

2)琼脂糖微球的环氧化：以5g琼脂糖微球计，称取5g琼脂糖微球置于容器中，加入0.8-1.0mol/LNaOH 45-55mL；0.4-0.6g/LNaBH₄ 45-55mL以及35-45mL环氧氯丙烷，于35-45℃下震荡活化3-5h，随后置于布氏漏斗中，用去离子水真空抽滤冲洗至中性，冲洗液加 入硫代硫酸钠以及酚酞不显色为止；制得环氧化琼脂糖微球。

3)环氧化琼脂糖微球的氨基化：取5给环氧化琼脂糖微球与1.8-2.2mL(三(2-氨基乙 基)胺和18-22mL乙腈充分混合，在55-65℃下搅拌进行氨基化反应10-14h，得到氨基化琼脂 糖微球。

4)琼脂糖硼酸亲和材料的制备：将步骤3)所得3g氨基化琼脂糖微球分别用甲醇和乙腈冲洗；随后取18-22mL甲醇与氨基化琼脂糖微球混合，超声后依次加入290-310mg 3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和580-620mg氰基硼氢化钠，常温下搅拌反应2.5-3.5d，所得产物在抽 滤装置中用无水甲醇，4-6wt％碳酸氢钠，4-6wt％氯化钠和去离子水冲洗。

作为优选，步骤1)中，所述琼脂糖水溶液的浓度为3wt％。

本发明团队在研究中发现，琼脂糖的浓度对琼脂糖微球的内部结构有着显著的影响。 以牙鲆鱼肉粗提液为样品考察琼脂糖的浓度对原肌球蛋白纯化效果的影响，实验结果显示， 当琼脂糖浓度为1.5％，2.5％，3.0％和4.0％时，洗脱液中原肌球蛋白的纯度分别约为95％， 93％，92％和86％，亲和柱的柱容量分别约为1.56mg/ml，1.87mg/ml，1.92mg/ml和1.77 mg/ml。洗脱液中原肌球蛋白的纯度会随着琼脂糖浓度的增加而呈轻微降低趋势，经分析，这 是由于当琼脂糖浓度较低时，所制得的琼脂糖微球粒径较小，比表面积更大，硼基团的修饰 量增加，从而提高了亲和柱对原肌球蛋白的特异性吸附能力。当琼脂糖的浓度增加时，琼脂 糖溶液的粘度增加，从而导致琼脂糖微球制备时液滴在油相中的分散性降低，粒径增大且均 匀度也有所降低，这可能对琼脂糖微球的分子筛功能产生不利影响，从而降低了亲和柱的纯 化效果。但是，在柱容量方面，当琼脂糖溶液浓度低于3％时，实验过程中会产生柱压高、流 通性差的现象，这导致与柱子结合的原肌球蛋白不能完全洗脱，从而降低了亲和柱的柱容量。 因此，综合原肌球蛋白纯度与柱容量两方面因素，3％的琼脂糖浓度是为最佳条件。

作为优选，步骤1)中，第一次持续搅拌的转速为800-1200rpm；第二次持续搅拌的转速为600-1000rpm，第二次搅拌时间3-7min。

作为优选，步骤1)中，所述石油醚、异丙醇及超纯水的用量比为(2-4)∶(2-4)∶(3-5)；所 述乙醇溶液的浓度为15-25wt％，保存备用温度为1-5℃。

作为优选，步骤2)中，所述NaBH₄浓度为0.5g/L，NaOH浓度为0.9mol/L，环氧 氯丙烷的添加量为40mL，震荡活化时间为4h。

琼脂糖硼酸亲和材料修饰的基础是环氧基基团的修饰，本发明团队在研究中发现，环 氧基基团的密度与硼亲和基团的修饰密切相关，环氧基密度的提高有助于硼亲和基团的增加， 从而可以提高亲和柱的柱容量及纯化能力。本研究考察了NaOH的浓度、NaBH₄的浓度、环 氧氯丙烷的添加量及反应时间对环氧基密度的影响，实验结果显示，在NaBH₄浓度为0.5g/L， NaOH浓度为0.9mol/L，环氧氯丙烷的添加量为40％，反应时间为4h时，琼脂糖微球表面 的环氧基密度最高可达151.74μmol/g。将修饰后的琼脂糖硼亲和材料的形态进行了扫描电子 显微镜(SEM)表征，表征结果显示所得材料表面光滑、无明显裂痕及碎片附着，材料粒径 较为均匀，从SEM图像中随机选择200个微球进行测量，其尺寸分布在40-160μm之间。

作为优选，步骤4)中，将所得3g氨基化琼脂糖微球分别用甲醇和乙腈冲洗；随后取18-22mL甲醇与氨基化琼脂糖微球混合，超声后依次加入290-310mg 3，5-二氟-4-甲酰基苯 硼酸和580-620mg氰基硼氢化钠，常温下搅拌反应2.5-3.5d，随后加入1.5-2.5mL甲醛溶液 及450-550mg氰基硼氢化钠，常温下继续搅拌反应46-50h，所得产物在抽滤装置中用无水 甲醇，4-6wt％碳酸氢钠，4-6wt％氯化钠和去离子水冲洗。

本发明团队发现，步骤4)按照前述方案效果还有进一步提升空间。为此，在经过大量试验后，在原有基础上增加了甲醛、氰基硼氢化钠的修饰，目的是封闭未修饰上3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸的裸露氨基基团，从而减少因残留氨基带来的非特异性吸附，提高所得原肌 球蛋白的纯度。

作为优选，步骤4)中，所述甲醇和乙腈的用量比均为35-45mL；所述无水甲醇、碳酸氢钠、氯化钠和去离子水的用量为35-45mL、18-22mL、18-22mL和27-33mL。

一种鱼类原肌球蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

A)鱼肉样品的前处理：称取1.8-2.2g绞碎鱼肉样品，加入6-10mL pH＝6.5-9的磷酸盐缓冲 液均质后静置1.5-2.5h；将所得混合物在沸水浴中加热13-17min后冷却至室温，随后离心处 理，所得上清液即为鱼肉粗提液。

B)琼脂糖硼酸亲和柱的制备：量取0.8-1.2mL权利要求1-5之一所述琼脂糖硼酸亲和 材料填充至SPE柱中，并在填料的上下两端放置垫片，将装有填料的SPE柱连接到蛋白纯化 仪上。

C)鱼类原肌球蛋白的纯化：首先，pH＝6.5-9的磷酸盐缓冲液以0.4-0.6mL/min的流速 预洗亲和柱25-35min；待蛋白纯化仪信号稳定后，将2.8-3.2mL鱼肉粗提液以0.3-0.5mL/min 的流速过柱纯化；然后，用pH＝6.5-9的磷酸盐缓冲液以0.3-0.5mL/min的流速洗去未与亲和 柱结合的非特异性吸附杂质；最后，用25-150mM HAc以0.3-0.5mL/min的流速进行洗脱， 收集洗脱液，超声水洗，透析冻干，保存备用。

作为优选，步骤A)和步骤C)中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；且步骤C)中， 所述HAc的浓度为100nM。

本发明团队在研究中发现，在大多数情况下，硼酸亲和配体与顺式二羟基化合物之间 的可逆共价反应结合力取决于上样的pH环境。通常，当环境的pH值高于硼酸的pKa值时， 硼酸亲和配体才会展现其亲和能力。在本发明的实验中，当上样平衡液(磷酸盐缓冲液)的 pH值范围为6.5至9.0时，洗脱液中原肌球蛋白纯度分别约为81％，82％，89％，66％和54％， 柱容量分别约为1.70mg/mL，1.76mg/mL，1.88mg/mL，0.57mg/mL和0.54mg/mL。综合来看， pH 7.4为上样平衡液的最佳条件。实验结果显示，当pH值逐渐增加时(从6.5到7.4)琼脂 糖硼酸亲和柱的分离纯化能力也逐渐增加，这可以归因于硼亲和配基的基本亲和性能。但是， 当pH值高于8.0时，亲和柱的分离纯化能力反而呈现下降趋势，这可能源于原肌球蛋白的 pKa值、硼酸配体的亲和能力及离子强度等多种因素之间的复杂相互作用。例如，增加上样 环境的pH值可以促进硼酸配体的特异性亲和能力，但是另一方面，随着pH的增加，环境中 的离子作用力增强，一些负电荷的存在使得亲和柱对原肌球蛋白具有一定的排斥作用。

本发明团队还发现，洗脱条件对琼脂糖硼酸亲和柱的应用也起着至关重要的作用。当 HAc浓度的范围为25mM至150mM时，洗脱液中原肌球蛋白的纯度分别约为89％，88％，93％，86％和83％，相应的柱容量分别为约1.01mg/mL，1.31mg/mL，1.94mg/mL，1.87mg/mL和1.91mg/mL。当HAc浓度小于100mM时，原肌球蛋白似乎不能从柱中完全洗脱，而当浓 度高于100mM时，一些非特异性吸附的蛋白也被洗脱。综合考虑原肌球蛋白的纯度及柱容 量，HAc洗脱液的最适浓度为100mM。

作为优选，步骤A)中，离心条件为：4000-5000rpm，8-12min。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明以3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸为功能单 体，三(2-氨基乙基)胺为多支化配体，琼脂糖微球为基质材料，制备了一种新的琼脂糖硼 酸亲和柱，并将这种亲和柱首次用于鱼类原肌球蛋白的分离纯化中，并用不同的鱼类样品验 证了该亲和柱的最佳使用条件，建立了一种新的纯化体系。实验结果显示，当琼脂糖浓度为 3％，上样平衡液pH为7.4，HAc洗脱液浓度为100mM时，所得到的原肌球蛋白纯度在90％ 以上，柱容量约为1.85mg/mL以上。与传统方法相比，此技术可以显著缩短纯化时间，简 化纯化步骤，在分离原肌球蛋白和其他过敏原方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明琼脂糖硼亲和材料的制备过程图；

图2为琼脂糖微球环氧基修饰条件影像图；其中，a.NaBH₄浓度对微球表面环氧基密度的影 响，b.NaOH浓度对微球表面环氧基密度的影响，c.环氧氯丙烷添加量对微球表面环氧基密 度的影响，d.反应时间对微球表面环氧基密度的影响；

图3为琼脂糖硼酸亲和材料的表征图；其中，a.琼脂糖硼酸亲和材料扫描电镜表征，b.琼脂 糖硼酸亲和材料元素含量表征，c.琼脂糖硼酸亲和材料红外光谱表征：(a)未修饰的琼脂糖 微球，(b)氨基化修饰的琼脂糖材料，(c)琼脂糖硼酸亲和材料；

图4为不同琼脂糖浓度对原肌球蛋白纯化的影响图；其中，a.1.5％琼脂糖浓度b.2.5％琼脂糖 浓度c.3％琼脂糖浓度d.4％琼脂糖浓度；M：蛋白分子量标准，泳道1：鱼肉粗提液，泳道 2：上样流出液，泳道3-5：淋洗液，泳道6：洗脱液；

图5为不同上样平衡液pH值对原肌球蛋白纯化的影响图；其中，a.pH 6.5上样平衡液b.pH 7.0上样平衡液c.pH 7.4上样平衡液d.pH 8.0上样平衡液e.pH 9.0上样平衡液；M：蛋白 分子量标准，泳道1：鱼肉粗提液，泳道2：稀释2倍鱼肉粗提液，泳道3：上样流出液，泳 道4-5：淋洗液，泳道6：洗脱液；

图6为不同浓度HAc洗脱液对原肌球蛋白纯化的影响图；其中，a.25mM HAc洗脱液，b.75mM HAc洗脱液，c.100mM HAc洗脱液，d.125mM HAc洗脱液，e.150mM HAc洗脱液； M：蛋白分子量标准，泳道1：鱼肉粗提液，泳道2：上样流出液，泳道3-4：淋洗液，泳道 5：洗脱液；

图7为琼脂糖硼酸亲和柱对纯化四种鱼类(牙鲆鱼、蓝鳍金枪鱼、罗非鱼、安康鱼)中原肌 球蛋白的应用；其中，M：蛋白分子量标准，泳道1：牙鲆鱼肉粗提液，泳道2：牙鲆鱼肉洗脱液，泳道3：蓝鳍金枪鱼粗提液，泳道4：蓝鳍金枪鱼洗脱液，泳道5：罗非鱼粗提液，泳 道6：罗非鱼洗脱液，泳道7：安康鱼粗提液，泳道8：安康鱼洗脱液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种适应于鱼类原肌球蛋白纯化的琼脂糖硼酸亲和材料的制备方法，包括以下步骤(如图1 所示)：

1)琼脂糖微球的制备：将浓度为1.5-4wt％的琼脂糖水溶液加热至完全溶解作为水相；按14-18 g/400mL的比例将司盘80加入到液体石蜡中，在75-85℃恒温水浴中搅拌均匀后作为油相； 在持续搅拌(800-1200rpm)下，将水相加入油相(体积比油相∶水相＝6-6.5∶1)，随后冷却 至室温，并持续搅拌(600-1000rpm，3-7min)使微球成型；将所得微球分别用石油醚、异丙 醇及超纯水(石油醚、异丙醇及超纯水的用量比为(2-4)∶(2-4)∶(3-5))于布氏漏斗中真空抽洗， 得到琼脂糖微球，置于15-25wt％乙醇溶液中1-5℃保存备用。

2)琼脂糖微球的环氧化：以5g琼脂糖微球计，步骤2)具体为：称取5g琼脂糖微 球置于容器中，加入0.8-1.0mol/L NaOH 45-55mL；0.4-0.6g/L NaBH₄ 45-55mL以及35-45mL环氧氯丙烷，于35-45℃下震荡活化3-5h，随后置于布氏漏斗中，用去离子水真空抽滤冲洗至中性，冲洗液加入硫代硫酸钠以及酚酞不显色为止；制得环氧化琼脂糖微球。

3)环氧化琼脂糖微球的氨基化：取5g环氧化琼脂糖微球与1.8-2.2mL(三(2-氨基乙 基)胺和18-22mL乙腈充分混合，在55-65℃下搅拌进行氨基化反应10-14h，得到氨基化琼脂 糖微球。

4)琼脂糖硼酸亲和材料的制备：将步骤3)所得3g氨基化琼脂糖微球分别用35-45mL 甲醇和35-45mL乙腈冲洗；随后取18-22mL甲醇与氨基化琼脂糖微球混合，超声后依次加 入290-310mg 3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和580-620mg氰基硼氢化钠，常温下搅拌反应2.5-3.5d，所得产物在抽滤装置中用35-45mL无水甲醇，18-22mL 4-6wt％碳酸氢钠，18-22mL 4-6wt％氯化钠和27-33mL去离子水冲洗。

可选地，步骤4)中，将所得3g氨基化琼脂糖微球分别用甲醇和乙腈冲洗；随后取18-22mL甲醇与氨基化琼脂糖微球混合，超声后依次加入290-310mg 3，5-二氟-4-甲酰基苯硼 酸和580-620mg氰基硼氢化钠，常温下搅拌反应2.5-3.5d，随后加入1.5-2.5mL甲醛溶液及 450-550mg氰基硼氢化钠，常温下继续搅拌反应46-50h，所得产物在抽滤装置中用无水甲醇， 4-6wt％碳酸氢钠，4-6wt％氯化钠和去离子水冲洗。

一种鱼类原肌球蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

A)鱼肉样品的前处理：称取1.8-2.2g绞碎鱼肉样品，加入6-10mL pH＝6.5-9的磷酸盐缓冲 液均质后静置1.5-2.5h；将所得混合物在沸水浴中加热13-17min后冷却至室温，随后离心处 理(离心条件为：4000-5000rpm，8-12min)，所得上清液即为鱼肉粗提液。

B)琼脂糖硼酸亲和柱的制备：量取0.8-1.2mL权利要求1-5之一所述琼脂糖硼酸亲和 材料填充至SPE柱中，并在填料的上下两端放置垫片，将装有填料的SPE柱连接到蛋白纯化 仪上。

C)鱼类原肌球蛋白的纯化：首先，pH＝6.5-9的磷酸盐缓冲液以0.4-0.6mL/min的流速 预洗亲和柱25-35min；待蛋白纯化仪信号稳定后，将2.8-3.2mL鱼肉粗提液以0.3-0.5mL/min 的流速过柱纯化；然后，用pH＝6.5-9的磷酸盐缓冲液以0.3-0.5mL/min的流速洗去未与亲和 柱结合的非特异性吸附杂质；最后，用25-150mM HAc以0.3-0.5mL/min的流速进行洗脱， 收集洗脱液，超声水洗，透析冻干，保存备用。

实施例

材料与仪器

琼脂糖干粉(上海麦克林生化科技有限公司)，环氧氯丙烷(国药集团化学试剂有限公司)， 三(2-氨基乙基)胺(上海麦克林生化科技有限公司)，3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸(上海源叶生 物科技有限公司)，SDS-PAGE试剂盒(索莱宝公司)，SPE空柱(上海安谱实验科技股份有 限公司)，所有化学试剂均为分析级，牙鲆鱼、蓝鳍金枪鱼、安康鱼(购自青岛利群超市)， 罗非鱼(购自广州农贸市场)

傅里叶近红外(FT-IR)系统(赛默飞世尔科技公司)，TEM透射电镜系统，恒温搅拌水浴锅、 蛋白纯化仪(上海青浦沪西仪器厂)、DY12Y-电泳仪(北京市六一仪器厂)。

琼脂糖硼酸亲和材料的制备

琼脂糖微球采用反向包埋法制备，浓度为3％的琼脂糖水溶液加热至完全溶解作为水相；16g 司盘80加入到400mL的液体石蜡中，在80℃恒温水浴锅中搅拌均匀后作为油相。持续搅 拌(1200rpm)下，将琼脂糖溶液缓慢加入油相(体积比油相∶水相＝6-6.5∶1)，随后冷却至 室温，并800rpm持续搅拌5min使微球成型。制得的微球分别用30mL石油醚、30mL异 丙醇及40mL超纯水于布氏漏斗中真空抽洗，置于20％的乙醇中4℃保存备用。

准确称取5g琼脂糖微球置于锥形瓶中，加入0.9mol/L NaOH 50mL；0.5g/L NaBH₄50 mL以及40mL环氧氯丙烷并置于恒温振荡器中，40℃震荡活化4hrs，随后置于布氏漏斗中， 用去离子水真空抽滤冲洗至中性，冲洗液加入硫代硫酸钠以及酚酞不显色为止。微球表面的 环氧基密度基于硫代硫酸钠法测定，称取抽干的微球0.5g置于磨口锥形瓶中并加入约 3mL 1.3mol/L硫代硫酸钠和1～2滴酚酞指示剂，锥形瓶封口后于室温下振荡反应30min。反应后的溶液用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定，直至溶液由红色变为无色为止。 由下式(1)计算环氧基修饰密度，其中，S为环氧基修饰密度(μmol/g)，C_HCl为HCl浓度 (mol/L)，V₀、V₁为滴定前、后HCl的体积(mL)，m为活化微球质量(g)：

环氧化后的琼脂糖微球与2mL(三(2-氨基乙基)胺，20mL乙腈充分混合，在60℃下轻微搅 拌反应12hrs，即完成氨基化修饰，修饰完成后的氨基化琼脂糖微球分别用40mL甲醇和40 mL乙腈冲洗。随后，取20mL甲醇与氨基化琼脂糖混合，超声后依次加入300mg 3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和600mg氰基硼氢化钠，常温下轻微搅拌反应72hrs(在此可选择加入1.5-2.5 mL甲醛溶液及450-550mg氰基硼氢化钠，常温下继续搅拌反应46-50h)，所得产物在抽滤 装置中用40mL无水甲醇，20mL 5％碳酸氢钠，20mL 5％氯化钠和30mL去离子水冲洗。琼脂糖硼酸亲和材料的形态结构通过扫描电子显微镜(SEM)进行表征(此工作委托青岛大学医学院松山医院完成)。琼脂糖硼酸亲和材料的表面功能基团采用傅里叶红外变换光谱仪进行 表征(TESCAN，Brno，The Czech Republic)，将样品与溴化钾粉末按照1∶7的比例混合均匀， 然后压成透明薄片，在波长为400-4000cm^-1的条件下扫描40次。

鱼肉样品的前处理

称取2g绞碎鱼肉样品，加入8mL 0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)高速均质后静置2hrs。将混合物在沸水浴中加热15min后冷却至室温，随后4000rpm离心10min，得到的上清液即为鱼肉粗提液。

琼脂糖硼酸亲和柱的制备及使用

准确量取1mL琼脂糖硼酸亲和材料填充至SPE柱(3mL)中，并在填料的上下两端放置垫片，将装有填料的SPE柱连接到蛋白纯化仪上。首先，平衡缓冲液(0.01M磷酸盐缓冲液， pH7.4)以0.5mL/min的流速预洗亲和柱30min。待蛋白纯化仪信号稳定后，将3mL鱼肉粗 提液以0.4mL/min的流速缓慢过柱纯化。然后，用0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)以0.4mL/min 的流速洗去未与亲和柱结合的非特异性吸附杂质。最后，用100mM HAc以0.4mL/min的流 速进行洗脱，依次收集流出液、淋洗液及洗脱液组分，并在4℃保存以便后续分析使用。采 用考马斯亮蓝法对各组分(流出液、淋洗液、洗脱液)进行蛋白浓度测定，使用SDS-PAGE 对各组分的蛋白质组成进行分析。

为研究琼脂糖浓度对亲和柱纯化能力的影响，将0.96g，1.6g，2.0g和2.5g琼脂糖粉 末分别溶于64mL去离子水中，形成1.5％，2.5％，3％和4％的琼脂糖溶液。然后，根据前文 的方法，制备具有不同琼脂糖浓度的硼亲和材料并填充至SPE柱中，以牙鲆鱼肉为样品，探 究其对原肌球蛋白的纯化效果。

为研究上样平衡液pH对亲和柱纯化效果的影响，分别配制pH 6.5，pH 7.0，pH7.4， pH 8.0，pH 9.0的磷酸盐平衡液(0.01M)，采用蛋白纯化仪对等量的牙鲆鱼肉粗提液进行在 线纯化处理。通过测定洗脱液的蛋白质含量及原肌球蛋白的纯度，分析不同pH上样平衡液 对纯化效果的影响，确定最适上样平衡液pH。

为研究洗脱液浓度对亲和柱纯化效果的影响，取等量的牙鲆鱼肉粗提液过柱，并用 0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)淋洗，最后，用不同浓度(25mM，75mM，100mM，125mM，150mM)的HAc洗脱液进行洗脱，收集洗脱液组分并测定其蛋白含量及原肌球蛋白的纯度，确定最佳洗脱液浓度。

结果与讨论

琼脂糖硼酸亲和材料的制备与表征

琼脂糖硼酸亲和材料修饰的基础是环氧基基团的修饰，本发明团队发现，环氧基基团的密度 与硼亲和基团的修饰密切相关，环氧基密度的提高有助于硼亲和基团的增加，从而可以提高 亲和柱的柱容量及纯化能力。本研究考察了NaOH的浓度、NaBH₄的浓度、环氧氯丙烷的添 加量及反应时间对环氧基密度的影响，实验结果显示，在NaBH₄浓度为0.5g/L，NaOH浓度 为0.9mol/L，环氧氯丙烷的添加量为40％，反应时间为4hrs时，琼脂糖微球表面的环氧基 密度最高可达151.74μmol/g(图2)。

将修饰后的琼脂糖硼亲和材料的形态进行了扫描电子显微镜(SEM)表征，表征结果 如图3a所示，该材料表面光滑、无明显裂痕及碎片附着，材料粒径较为均匀，从SEM图像中随机选择200个微球进行测量，其尺寸分布在40-160μm之间。

此外，为判断琼脂糖硼亲和材料的修饰效果，对修饰后的材料分别进行了元素测定及 FT-IR红外光谱表征。元素分析结果显示，琼脂糖硼亲和材料中硼元素的相对质量为4.74％ (m/m)(图3b)，从元素构成方面显示琼脂糖硼亲和材料修饰成功。图3c的FT-IR红外光 谱显示，在光谱(a)中，3436cm^-1处较弱的振动峰及2900cm^-1处的较强振动峰分别为琼脂糖凝胶微球的-O-H基团振动和饱和-C-H基团的伸缩振动。经三(2-氨基乙基)胺修饰后，FT-IR 光谱(b)显示在1340-1559cm^-1处有-NH₂基团的平面弯曲振动，这表明琼脂糖微球表面成功 修饰上-NH₂基团。在光谱(c)中，1500-1650cm^-1范围内有苯环振动峰，在3051cm^-1处有芳香烃C-H骨架伸展振动峰，在1342cm^-1处有B-O基团振动峰，这些结果共同表明琼脂糖微球表面已成功修饰上硼亲和基团。综上所述，琼脂糖硼酸亲和材料修饰成功。

琼脂糖硼酸亲和纯化体系的建立、优化及评价

本发明团队在研究中发现，琼脂糖的浓度对琼脂糖微球的内部结构有着显著的影响，是琼脂 糖凝胶色谱的重要考察因素之一。以牙鲆鱼肉粗提液为样品考察琼脂糖的浓度对原肌球蛋白 纯化效果的影响，实验结果显示，当琼脂糖浓度为1.5％，2.5％，3.0％和4.0％时，洗脱液中 原肌球蛋白的纯度分别约为95％，93％，92％和86％，亲和柱的柱容量分别约为1.56mg/ml， 1.87mg/ml，1.92mg/ml和1.77mg/ml(图4，泳道6，分子量为36kDa)。洗脱液中原肌球蛋 白的纯度会随着琼脂糖浓度的增加而呈轻微降低趋势，这是由于当琼脂糖浓度较低时，所制 得的琼脂糖微球粒径较小，比表面积更大，硼基团的修饰量增加，从而提高了亲和柱对原肌 球蛋白的特异性吸附能力。当琼脂糖的浓度增加时，琼脂糖溶液的粘度增加，从而导致琼脂 糖微球制备时液滴在油相中的分散性降低，粒径增大且均匀度也有所降低，这可能对琼脂糖 微球的分子筛功能产生不利影响，从而降低了亲和柱的纯化效果。但是，在柱容量方面，当 琼脂糖溶液浓度低于3％时，实验过程中会产生柱压高、流通性差的现象，这导致与柱子结合 的原肌球蛋白不能完全洗脱，从而降低了亲和柱的柱容量。因此，综合原肌球蛋白纯度与柱 容量两方面因素，选取3％的琼脂糖浓度作为最佳条件应用于接下来的实验中。

在大多数情况下，硼酸亲和配体与顺式二羟基化合物之间的可逆共价反应结合力取决 于上样的pH环境。通常，当环境的pH值高于硼酸的pKa值时，硼酸亲和配体才会展现其亲 和能力。在本实验中，当上样平衡液的pH值范围为6.5至9.0时，洗脱液中原肌球蛋白纯度 分别(图5，泳道6，分子量为36kDa)约为81％，82％，89％，66％和54％，柱容量分别约 为1.70mg/mL，1.76mg/mL，1.88mg/mL，0.57mg/mL和0.54mg/mL。综合来看，pH 7.4为上 样平衡液的最佳条件。实验结果显示，当pH值逐渐增加时(从6.5到7.4)琼脂糖硼酸亲和 柱的分离纯化能力也逐渐增加(图5a、b、c，泳道6，分子量为36kDa)，这可以简单地归 因于硼亲和配基的基本亲和性能。但是，当pH值高于8.0时，亲和柱的分离纯化能力反而呈 现下降趋势(图5d、e，泳道6，分子量为36kDa)，这可能源于原肌球蛋白的pKa值、硼酸 配体的亲和能力及离子强度等多种因素之间的复杂相互作用。例如，增加上样环境的pH值 可以促进硼酸配体的特异性亲和能力，但是另一方面，随着pH的增加，环境中的离子作用 力增强，一些负电荷的存在使得亲和柱对原肌球蛋白具有一定的排斥作用。

洗脱条件对琼脂糖硼酸亲和柱的应用也起着至关重要的作用。当HAc浓度的范围为 25mM至150mM时，洗脱液中原肌球蛋白的纯度分别(图6，泳道5，MW 36kDa)约为 89％，88％，93％，86％和83％，相应的柱容量分别为约1.01mg/mL，1.31mg/mL，1.94mg/mL，1.87mg/mL和1.91mg/mL。当HAc浓度小于100mM时，原肌球蛋白似乎不能从柱中完全洗 脱，而当浓度高于100mM时，一些非特异性吸附的蛋白也被洗脱。综合考虑原肌球蛋白的 纯度及柱容量，HAc洗脱液的最适浓度为100mM。

其他鱼类样品的验证

将优化后的琼脂糖硼酸亲和纯化体系应用到牙鲆鱼、蓝鳍金枪鱼、罗非鱼、安康鱼四种不同 鱼类样品原肌球蛋白的纯化中，其洗脱液中原肌球蛋白的纯度(图7)分别约为93％，95％， 89％和91％，柱容量分别约为1.95mg/mL，1.88mg/mL，1.93mg/mL和1.91mg/mL。与之前报 道的原肌球蛋白纯化方法(表1)相比，新建立的纯化体系可应用于多种鱼类样品，可达到 与传统方法相似的原肌球蛋白纯度，并且可以显著缩短纯化时间(从至少1-2天到3-4小时)， 简化纯化步骤(从至少5个步骤到3个步骤)，具有非常好的生物相容性(在纯化过程中不引 入任何有机试剂)。

表1原肌球蛋白纯化方法对比表

结论

本发明以3，5-二氟-4-甲酰基苯硼酸为功能单体，三(2-氨基乙基)胺为多支化配体，琼脂糖 微球为基质材料，制备了一种新的琼脂糖硼酸亲和柱，并将这种亲和柱首次用于鱼类原肌球 蛋白的分离纯化中，并用不同的鱼类样品验证了该亲和柱的最佳使用条件，建立了一种新的 纯化体系。实验结果显示，当琼脂糖浓度为3％，上样平衡液pH为7.4，HAc洗脱液浓度为100mM时，所得到的原肌球蛋白纯度在90％以上，柱容量约为1.85mg/mL以上。与传统方 法相比，此技术可以显著缩短纯化时间，简化纯化步骤，在分离原肌球蛋白和其他过敏原方 面具有广阔的应用前景。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技 术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的 保护范围。