阅读说明：本技术 作为富水色谱固定相的离子液体桥联杂化氧化硅及其制备方法与应用 (Ionic liquid bridged hybrid silicon oxide as water-rich chromatographic stationary phase and preparation method and application thereof ) 是由 陈桐 宋广三 肖震 李炳祥 徐亮 徐虹 沈伟健 杨敏 吴艳玲 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种作为富水色谱固定相的离子液体桥联杂化氧化硅及其制备方法与应用。本发明提供了一种新的环境友好的亲水固定相PMO-ILs-Au NPs。该新型固定相具有HILIC和PALC的特征,而且与HILIC相同,PALC可以对极性化合物产生保留。该固定相可以分离有机酸类、生物胺类等极性化合物,分离度大、选择性好。本发明还建立了水产品中8种生物胺化合物的PALC-MS/MS检测方法,操作简便、准确、快速、分离效果好,能实现8种生物胺类化合物的同步分析,可以满足食品中常用生物胺类化合物的检测需求。(The invention discloses ionic liquid bridged hybrid silicon oxide serving as a water-rich chromatographic stationary phase, and a preparation method and application thereof. The invention provides a novel environment-friendly hydrophilic stationary phase PMO-ILs-Au NPs. The novel stationary phase has the characteristics of HILIC and PALC, and like HILIC, PALC can retain polar compounds. The stationary phase can separate polar compounds such as organic acids, biogenic amines and the like, and has high separation degree and good selectivity. The invention also establishes a PALC-MS/MS detection method of 8 biological amine compounds in aquatic products, has simple, convenient, accurate and rapid operation and good separation effect, can realize synchronous analysis of 8 biological amine compounds, and can meet the detection requirement of common biological amine compounds in food.)

作为富水色谱固定相的离子液体桥联杂化氧化硅及其制备方 法与应用

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及一种作为富水色谱固定相的离子液体桥联杂化氧化硅及其制备方法与应用。

背景技术

食品添加剂在食品生产中被广泛使用，是现代食品工业的重要组成部分。依据国家规定，允许在食品中使用的食品添加剂只有2000多种，而部分不法厂商缺失诚信，在加工食品中添加一些非法成份，来增加食品的色泽、口感或假冒主成份。非法添加物的泛滥给我国的食品安全带来了极大的危害。近年来，食品安全问题频频曝光，如乳品中双氰胺、三聚氰胺事件、“皮革奶”事件、水产品中孔雀石绿事件、饲料中瘦肉精、豆油中添加叶绿素铜钠充当橄榄油等事件，造成的影响不断升级，公众对食品安全检测的结果十分关注。我国现阶段食品生产的现状，对检测机构的能力和快速反应要求也越来越高。

无论是食品添加剂还是非法添加物，绝大部分是小分子化合物，按其化学性质可划分为强极性、中等极性和弱极性三类。这三类物质中，大部分弱极性和中等极性的化合物可以用反相色谱(Reversed-phase liquid chromatography,RPLC)来分离。但是RPLC对极性食品添加剂和非法添加物无法保留或者保留很弱。虽然可以使用正相色谱来分析，但是正相色谱通常使用非极性的溶剂做流动相，极性分析物很难溶解于非极性的流动相中。因此，分离极性食品添加剂和非法添加物的主要手段是亲水作用色谱(Hydrophilicinteraction liquid chromatography,HILIC)。在亲水色谱柱上，正相色谱所使用的非极性流动相体系被水和有机溶剂体系所代替，这就解决了极性分析物在正相色谱体系中不溶解的问题。相关文献已经证明，极性化合物在亲水色谱柱上有强保留，分离效果较好。

但是，无论正相、反相还是亲水色谱，经常需要使用大量的有机溶剂。尤其是在HILIC中，流动相通常使用高比例的乙腈(acetonitrile,ACN)，含量约70-95％。ACN是一种有害溶剂，大量使用会对环境和人类造成消极的影响。为了解决这个问题，富水液相色谱(Per aqueous liquid chromatography，PALC)应运而生。这是一种绿色的色谱分离技术，不但继承了HILIC的优点，可以替代HILIC对极性化合物高效分离；而且在PALC模式中，流动相由高比例的水组成(通常水含量>90％)，减少有害溶剂的使用，有助于绿色液相色谱的实现，既保护了环境，也符合可持续发展理念，可以大大的降低检测成本，有利于参与市场竞争。目前，国内外对于PALC的文献报道非常少，将其应用到食品中极性添加剂和非法添加物分离检测的研究更少。此类固定相的种类还十分有限，面对复杂的分离体系，实现复杂样品的有效分离，必须研发更多新型的、具有良好的稳定性并且分离效能较高的PALC固定相。

在PALC模式中，需要使用高比例的水作流动相，这对分离材料的使用寿命是一个极大的考验，需要解决以下几个问题：(1)一般的固定相，例如C18，长时间使用富水流动相后，柱效会严重下降，特别是当有硅羟基裸露的时候。(2)可使用的pH范围窄；pH>8时，硅胶易溶解；pH<2时，键合硅胶固定相会流失，使分析物的保留特性和峰形发生变化，同时色谱柱的选择性降低。(3)分析碱性物质时，硅胶表面裸露的硅羟基对碱性物质，尤其是对含N化合物产生不可逆吸附作用，并易使生物大分子，特别是多肽、蛋白质等变性，发生非特异性吸附，造成色谱峰严重拖尾，使回收率降低。因此，在使用富水流动相时，需要固定相有好的稳定性。

发明内容

本发明的目的是提供一种作为富水色谱固定相的离子液体桥联杂化氧化硅及其制备方法与应用。

本发明提供的制备富水色谱固定相的方法，包括：

1)将Au NPs-COOH悬浮于溶剂中，与EDC.HCl和NHS进行Au NPs表面的羧基活化反应；

所述EDC.HCl代表1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；

所述NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺；

所述Au NPs-COOH为羧基功能化的金纳米颗粒；

2)将氨基功能化的PMO-ILs亲水微球分散于分散剂中，与步骤1)所得溶液体系进行酯化反应，反应完毕得到所述富水色谱固定相；

上述方法的步骤1)中，所述溶剂选自DMF、乙醇和DMSO中至少一种；

所述Au NPs-COOH与所述溶剂的用量比为10-20mg：10mL；具体为15mg：10mL；

所述溶剂与所述EDC.HCl的用量比为10-30mL：90mg；具体为10mL：90mg；

所述EDC.HCl和NHS的质量比为1-3：1；具体为1.8:1；

所述羧基活化反应步骤中，温度为室温；时间为2-5h；具体为2h；

所述Au NPs-COOH也即羧基功能化的金纳米颗粒，可按照各种常规方法对金纳米颗粒进行羧基功能化；

如可按照如下方法对其进行羧基功能化：取20mg Au NPs分散于100mL超纯水中。然后，340μL巯基乙酸加入到Au NPs水溶液中，N₂氛围下，室温搅拌反应24h。将反应液装入截流量为3KDa的透析袋中，去离子水中透析48h，除去残余的巯基乙酸，获得Au NPs-COOH；

所用金纳米颗粒可按照各种常规方法制得，如可按照如下还原法制得：取100mL的0.01％氯金酸(HAuCl₄)水溶液，加热至沸腾，迅速向其中加入1mL的1％柠檬酸钠溶液，恒温搅拌30min，透析、离心、干燥，获得Au NPs。

所述步骤2)中，所用氨基功能化的PMO-ILs亲水微球中，氨基功能化的方法为常规方法，如可按照如下方法进行氨基功能化：

将2.0g扩孔后的PMO-ILs亲水微球分散在30mL无水甲苯中，加入2.0mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷((3-Aminopropyl)trimethoxysilane,APTMS)搅拌使其混合均匀，在氮气保护下回流搅拌20h。反应结束后，过滤混合物，分别用二氯甲烷、丙酮和甲醇洗涤固体材料，所得固体在60℃条件下真空干燥过夜，即得。

所述分散剂选自无水DMF、乙醇和DMSO中至少一种；

所述氨基功能化的PMO-ILs亲水微球与分散剂的用量比为1-4g：20mL；具体为2.0g：20mL；

所述酯化反应步骤中，温度为室温；时间为12-48h；具体为24h；

所述方法还包括：在所述步骤2)反应完毕后，将反应体系过滤，收集滤渣，用乙醇冲洗干燥。

上述方法制备得到的富水色谱固定相，也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护一种制备富水色谱固定相时所用PMO-ILs亲水微球及其制备方法，其中；该PMO-ILs亲水微球的制备方法包括：

1)制备BTMSPICl(也即1,3-二(三甲氧基硅丙基)咪唑鎓氯化物[1,3-Bis(trimethoxysilylpropyl)imidazolium chloride,BTMSPICl])：

将咪唑钠和(3-氯丙基)三甲氧基硅烷溶进行取代反应，反应完毕后冷却至室温，旋转蒸发后，将所得反应混合物与新加入的(3-氯丙基)三甲氧基硅烷于溶剂中回流反应，即得；

所述BTMSPICl代表离子液体硅源；

2)制备PMO-ILs亲水微球：

a、将C₁₈TACl溶于溶剂中，再加入催化剂至匀，得到溶液a；

b、将BTSE和BTMSPICl溶于乙醇，得到溶液b；

c、将所述溶液b与所述溶液a混合搅拌后，加热静置于进行共缩聚合反应，反应完毕冷却后过滤，收集滤渣冲洗，干燥，将所得固体加入到浓盐酸/乙醇溶液中，回流萃取模板剂，过滤收集滤渣，得到所述PMO-ILs亲水微球；

3)PMO-ILs亲水微球的扩孔：

将步骤2)所得PMO-ILs亲水微球与扩孔剂于超纯水中搅拌后，静置，得到扩孔后的PMO-ILs亲水微球。

上述方法的步骤1)中，所述咪唑钠和(3-氯丙基)三甲氧基硅烷的投料摩尔比为1：1-3；具体为1:1；所述取代反应在溶剂中和惰性气氛下进行；所述惰性气氛具体为氮气气氛；

所述溶剂选自无水四氢呋喃和甲苯中至少一种；

所述取代反应步骤中，温度为60-110℃；具体为65℃；时间为24-72h；具体为24h；

所述回流反应步骤中，时间为12-48h；

所述步骤2)a中，所述溶剂选自由无水乙醇和超纯水组成的混合液或由DMF和超纯水组成的混合液；

所述催化剂选自NaOH|、KOH和NH₃·H₂O中至少一种；

所述步骤2)a和b中，所述BTSE和BTMSPICl的投料摩尔比为(0.7-0.9)：(0.1-0.3)；具体为0.7：0.3；

所述NaOH与所述C₁₈TACl的质量比为200mg：225-600mg；具体为200mg：300mg；

所用乙醇总量与所述C₁₈TACl和超纯水的用量比为20mL：(225-600mg)：(30-50mL)；具体为20mL：300mg：30-50mL；

所述步骤2)c中，所述溶液b与所述溶液a混合搅拌的温度为室温；时间为30-90min；

所述共缩聚合反应的温度为80-100℃；具体为90℃；时间为15-25h；具体为20h；

所述固体与所述浓盐酸/乙醇溶液的用量比为1g：140-160mL；具体为1g：150mL；所述浓盐酸/乙醇溶液中，浓盐酸和乙醇溶液的体积比具体为5：95；

所述收集滤渣冲洗步骤中，所用溶剂选自甲醇、超纯水和乙醇中至少一种；具体为依次用甲醇、超纯水和乙醇冲洗；

所述干燥为真空干燥；干燥温度具体为60℃；

所述回流萃取模板剂步骤中，回流时间为6-24h；

所述方法还包括：在所述步骤2)c之后，所述步骤3)之前，将所述步骤c所得滤渣依次用乙醇、超纯水和甲醇洗涤，干燥；

所述步骤3)中，所述扩孔剂为DMDA；

所述搅拌步骤中，温度为室温；时间为30-90min；

所述静置步骤中，温度为100-150℃；具体为120℃；时间为36-96h；具体为72h；

所述PMO-ILs亲水微球与扩孔剂的质量比为1：1-3；具体为1：1.25；

所述方法还包括：在所述步骤3)静置步骤后，依次用超纯水和甲醇洗涤，干燥。

按照上述方法制备得到的PMO-ILs亲水微球，也属于本发明的保护范围。

具体的，所述PMO-ILs亲水微球的比表面积为300-700m²/g；具体可为417m²/g；

孔径为6.0-10.0nm；具体可为8.7nm；

孔体积为0.55-1.20cm³/g；具体可为0.93cm³/g。

此外，本发明还要求保护一种富水色谱固定相作为色谱柱的固定相在分离极性物质中的应用及所述富水色谱固定相作为色谱柱的固定相在检测极性物质含量中的应用。

具体的，所述极性物质选自有机酸类和生物胺类中至少一种；

所述有机酸类具体选自琥珀酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸和富马酸中至少一种；

所述生物胺类具体选自色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺中至少一种。

更具体的，所述极性物质为所述有机酸类时，所用色谱条件如下：

流动相A：0.01mol/L磷酸氢二钠-磷酸缓冲液(pH＝2.0)；

流动相B：ACN；

等度洗脱：A：B＝98：2(v/v)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：210nm；

所述极性物质为所述生物胺类时，分离所用色谱质谱条件如下：

所用色谱柱中的固定相：前述本发明提供的所述富水色谱固定相；

所述色谱柱的规格：150mm×4.6mm，i.d.5μm；

流速：0.35mL/min；

柱温：室温；

进样量：10μL；

流动相：A为乙腈，B为10mM乙酸铵水溶液；

梯度洗脱条件如下：

所述梯度洗脱条件中，所述乙腈(％)表示乙腈占所述流动相的体积百分比；

所用质谱条件如下：

离子化模式：电喷雾电离(Electrospray ionization，ESI)正离子模式；

扫描方式：多反应监测(Multiple reaction monitoring，MRM)；

分辨率：单位质量分辨率；

毛细管电压：4000V；

毛细管温度：350℃；

碰撞气：氮气；

所述生物胺类的质谱参数见表6；

具体的，对所述生物胺类的含量进行检测步骤中，所用标准曲线对应的线性方程依次为：

组胺Y＝19665.7X-12765.1

尸胺Y＝13265.1X+11967.2

腐胺Y＝104434.0X+8778.1

精胺Y＝144735.3X-1197.2

亚精胺Y＝19726.7X-4728.0

2-苯乙胺Y＝12767.1X-15613.2

酪胺Y＝10315.5X+17200.2

色胺Y＝4120.8X-1767.5

所述线性方程中，Y为定量离子的峰面积；

X为所述生物胺类的浓度，单位为μg/kg。

另外，所述极性物质为所述生物胺类时，所述分离和检测步骤还包括：在所述分离步骤之前，对待测样品进行如下预处理：

准确称取已经绞碎或匀浆后的待测样品2g(精确到0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL乙腈:甲醇＝2:8(v:v)的提取液，涡旋3min后，加入无水硫酸钠5g，继续涡旋混匀，超声萃取10min，超声过程中，至少摇晃2次，5000r/min离心5min，取上清液10mL于15mL离心管内，供净化；

净化：10mL上清液中加入100mg PSA吸附剂和100mg C18吸附剂，涡旋3min后，5000r/min离心5min，氮吹后1mL甲醇复溶，经0.22μm有机滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪分析。

上述分离或检测方法中，待测样品具体可为食品；更具体可为水产品；再具体可为含有或可疑含有上述有机酸类或所述生物胺类化合物的食品或水产品。

本发明提供了一种新的环境友好的亲水固定相。该固定相以离子液体(Ionicliquids,ILs)桥联的硅烷和1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷[1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane,BTSE]为双硅源，通过共缩合制备适合作为液相色谱填料的新型PMO亲水微球，能够将ILs完全掺入到PMO的介孔骨架当中。本发明合成了一种新型的1,3-二(三甲氧基硅丙基)咪唑鎓氯化物[BTMSPICl]，将其作为制备PMO亲水微球的硅源之一。最后，将金纳米颗粒(Gold nanoparticles,Au NPs)修饰在PMO亲水微球外表面。纳米颗粒的存在，使固定相的分离能力得到改善，分离复杂样品的能力提高，主要原因是纳米颗粒的尺寸效应所致。本发明还研究了该新固定相(PMO-ILs-Au NPs)在PALC模式中的色谱行为。采用PALC模式，一方面取代以往采用的有机溶剂流动相，可节省大量试剂成本和减少环境污染。另一方面，由于此固定相对极性化合物有很强的分离能力，可对同类或不同类极性食品添加剂和非法添加物实现同步分离，提高检测效率。

本发明制备了PMO-ILs-Au NPs填料作为富水固定相，利用红外光谱、元素分析、透射电镜和扫描电镜等对其进行了表征，并研究了它的色谱行为。该新型固定相具有HILIC和PALC的特征，而且与HILIC相同，PALC可以对极性化合物产生保留，耐酸碱能力得到较大提高。该固定相可以分离有机酸类、生物胺类等极性化合物，分离度大、选择性好。与常见的C18柱相比，该固定相对非极性和弱极性化合物有更弱的保留，而对强极性化合物有更强的保留。PALC作为一种绿色的色谱模式，有望成为HILIC的替代模式和RPLC的补充模式。本发明还建立了水产品中8种生物胺化合物的PALC-MS/MS检测方法，操作简便、准确、快速、分离效果好，能实现8种生物胺类化合物的同步分析，可以满足食品中常用生物胺类化合物的检测需求。

附图说明

图1为固定相合成各个阶段的红外光谱图。(A).未除模板的PMO-ILs；(B)除模板的PMO-ILs；(C)扩孔后的PMO-ILs；(D)PMO-ILs-NH₂；(E)PMO-ILs-Au NPs亲水固定相；

图2为不同条件下，制备的PMO-ILs的扫描电镜图；图中A-F依次对应表1中序号1-6的样品也即PMO-ILs-A至PMO-ILs-F；

图3为PMO-ILs(A和B)和PMO-ILs-Au NPs(C)的透射电镜图；

图4为PMO-ILs-Au NPs色谱柱与商品化C18色谱柱柱压/流速性能对比；

图5为5批PMO-ILs-Au NPs亲水固定相(A-E)对苯甲酸钠和山梨酸钾色谱分离图。色谱分离条件：10mM的乙酸铵水溶液：ACN＝95:5(v/v)，流速：1.0mL/min。检测波长：230nm。(1.苯甲酸钠；2.山梨酸钾)；

图6为6种有机酸色谱分离图。A为PMO-ILs-Au NPs柱分离色谱图，B为C18柱分离色谱图；其中，1.酒石酸；2.苹果酸；3.乳酸；4.柠檬酸；5.琥珀酸；6.富马酸；

图7为8种生物胺HPLC-MS/MS分离总离子流图。A为PMO-ILs-Au NPs色谱柱分离总离子流图，B为C18柱分离总离子流图。(1.腐胺；2.尸胺；3.组胺；4.酪胺；5.2-苯乙胺；6.色胺；7.亚精胺；8.精胺)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、离子液体桥联杂化氧化硅作为富水色谱固定相的制备

实验原理

此反应体系主要由硅源，模板分子，助溶剂，催化剂(酸或碱)和扩孔剂组成。以BTMSPICl和BTSE为双硅源，以阳离子表面活性剂十八烷基三甲基氯化铵(Octadecyltrimethylammonium chloride，C₁₈TACl)为模板，乙醇和水为混合助溶剂，以N,N二甲基癸胺(N,N-dimethyldecylamine，DMDA)为扩孔剂，在碱性条件和氮气保护下，通过一步共缩聚合成球形ILs桥联介孔有机氧化硅(PMO-ILs)，合成图见图1。

实验部分

实验材料与仪器

主要材料与试剂

咪唑钠，(3-氯丙基)三甲氧基硅烷，1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷(1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane,BTSE)，十八烷基三甲基氯化铵(Octadecyltrimethylammoniumchloride，C₁₈TACl)，N,N二甲基癸胺(N,N-dimethyldecylamine，DMDA)，3-氨丙基三甲氧基硅烷((3-Aminopropyl)trimethoxysilane,APTMS)购自德国Alfa Aesar公司。氯金酸(HAuCl₄)、巯基乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC.HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)和柠檬酸钠购买于阿拉丁公司(北京，中国)。甲醇，乙醇，二氯甲烷和甲苯均购自于南京化学试剂有限公司(南京，中国)。

6种有机酸化合物，包括琥珀酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸；8种生物胺化合物，包括甲胺、酪胺、乙胺、β-苯乙胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺购买于Dr.Ehrenstorfer公司(德国)。

实验过程中使用的超纯水均来自BWT超纯水系统(Best Water Technology,德国)。高效液相色谱仪器的流动相为乙腈(色谱级，merck，德国)和超纯水的混合物，流动相和测试化合物在使用前均使用0.45μm的过滤膜过滤。

实验仪器

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海爱斯佩克环境设备有限公司，中国)；CARY300CONC紫外可见分光光度计(上海普析通用仪器有限公司)；PII型旋转蒸发仪(BUCHILabortechnik AG)；Nicolet is 10型傅里叶红外光谱仪(Thermo Fisher公司，美国)；元素分析仪(Vario EL，Elementar Co.,德国)；200KV场发射透射电子显微镜(日本株式会社JEOL，日本)；JSM-6360LV扫描电子显微镜(日本)。色谱分析在安捷伦1200高效液相色谱仪(美国)上完成。

实验方法

1、PMO-ILs亲水微球制备

此过程共分三步，具体内容如下:

①离子液体硅源(BTMSPICl)的合成

将20mmol咪唑钠和20mmol(3-氯丙基)三甲氧基硅烷溶解于100mL无水四氢呋喃溶液中，氮气保护下，65℃恒温搅拌进行取代反应24h。反应结束后，冷却到室温，旋转蒸发后，将得到的混合物转移到一个含有新加入的20mmol(3-氯丙基)三甲氧基硅烷的100mL无水甲苯溶液中，氮气保护下，回流继续反应48h。反应结束后，冷却到室温，获得的混合物经甲苯洗涤后，加入20mL无水CH₂Cl₂沉淀NaCl。最后，将上清液取出，旋转蒸发后，获得黄色粘稠状的离子液体硅源(BTMSPICl)。

②PMO-ILs亲水微球的制备

a、称取一定量的C₁₈TACl于烧瓶中，依次加入一定量的无水乙醇和超纯水，搅拌至C₁₈TACl溶解。然后，向溶液中加入催化剂NaOH并溶解，得到溶液a。

b、另取一烧杯将BTSE和BTMSPICl溶于无水乙醇中，混合均匀，得到溶液b；

c、将所述溶液b一次倒入上述步骤a所得溶液a的烧瓶中，在室温下，搅拌30min后，转移到微型高压反应釜中，加热静置进行共缩聚合反应。冷却后过滤，固体依次用甲醇、超纯水、乙醇冲洗，60℃真空干燥。

通过考察反应体系中各种物质的用量BTSE/BTMSPICl(摩尔比)、C₁₈TACl、NaOH、乙醇、H₂O以及反应温度和反应时间，确定最佳的反应条件，反应参数设置见表1。

然后，将干燥后的固体以每克加入150mL浓盐酸/乙醇(v/v＝5/95)溶液中，加热回流8h萃取模板剂，上述过程重复两次。过滤后，依次用乙醇、超纯水、甲醇冲洗，50℃真空干燥12h，最终获得PMO-ILs亲水微球。

表1、反应参数梯度表

注：表1中乙醇用量为所述步骤a和步骤b用量之和；

表1中序号1-6依次代表PMO-ILs-A至PMO-ILs-F，依次对应图2所示扫描电镜图中A-F；

③PMO-ILs亲水微球的扩孔

称取2.0g上述获得的PMO-ILs亲水微球与2.5g扩孔剂DMDA于烧瓶中，向其中加入80mL超纯水，在室温下搅拌30min。装入微型高压反应釜中，放入电热恒温箱中120℃下静置72h。产物冷却后过滤，依次用超纯水和甲醇洗涤，60℃真空干燥，获得扩孔后的PMO-ILs亲水微球。去除DMDA的过程与步骤②去除模板剂相同。

2、金纳米颗粒键合的PMO-ILs亲水微球的制备

制备过程分三步，具体内容如下：

羧基功能化的金纳米颗粒(Au NPs-COOH)的制备

采用还原法制备Au NPs。取100mL的0.01％氯金酸(HAuCl₄)水溶液，加热至沸腾，迅速向其中加入1mL的1％柠檬酸钠溶液，恒温搅拌30min，透析、离心、干燥，获得Au NPs。取20mg Au NPs分散于100mL超纯水中。然后，340μL巯基乙酸加入到Au NPs水溶液中，N₂氛围下，室温搅拌反应24h。将反应液装入截流量为3KDa的透析袋中，去离子水中透析48h，除去残余的巯基乙酸，获得Au NPs-COOH。

氨基功能化的PMO-ILs亲水微球的制备

将2.0g扩孔后的PMO-ILs亲水微球分散在30mL无水甲苯中，加入2.0mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷((3-Aminopropyl)trimethoxysilane,APTMS)搅拌使其混合均匀，在氮气保护下回流搅拌20h。反应结束后，过滤混合物，分别用二氯甲烷、丙酮和甲醇洗涤固体材料，所得固体在60℃条件下真空干燥过夜，得到氨基功能化的PMO-ILs亲水微球。

Au NPs修饰的PMO-ILs亲水微球的制备

1)15mg Au NPs-COOH悬浮在10mL无水N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)中，加入90mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC.HCl)和50mg N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)。室温下搅拌2h进行AuNPs表面的羧基活化反应，以此来活化Au NPs表面的羧基。

2)将2.0g氨基功能化的PMO-ILs亲水微球分散于20mL无水DMF溶液中，快速加入到上述步骤1)所得溶液体系中，室温搅拌进行酯化反应24h。最后，将反应液过滤，用乙醇冲洗三遍，真空干燥后，获得Au NPs修饰的PMO-ILs亲水微球，即PMO-ILs-Au NPs亲水微球，也即本发明提供的富水色谱固定相。

表征

PMO-ILs-Au NPs亲水固定相的表面化学结构变化通过傅里叶红外光谱仪进行分析。C、H、N、S等元素含量变化的结果由元素分析获得。

Au NPs和PMO-ILs-Au NPs亲水微球分散于乙醇溶液中，滴于涂覆有碳膜的铜网上，用透射电镜(TEM)对其形貌进行分析。PMO-ILs亲水微球涂布于硅片上，用扫描电镜(SEM)观察它们的表面形貌和测定颗粒尺寸。采用氮吸附比表面积分析仪考察PMO-ILs和PMO-ILs-Au NPs亲水微球的比表面积、孔径和孔体积的变化情况。通过以上一系列的表征手段，以证实这种新型的PMO-ILs-Au NPs亲水微球的构建是否成功。

1.2.4色谱评价

Agilent 1200HPLC：配有G1311A型四元泵、脱气装置、G1314A型VWD检测器、手动进样阀、G1316A型柱温箱和Chemstation工作站等。

1.2.4.1PMO-ILs-Au NPs亲水色谱柱的制备

采用匀浆法制备PMO-ILs-Au NPs亲水色谱柱。首先，清洁装柱机的各个零件(尤其是匀浆罐)，待烘干后组装好装柱机。启动空气压缩机，储存足够的压力，开气动泵将管道中的空气排出。以异丙醇/三氯甲烷＝1:4(V/V)为匀浆液，将3g微球加入到上述匀浆液中，超声5min使其均匀分散，倒入匀浆罐中。甲醇为顶替液，在350bar的压力下装填于不锈钢柱管(150mm×4.6mm)中，得到新型亲水色谱柱。做好标记，确定柱子的流动相流动方向。

1.2.4.2PMO-ILs-Au NPs亲水色谱柱机械强度的考察

在PALC模式下，通过考察PMO-ILs-Au NPs色谱柱的流速和柱压降的关系，判断微球的机械强度是否符合色谱柱填料要求。在流动相为100％甲醇、柱温为室温的条件下，改变流速，即0.2mL/min，0.4mL/min，0.6mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min，1.5mL/min，2.0mL/min，2.5mL/min，3.0mL/min，3.5mL/min和4.0mL/min来测量柱压。

结果与讨论

1、PMO-ILs-Au NPs亲水固定相的表征

图1和表2是未除模板的PMO-ILs、除模板的PMO-ILs、扩孔后的PMO-ILs、氨基功能化的PMO-ILs和PMO-ILs-Au NPs的FT-IR谱图和元素分析结果。如图1中A，2922和2820cm^-1为C-H的伸缩振动峰，1417cm^-1处出现C-H的弯曲振动峰，说明乙基的存在。在1502cm^-1出现了一个强的吸收，它归属于咪唑环C＝N基团的吸收。1290cm^-1为C-N的伸缩振动峰，而1631cm^-1归于N-H的不对称振动峰。1050cm^-1强烈的吸收峰为Si-O-Si伸缩振动峰，表明硅氧基的存在。上述结果表明，PMO-ILs材料中存在咪唑基团和乙基。图1中B为PMO-ILs纯化后的红外图谱。由图可知，模板剂C18TACl(2922和2820cm^-1)的红外吸收峰强度大大削弱了，说明通过溶剂萃取法可除去大部分C18TACl。而通过表2的元素分析发现，未除模板的PMO-ILs中发现了元素C、H和N，含量分别为：28.54％、7.14％和3.15％，这是由于PMO中引入了ILs、-CH₂-CH₂-基团和残留的C18TACl所导致的。除模板的PMO-ILs的C、H和N含量均明显下降，也证明了大部分C18TACl被除去。

与除模板的PMO-ILs相比(图1中C和表2)，扩孔后的PMO-ILs无论表面结构和功能基团均相同，FI-IR谱图和元素分析均无明显变化。图1中D是PMO-ILs-NH₂的FT-IR谱图，在2340cm^-1出现了较弱的N-H的振动吸收，元素分析结果也显示N的含量略有增加。与PMO-ILs-NH₂相比，PMO-ILs-Au NPs的FI-IR谱(图1中E)显示，在1730cm^-1出现了强烈的C＝O振动吸收；通过元素分析，虽然元素C、H和N的含量变化并不明显，但是S的含量从0增加到0.95％，这是因为Au-S基团引入到PMO-ILs-Au NPs表面导致的。上述结果清晰地表明成功制备了PMO-ILs-Au NPs亲水固定相。

表2、固定相合成各个阶段的元素分析结果

利用扫描电镜，对不同合成条件下得到的PMO-ILs填料的形貌进行了研究(图2)。

图2中A为没有共溶剂乙醇合成的样品的SEM图像。该材料外形不规则，表面粗糙，含有大量碎片。而在合成材料过程中，加入乙醇的样品(图2中B-F)，均呈现规则的球形，表明共溶剂(乙醇)在球形形成中起重要作用。乙醇可降低溶剂的极性并延迟有机硅烷前体的水解速率，表面活性剂胶束周围水解硅烷的缓慢组装可能有助于形成有机二氧化硅球。当BTSE/BTMSPICl的摩尔比从0.9:0.1变化到0.7:0.3时，确定了PMO-ILs的球形形态可以保持(图2中B-D)。BTMSPICl用量增大，微球平均粒径也增大。图2中(B)粒径分布比(C和D)大，虽然其微球表面光滑，但是微球粒径较小，出现严重的粘连现象。当BTSE/BTMSPICl的摩尔比为0.7:0.3时，如图2中(D)能得到平均粒径约为5μm且粒度分布均匀的PMO-ILs色谱填料。SEM结果表明，通过改变不同类型硅烷前体的摩尔比可以调节有机硅的形态。

同时，研究了模板分子C₁₈TACl用量对PMO-ILs球体尺寸的影响。图2中D、E和F显示了在BTSE/BTMSPICl的摩尔比为0.7:0.3和C₁₈TACl用量为300mg，600mg和225mg时制备的材料的SEM图像。结果表明，随着C₁₈TACl用量的增大，球体尺寸逐渐减小。低C₁₈TACl用量(225mg)产生的球体(样品PMO-ILs-F，也即表1中序号6的样品)的尺寸范围为7.5±5μm，粒径分布较不均一。C₁₈TACl用量(300mg，样品PMO-ILs-D，也即表1中序号4的样品)的增加，可获得尺寸为4-5.5μm的球体。C₁₈TACl用量进一步增加到600mg(样品PMO-ILs-E，也即表1中序号5的样品)，导致球体尺寸减小到4.0±3μm，粒径分布较大。在所有三种情况下，PMO-ILs材料均保持良好的球形形态和单分散性。

PMO-ILs表面修饰Au NPs后，采用TEM对填料修饰前后的表面形貌进行了研究。从图3可以看出，PMO-ILs(A和B)外表面比较光滑，而PMO-ILs-Au NPs(C)，许多Au纳米颗粒通过Au-S键附着在其外表面。以上结果进一步说明，此PMO-ILs-Au NPs作为亲水固定相的合成成功。此固定相结合了纳米颗粒的高比表面积和优异的选择性。同时，ILs的存在，使其有较多的亲水作用位点，在水溶液中稳定性较好，同时具有一定的阳离子交换作用，实现同柱多色谱分离模式，可显著提高分离能力。

PMO-ILs、扩孔后的PMO-ILs和PMO-ILs-Au NPs的比表面积和孔径等物理参数见表3。结果表明，PMO-ILs的比表面积、孔径和孔体积分别为402m²/g、3.4nm和0.88cm³/g。而扩孔后的PMO-ILs孔径为8.7nm，远大于PMO-ILs的孔径。与PMO-ILs相比，扩孔后的PMO-ILs表面积和孔体积略有增加。在修饰Au NPs后，PMO-ILs-Au NPs表面积和孔体积略有减小，孔径几乎保持不变。上述结果表明，PMO-ILs-Au NPs仍具有高表面积，大孔径和球形形态，是适用于HPLC的合适材料。

表3、不同反应阶段填料的比表面积和孔结构参数

2.2PMO-ILs-Au NPs亲水固定相的评价

2.2.1PMO-ILs-Au NPs亲水固定相机械强度的测定

将制备好的PMO-ILs-Au NPs色谱柱在不同流速下测量柱压，并选择商品化同规格C18色谱柱(5μm,150mm×4.6mm)作对比。由图4可知，对于PMO-ILs-Au NPs亲水色谱柱，流速和柱压呈现出良好的线性关系。在流速达到4mL/min的情况下，柱压和流速之间的关系依然没有偏离线性，说明此杂化填料具有良好的机械稳定性，并且色谱柱得到了较好的填充。同时，PMO-ILs-Au NPs填料的柱压低于粒径相似的商品化填料，这说明其具有较好的通透性和较低的流动阻力，可以加快传质，使得通过增大流速来大幅度减少分析时间成为一种可能，适用于高流速下样品的快速分析，实现更快速更高效的分离。另外，较低的色谱柱压有利于维护液相色谱泵。

2.2.2色谱柱工艺重复性考察

本研究按1.2.2方法合成了10批PMO-ILs-Au NPs亲水固定相，并填装成色谱柱。随机抽取其中的5批，在同一色谱条件下，分离山梨酸钾和苯甲酸钠的混合物，以此评价自制亲水色谱柱的填料合成和装柱工艺重复性。5批自制色谱柱柱对测试化合物的分离色谱图如图5所示。由图可知，5批自制亲水色谱柱对测试化合物的分离效果基本一致，分离度和峰型差别不大。而且，山梨酸钾和苯甲酸钠保留时间的RSD分别为8.39％和9.81％，证明色谱柱的分离能力和柱效基本一致。以上结果均说明自制色谱柱的填料合成和装柱工艺稳定性较好。

2.2.3重现性实验

色谱柱的重现性实验由化合物的日内和日间保留时间的相对标准偏差(relativestandard deviation，RSD)来验证。在流动相为10mM乙酸铵/ACN＝95:5，检测波长为260nm，流速为1.0mL/min情况下，将腺嘌呤和胞嘧啶的混合物一日内重复进样6次，连续三天，分别计算日内和日间RSD值。结果表明，山梨酸钾和苯甲酸钠的日内保留时间的RSD分别为1.09％和1.27％，日间保留时间的RSD分别为1.98％和2.55％，说明制备的色谱柱具有很好的重现性。

2.2.4富水流动相中的稳定性实验

在流动相水/ACN＝95:5、检测波长为260nm、流速为1.0mL/min的条件下，将胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶和三聚氰胺的混合物在色谱柱上进行分离，每天进样1次，共进样7天，期间用流动相连续冲柱。然后，将其保存在水/ACN＝50:50(v/v)的溶液中，保存23天。上述过程持续三个月，以此来验证填料在长时间富水流动相条件下的稳定性。在分离过程中，考察固定相对上述化合物保留时间的变化情况，并分别计算四种化合物21次保留时间的RSD。从表4中看出，四种化合物的RSD值均小于5％，证明此色谱柱在富水色谱模式下，具有很好的稳定性。

表4、四种化合物保留时间的相对标准偏差(n＝21)

2.3应用

为了研究这个新固定相的分离能力和特殊的选择性，选择了一些在反相柱上保留、分离困难的小分子极性混合物作为分析对象。此外，商用C18柱被用作对比柱，来评价此亲水柱在PALC模式下的保留行为。

2.3.1六种有机酸的分离

以琥珀酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸这六种有机酸混合物为研究对象，pKa值分别为4.21、3.46、3.04、3.86、3.13、3.02，考察了此亲水固定相在PALC条件下的分离能力。因有机酸极性较大，流动相中水的比例很高，常发生酸的电离，从而影响分离效果。为了使有机酸尽可能以分子形式存在，一般使用酸性流动相来抑制有机酸的解离，低pH值有助于有机酸的分离。

所用色谱条件具体如下：

流动相A：0.01mol/L磷酸氢二钠-磷酸缓冲液(pH＝2.0)；流动相B：ACN；等度洗脱：A：B＝98：2(v/v)。流速：1.0mL/min，检测波长：210nm。

如图6，在流动相pH值为2.0的情况下，在新固定相上六种有机酸混合物在12min之内获得了良好的分离，并且分离度较高。相比于C18柱，六种有机酸在18min内也全部基线分离。但是，考虑到色谱柱的耐受性，过低的pH值会严重影响C18色谱柱的使用寿命。由于PMO-ILs-Au NPs亲水固定相具有较好的耐酸性，其分离有机酸具有明显的优势。

2.3.2八种生物胺的分离

生物胺(Biogenicamine)是一类具有生物活性的含氮低分子量有机化合物的总称，其广泛存在于生物体及多种食品中，如酒类、水产品、肉类、发酵食品、乳制品等。微量生物胺是生物体(包括人体)内的正常活性成分，在生物细胞中具有重要的生理功能，是机体中生物碱、核苷酸、蛋白质和荷尔蒙等物质合成的前体物质。但是当人体摄入过量的外源性生物胺时，会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。腐胺、尸胺、2-苯乙胺、酪胺和色胺作为常见的生物胺，均属于剧毒化学物质，且水溶性很好。

本发明利用富水高效液相色谱－串联质谱法(PALC-MS/MS)，通过优化提取和净化方法以及色谱和质谱条件，对不同水产品的生物胺进行了分析测定，建立同时检测8种生物胺的快速检验方法，以期为此类物质的检测提供更多的技术选择。

2.3.2.1材料与方法

2.3.2.1.1实验试剂和仪器

液相色谱-串联质谱仪采用TSQ Quantum Access(ThermoFisher，美国)。

2.3.2.1.2标准储备液的制备

分别准确称取色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺标准品10.0mg于8个100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成含量为100.0mg/L的标准储备液，于4℃冷藏保存。

2.3.2.1.3混合标准工作液的配制

用标准储备液配制成工作液，使各生物胺的质量浓度范围分别为：组胺0.078-10μg/L，尸胺0.001-1μg/L，腐胺0.0156-1μg/L，精胺0.078-10μg/L，亚精胺0.078-10μg/L，2-苯乙胺0.78-100μg/L，酪胺0.78-100μg/L，色胺0.78-100μg/L，经0.22μm滤膜过滤后备用。

2.3.2.2色谱-质谱条件

2.3.2.2.1液相色谱条件

色谱柱：PMO-ILs-Au NPs亲水色谱柱(150mm×4.6mm，i.d.5μm)；流速：0.35mL/min；柱温：室温；进样量：10uL。流动相：A为乙腈，B为10mM乙酸铵水溶液；梯度洗脱条件见表5。

表5、梯度洗脱表

2.3.2.2.2质谱条件

离子化模式：电喷雾电离(Electrospray ionization，ESI)正离子模式；扫描方式：多反应监测(Multiple reaction monitoring，MRM)；分辨率：单位质量分辨率；毛细管电压：4000V；毛细管温度：350℃；碰撞气：氮气；八种化合物的质谱参数见表6。

表6、四种化合物的质谱参数

2.3.2.3样品前处理

准确称取已经绞碎或匀浆后的水产品2g(精确到0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL乙腈:甲醇＝2:8(v:v)的提取液。涡旋3min后，加入无水硫酸钠5g，继续涡旋混匀。超声萃取10min，超声过程中，至少摇晃2次。5000r/min离心5min，取上清液10mL于15mL离心管内，供净化。

净化：10mL上清液中加入100mg PSA吸附剂和100mg C18吸附剂，涡旋3min后，5000r/min离心5min，氮吹后1mL甲醇复溶，经0.22μm有机滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪分析。

2.3.2.4结果与讨论

2.3.2.4.1八种生物胺的分离

以上述八种生物胺混合物为研究对象，按2.3.2.2色谱质谱条件，考察了此亲水固定相在PALC条件下的分离能力。如图7，在PMO-ILs-Au NPs亲水色谱柱上，八种生物胺在7min之内得到了良好的分离，并且分离度较高，这可能是离子交换作用与纳米金协同作用的结果。而在C18柱上，八种化合物在4min内全部出峰，1-6号化合物堆积在一起，无法分离，表明C18柱对这八种极性生物胺类化合物保留能力较差，分离效果不佳。

2.3.2.4.2方法线性范围及检出限

按本法的色谱条件对不同浓度标准系列进行分析，将八种化合物的对应浓度和定量离子的峰面积绘制标准曲线，线性相关方程和线性相关系数结果见表7。结果表明，八种生物胺标准曲线线性关系良好，其相关系数均大于0.998，达到国标中残留检测的要求。检出限(LOD)和定量限(LOQ)采用向空白样品中逐级降低加标浓度的方法来确定。以3倍信噪(S/N＝3)对应的生物胺含量作为检出限，以S/N＝10对应的目标物含量作为定量限，获得八种生物胺标品的检出限和定量限。检出限和定量限均大大低于国标GB5009.208-2016，GB/T23884-2009和GB/T 21970-2008。

表5、八种生物胺的标准曲线回归方程、相关系数、线性范围及检出限

所述线性方程中，Y为定量离子的峰面积；

X为所述生物胺类的浓度，单位为μg/kg。

2.3.2.4.3添加回收率及精密度实验

取一定量准确称取已经绞碎或匀浆后的黑鱼样品，分别在样品中添加测定低限、2倍测定低限以及10倍测定低限三个浓度水平的混合标准溶液，每份样品进行6次测定，考察方法的回收率和精密度，结果见表8。八种化合物的加标回收率为65.70％—93.08％，相对标准偏差(RSD)为1.38％—3.57％。结果表明，该方法具有良好的精密度和准确度。

表6、加标回收率和精密度实验结果(n＝6)

2.3.2.4.4待测样品分析

取市场上在售的水产品(包括草鱼、白鲢鱼、黑鱼、黄花鱼和鲫鱼)三种，按照2.3.2.3样品处理进行前处理，按2.3.2.2液相色谱-质谱条件进行检测。检测结果如表9所示，几种水产品中均有不同程度的生物胺组分检出，但含量均较低，对食用并无影响。

表7、水产品中8种生物胺的检测结果(mg/kg)

注：N/A表示未检测

综上所述，本发明制备了PMO-ILs-Au NPs填料作为富水固定相，利用红外光谱、元素分析、透射电镜和扫描电镜等对其进行了表征，并研究了它的色谱行为。该新型固定相具有HILIC和PALC的特征，而且与HILIC相同，PALC可以对极性化合物产生保留。而且耐酸碱能力得到较大提高。该固定相可以分离有机酸类、生物胺类等极性化合物，分离度大、选择性好。与常见的C18柱相比，该固定相对非极性和弱极性化合物有更弱的保留，而对强极性化合物有更强的保留。PALC作为一种绿色的色谱模式，有望成为HILIC的替代模式和RPLC的补充模式。本发明还建立了水产品中8种生物胺化合物的PALC-MS/MS检测方法，操作简便、准确、快速、分离效果好，能实现8种生物胺类化合物的同步分析，可以满足食品中常用生物胺类化合物的检测需求。