基于聚烷基多胺聚合物层的阴离子交换固定相
阅读说明：本技术 基于聚烷基多胺聚合物层的阴离子交换固定相 (Anion exchange stationary phase based on polyalkyl polyamine polymer layer ) 是由 C·A·波尔 陈锦华 于 2019-07-30 设计创作，主要内容包括：用于分离多种碳水化合物的阴离子交换包括带负电的基材颗粒。基础聚合物层包括第一多个季胺。聚烷基多胺聚合物层共价连接到基础缩聚物层上。聚烷基多胺聚合物层包括聚合物分支结构,其包括第二多个季胺。第二多个季胺的密度在远离基础缩聚物层的方向上增加。阴离子交换固定相不具有通过乙基与第一或第二多个季胺中的任何一个间隔开的羟基。(Anion exchange for the separation of various carbohydrates includes negatively charged substrate particles. The base polymer layer includes a first plurality of quaternary amines. The layer of polyalkylpolyamine polymer is covalently linked to the base layer of polycondensation. The polyalkylpolyamine polymer layer includes a polymeric branch structure including a second plurality of quaternary amines. The density of the second plurality of quaternary amines increases in a direction away from the base polycondensation layer. The anion exchange stationary phase does not have hydroxyl groups spaced apart from any of the first or second plurality of quaternary amines by ethyl groups.)
技术领域
本发明一般涉及基于聚烷基多胺层的阴离子交换固定相，用于应用诸如色谱分离包括阴离子的样品，特别是碳水化合物的组合，更特别是支化聚糖的组合。
背景技术
色谱是用于分子的化学分析和分离的广泛使用的分析技术。色谱涉及一种或多种分析物物质与样品中存在的其它基质组分的分离。通常选择色谱柱的固定相，以便与分析物存在相互作用。这类相互作用可以是离子性的、亲水性的、疏水性的或其组合。例如，固定相可以用理想地将结合于离子分析物的离子部分和具有不同亲和性水平的基质组分衍生化。流动相渗过固定相并与分析物和基质组分竞争结合到离子部分。流动相或洗脱液为用于描述泵送通过色谱柱的液体溶剂或缓冲溶液的术语。在这一竞争过程中，分析物和基质组分将随着时间从固定相洗脱并接着随后在检测器处经过检测。一些典型检测器的实例是电导率检测器、UV-VIS分光光度计和质谱仪。多年来，色谱已经发展成有效的分析工具，其适用于创造更健康、更干净且更安全的环境，其中可以为如水质、环境监测、食品分析、医药和生物技术等各个行业分离并分析复杂样品混合物。
美国专利7,291,395“涂覆的离子交换基底和形成方法”描述了基于包含季胺基团和羟基的交联层的超支化阴离子交换材料。在一个实施方案中，使用二环氧化合物试剂和胺基之间的反应形成阴离子交换材料。开环反应产生通过两个碳间隔基与季胺基间隔开的羟基。在这种类型的反应中产生的羟基可以相对于季被称为β羟基基团，这使得羟基更酸性和反过来影响阴离子交换树脂的阴离子结合特性。在阴离子交换色谱分离过程中，通常使用氢氧化物洗脱液。当氢氧化物洗脱液的pH足够高时，β羟基可以去质子化，导致与季胺形成两性离子对，这减少了阴离子与季胺离子交换位点的结合。两性离子对具有带正电的季胺，其通过带负电和去质子化的β羟基稳定。带正电的季胺和去质子化的羟基的接近形成相对稳定的两性离子对，其降低季胺的阴离子结合强度。因此，阴离子交换树脂的阴离子结合能力可以基于氢氧化物洗脱液的浓度(或pH)来调节，使得其可用于各种阴离子交换色谱试验。
然而，在某些情况下，申请人发现碳水化合物对含有β羟基的超支化阴离子交换材料几乎没有任何保留，因此对该应用无用。因此，申请人认为需要不含β羟基的超支化阴离子交换材料，以便可以对碳水化合物如支链聚糖进行色谱分析。
发明内容
用于分离多种碳水化合物的阴离子交换固定相的第一实施方案包括a)带负电的基材颗粒，b)基础缩聚物层，和c)聚烷基多胺缩聚物层。基础缩聚物层附着到带负电的基材颗粒。基础缩聚物层包括第一多个季胺，其中第一多个季胺通过第一间隔基或第二间隔基间隔开。基础缩聚物层不具有通过乙基与第一多个季胺之一间隔开的羟基。聚烷基多胺缩聚物层共价连接到基础缩聚物层上。聚烷基多胺缩聚物层包括聚合物支链结构，其包括第二多个季胺，其中第二多个季胺通过第一间隔基或第二间隔基间隔开。第二多个季胺的密度在远离基础缩聚物层的方向上增加。聚烷基多胺缩聚物层不具有通过乙基与第二多个季胺之一间隔开的羟基。
关于第一实施方案的任一种，第一间隔基可以是烷基、二烷基醚、环烷基、芳基烷基及其组合。
关于第一实施方案的任一种，第二间隔基可以是烷基、二烷基醚、环烷基、芳基烷基及其组合。
关于其中第一间隔基包含第一烷基，第二间隔基包含第二烷基的第一实施方案，其中第一烷基和第二烷基均为直链和未取代的烷基。
关于第一实施方案，第一间隔基包括直链和未取代的烷基，第二间隔基包括芳烷基。
关于第一实施方案，第一间隔基包括化学式(-CH2-)x，第二间隔基包含化学式(-CH2-)y，其中x和y各自独立地为3至10，优选为3至6。
用于分离多个碳水化合物的阴离子交换固定相的第二实施方案通过包括使多卤代烃与聚烷基多胺反应以在带负电的基材颗粒上形成基础缩聚物层的方法形成。使基础缩聚物层与许多反应循环反应，形成聚烷基多胺缩聚物层。反应循环的数量范围为约3至约10，每个反应循环包括多卤代烃处理和聚烷基多胺处理。在反应循环后，聚烷基多胺缩聚物层与单卤代烷烃处理反应。单卤代烷烃的实例是甲基碘。
关于第二实施方案，带负电的基材颗粒作为填充床包含在色谱柱中。多卤代烃与聚烷基多胺的反应包括使多卤代烃和聚烷基多胺的溶液流过该柱，以在带负电的基材颗粒上形成基础缩聚物层。
关于第二实施方案，多卤代烃处理包括使多卤代烃的溶液流过该柱。聚烷基多胺处理包括使聚烷基多胺的溶液流过柱。单卤代烷烃处理包括使单卤代烷烃的溶液流过该柱。
关于第二实施方案中的任一个，反应循环的数量范围为约3至约4。
关于第二实施方案的任一个，多卤代烃可以是二卤代烷烃、二卤代二烷基醚、二卤代环烷烃、三卤代烷烃以及它们的组合。
关于第二实施方案中的任一个，聚烷基多胺可包括醚基、环烷烃基、芳基烷烃及其组合。
关于第二实施方案中的任一个，聚烷基多胺可以是聚烷基三胺、聚烷基二胺以及它们的组合。
关于第二实施方案，聚烷基多胺的所有胺可以是叔胺(例如，聚烷基多叔胺)。
关于第二实施方案，多卤代烃可以是二溴丁烷、二溴戊烷、二溴己烷、三溴甲基苯以及它们的组合。
关于第二实施方案，聚烷基多胺可以是五甲基二丙基三胺、五甲基二己基三胺、全甲基化精胺、全甲基化亚精胺以及它们的组合。
关于第二实施方案，多卤代烃是二溴丁烷，聚烷基多胺是五甲基二己基三胺。
关于第二实施方案，多卤代烃是三卤代烷基芳基，聚烷基多胺是烷基二胺。
关于第二实施方案，多卤代烃是三溴甲基苯，聚烷基多胺是四甲基己二胺。
用于分离多种碳水化合物的阴离子交换固定相的第三实施方案包括A)带负电的基材颗粒，B)基础缩聚物层300，C)第一烷基缩合反应产物(CRP)400，D)第一聚烷基多胺CRP500，E)第二烷基CRP 600，F)第二烷基CRP 700，G)第三烷基CRP，和H)第三烷基CRP。基础缩聚物层300可以附着到带负电的基材颗粒。基础缩聚物层包括i)第一多卤代烃和ii)第一聚烷基多胺的反应产物。第一烷基CRP 400共价连接到基础缩聚物层300。第一烷基CRP 400包括i)基础缩聚物层300的胺基和ii)第二多卤代烃的反应产物。所述基础缩聚物层300的所述胺基包括正电荷，使得所述基础缩聚物层离子地偶联到所述带负电的基材颗粒。第一聚烷基多胺CRP 500与第一烷基CRP 400共价连接。第一聚烷基多胺CRP 500包括i)第二种多卤代烃的卤基团和ii)第二聚烷基多胺的反应产物。第二烷基CRP 600与第一聚烷基多胺CRP 500共价连接。第二烷基CRP 600包括i)第一聚烷基多胺CRP 500的胺基和ii)第三多卤代烃的反应产物。第二聚烷基多胺CRP 700与第二烷基CRP 600共价连接。第二聚烷基多胺CRP 700包括i)第三多卤代烃的卤基团和ii)第三聚烷基多胺的反应产物。第三烷基CRP共价连接于第二聚烷基多胺CRP 700。第三烷基CRP包括i)第二聚烷基多胺CRP的胺基和ii)第四多卤代烃的反应产物。第三聚烷基多胺CRP共价连接于第三烷基CRP。第三聚烷基多胺CRP包括i)第四多卤代烃的卤基团和ii)第四聚烷基多胺的反应产物。
关于第三实施方案，第一多卤代烃、第二多卤代烃、第三多卤代烃和第四多卤代烃可包括二卤代烷烃。第一种聚烷基多胺、第二聚烷基多胺、第三聚烷基多胺和第四聚烷基多胺可包括聚烷基三胺。
用于分离多个碳水化合物的阴离子交换固定相的第四实施方案包括A)带负电荷的基材颗粒，B)基础缩聚物层1500，C)第一聚烷基多胺1600，D)第一聚烷基芳基CRP 1700，E)第二聚烷基多胺CRP 1800，F)第二聚烷基芳基CRP1900，G)第三聚烷基多胺CRP，和H)第三聚烷基芳基CRP。基础缩聚物层1500附着到带负电的基材颗粒。基础缩聚物层包括i)第一卤代烃和ii)第一聚烷基多胺的反应产物。所述基础缩聚物层1500的所述胺基包括正电荷，使得所述基础缩聚物层离子地偶联到所述带负电的基材颗粒。第一聚烷基多胺缩合反应产物1600共价连接到基础缩聚物层1500。第一聚烷基多胺缩合反应产物1600包括i)基础缩聚物层1500的卤基团和ii)第二聚烷基多胺的反应产物。第一聚烷基芳基缩合反应产物1700共价连接到第一聚烷基多胺缩合反应产物1600。第一聚烷基芳基缩合反应产物1700包括i)第一聚烷基多胺缩合反应产物1600的胺基和ii)第二多卤代烃的反应产物。第二聚烷基多胺缩合反应产物1800与第一聚烷基芳基缩合反应产物1700共价连接。第二聚烷基多胺缩合反应产物1800包括i)第一聚烷基芳基缩合反应产物1700的卤基团和ii)第三聚烷基多胺的反应产物。第二聚烷基芳基CRP 1900与第二聚烷基多胺CRP 1800共价连接。第二聚烷基芳基CRP 1900包括i)第二聚烷基多胺CRP 1800的胺基和ii)第三多卤代烃的反应产物。第三聚烷基多胺CRP与第二聚烷基芳基CRP1900共价连接。第三聚烷基多胺CRP包括i)第二种聚烷基芳基CRP 1900的卤基团和ii)第四聚烷基多胺的反应产物。第三聚烷基芳基CRP与第三聚烷基多胺CRP共价连接。第三聚烷基芳基CRP包括i)第三聚烷基多胺的胺基和ii)第四多卤代烃的反应产物。
关于第四实施方案，它还可包括i)第三聚烷基芳基CRP的卤基团和ii)叔胺的反应产物。
关于第四实施方案，第一多卤代烃、第二多卤代烃、第三多卤代烃和第四多卤代烃可包括三卤代烷基芳基，并且第一聚烷基多胺、第二聚烷基多胺、第三聚烷基多胺和第四聚烷基多胺可包括聚烷基二胺。
第五个实施方案是使用阴离子交换固定相将样品中的多个碳水化合物与第一、第二和第三实施方案中任一个的阴离子交换固定相分离的方法。该方法包括使洗脱液流过含有阴离子交换固定相的色谱柱。洗脱液包含氢氧化物。将包含多种碳水化合物的样品注入色谱柱中。从注入色谱柱的样品中分离出至少一种碳水化合物。在检测器处检测至少一种碳水化合物。
关于第五实施方案，至少一种碳水化合物是支链聚糖。
关于上述实施方案，带负电的基材颗粒可包括交联的二乙烯基苯和乙基乙烯基苯共聚物，其中带负电的基材颗粒的至少一个表面包括磺酸根基团。
关于上述实施方案，带负电的基材颗粒包含交联的二乙烯基苯和乙基乙烯基苯共聚物，其中带负电的基材颗粒的至少一个表面包括羧酸根基团。
关于上述实施方案，其中所述基础缩聚物层带正电并以离子方式附着到所述带负电的基材颗粒。
附图说明
并入本文中并且构成本说明书的一部分的附图说明了本发明目前优选的实施方案，并且与上文给出的一般说明和下文给出的详细说明一起用于解释本发明的特征(其中相同数字表示相同元件)。
图1示出了可用于形成阴离子交换树脂的聚合物和反应产物的聚烷基多胺试剂的各种化学结构。
图2示出了可用于形成阴离子交换树脂的聚合物和反应产物的多卤代烃试剂的各种化学结构。
图3说明由第一聚烷基三胺和第一二卤代烷形成的基础聚合物层的示意图，其中基础聚合物层连接到带负电的基材颗粒上。
图4示出了具有侧挂卤基团并且共价连接到基础聚合物的第一烷基反应产物的示意图。所述第一烷基反应产物是基础聚合物的胺基和第二二卤烷烃的反应产物。
图5示出了共价连接于第一烷基反应产物的第一聚烷基多胺反应产物的示意图。所述第一聚烷基多胺反应产物是第二二卤烷烃的侧挂卤基团和第二聚烷基三胺的胺基的反应产物。
图6示出了具有侧挂卤基团并且共价连接于第一聚烷基多胺反应产物的第二烷基反应产物的示意图。所述第二烷基反应产物是第一聚烷基多胺反应产物的胺基和第三二卤烷烃的反应产物。
图7示出了共价连接至第二烷基反应产物的第二聚烷基多胺的示意图。所述第二聚烷基多胺反应产物是第三二卤烷烃的侧挂卤基团和第三聚烷基三胺的胺基团的反应产物。
图8显示了六个色谱图，其中每个色谱图使用不同的NaOH洗脱液浓度和含有五种不同碳水化合物的标准溶液。使用包含五甲基二己基三胺PMDHTA和1-4-二溴丁烷DBB的阴离子交换树脂进行色谱图。
图9示出使用包括PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂的两个色谱图。将标准溶液注入含有五个碳水化合物(上色谱图)或两个碳水化合物(下色谱图)的色谱柱。
图10显示了三个色谱图，其中每个色谱图使用不同的NaOH洗脱液浓度和含有五种不同碳水化合物的标准溶液。使用包含N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺TMHDA和1,3,5-三(溴甲基)苯TBMB的阴离子交换树脂进行色谱。
图11示出使用包括TMHDA和TBMB阴离子交换树脂的两个色谱。将标准溶液注入含有五个碳水化合物(上色谱图)或两个碳水化合物(下色谱图)的色谱柱。
图12示出使用包括PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂的色谱，显示38个峰。将样品溶液注入含有胎球蛋白醛醇的色谱柱中。
图13示出使用包括TMHDA和TBMB的阴离子交换树脂的色谱，显示28个峰。将样品溶液注入含有胎球蛋白醛醇的色谱柱中。
图14显示了适用于使用离子交换色谱柱和使用四倍电压波形的电化学检测器分析样品的离子色谱系统。
图15示出了从N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺TMHDA和1,3,5-三(溴甲基)苯TBMB形成基础聚合物层的示意性图，其中基础聚合物层连接于带负电荷的基材颗粒。
图16示出了具有侧挂叔胺基团和共价连接到基础聚合物的第一聚烷基多胺反应产物的示意图。所述第一聚烷基多胺反应产物是基础聚合物的卤基团和第二TMHDA的第一聚烷基多胺反应产物。
图17示出了共价连接于第一聚烷基多胺反应产物的第一聚烷基芳基反应产物的示意图。所述第一聚烷基芳基反应产物是第二TMHDA的侧挂叔胺和第二TBMB的卤基团的反应产物。
图18示出了具有侧挂叔胺基团并且共价连接于第一聚烷基芳基反应产物的第二聚烷基多胺反应产物的示意图。所述第二聚烷基多胺反应产物是第一聚烷基芳基反应产物的卤基团和第三TMHDA的反应产物。
图19示出了第二聚烷基芳基共价连接至第二聚烷基多胺反应产物的示意图。所述第二聚烷基芳基反应产物是第三TMHDA的侧挂叔胺基团和第三TBMB的卤基团的反应产物。
具体实施方式
应参考附图来阅读以下详细说明，其中不同附图中的相同元件编号相同。附图(其未必按比例)描绘所选实施方案且并不打算限制本发明的范围。详细说明以举例的方式而不以限制的方式说明本发明的原理。这一说明将明确地使得本领域的技术人员能够制造并使用本发明，并描述本发明的若干实施方案、修改、变型、替代方案和用途，包括目前被认为是进行本发明的最佳模式。如本文所用，用于任何数值或范围的术语“约”或“大致”指示允许组件的部分或集合如本文所述，为其预定目的而运作的合适尺寸公差(dimensionaltolerance)。
除非另外说明，否则在本文中，单独或作为另一取代基的部分的术语“烷基”意指直链或支链或环烃基团或其组合，其可以是完全饱和、单或多不饱和并且可包括具有一定数目的所指定的碳原子(即，C1-C10意指一至十个碳)的二价和多价基团。饱和烃基团的实例包括(但不限于)以下基团：如甲基、乙基、正丙基(例如，-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-)、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”还意指包括以下更详细定义的那些烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基称为“高烷基”。术语“烷基”也可意指“亚烷基”或“烷基二基”以及在其中烷基为二价基团的那些情况下的次烷基。
本文中，单独或作为另一取代基的部分的术语“亚烷基”或“烷基二基”意指衍生自烷基的二价基团，如由-CH2CH2CH2-(亚丙基或丙烷-1,3-二基)例示但不受其限制，并且进一步包括以下所述的那些基团，如“亚杂烷基”。通常，烷基(或亚烷基)基团将具有1至约30个碳原子，优选1至约25个碳原子，更优选1至约20个碳原子，甚至更优选1至约15个碳原子并且最优选1至约10个碳原子。“低级烷基”、“低级亚烷基”或“低级烷基二基”为较短链的烷基、亚烷基或烷基二基，一般具有约10个或更少碳原子、约8个或更少碳原子、约6个或更少碳原子或约4个或更少碳原子。
本文中，单独或作为另一取代基的部分的术语“次烷基”意指衍生自烷基的二价基团，如由CH3CH2CH2＝(次丙基)例示但不受其限制。通常，次烷基将具有1至约30个碳原子，优选1至约25个碳原子，更优选1至约20个碳原子，甚至更优选1至约15个碳原子并且最优选1至约10个碳原子。“低级烷基”或“低级次烷基”为较短链的烷基或次烷基，一般具有约10个或更少碳原子、约8个或更少碳原子、约6个或更少碳原子或约4个或更少碳原子。
本文中，术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)用于其常规的含义，并且是指分别经由氧原子、氨基或硫原子连接到分子的其余部分的那些烷基。
除非另外说明，否则在本文中，单独或与另一个术语组合的术语“杂烷基”意指稳定直链或支链或环烃基团或其组合，其由规定数目的碳原子和至少一个选自由以下组成的组的杂原子组成：O、N、Si、S及B，且其中氮和硫原子可任选地为氧化的，并且氮杂原子可任选地为季铵化的。杂原子O、N、B、S和Si可位于杂烷基的任何内部位置处或在烷基连接到分子的其余部分的位置处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NHCH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一取代基的部分的术语“亚杂烷基”意指衍生自杂烷基的二价基团，如由-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-例示但不受其限制。对于亚杂烷基，杂原子也可占据链末端中的任一个或两个(例如亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。任选地，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团，键联基团的式的书写方向并不表示键联基团的定向。例如，式-CO2R’-任选地表示-C(O)OR’和-OC(O)R’。
除非另外说明，否则在本文中，单独或与其它术语组合的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可以占据杂环连接到分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另外说明，否则在本文中，单独或作为另一取代基的部分的术语“卤基”或“卤素”意指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烷基”意图包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”意图包括(但不限于)三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另外说明，否则在本文中，术语“芳基”意指可以是单环或稠合在一起或共价连接的多个环(优选地1至3个环)的多不饱和芳香族取代基。术语“杂芳基”是指含有选自N、O、S、Si和B的一至四个杂原子的芳基(或环)，其中氮原子和硫原子任选地经氧化，并且氮原子任选地经季铵化。杂芳基可以通过杂原子连接到分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。以上所指出的芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基选自下文所述的可接受取代基的组。
为简洁起见，当在本文中，术语“芳基”与其它术语(例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)组合使用时，其包括如上所定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳烷基”意图包括其中芳基连接到烷基的那些基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(例如，亚甲基)被例如氧原子替换的那些烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述术语中的每一个(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意图包括所指示基团的经取代和未经取代的两种形式。以下提供用于各类基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(包括通常被称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基一般被称为“烷基取代基”，并且其可以是选自(但不限于)以下的多种基团中的一个或多个：经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-OS(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，数目在零至(2m’+1)范围内，其中m’为这类基团中的碳原子总数。R’、R”、R”和R””各自优选独立地是指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(例如经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当本发明化合物包括大于一个R基团时，例如，独立地选择每一个R基团，当存在R、R'、R"、R'"和R""基团中的大于一个时，R'、R"、R'"和R""基团也如此。当R'与R"连接到同一氮原子时，其可以与所述氮原子组合以形成5元、6元或7元环。例如，-NR'R"意图包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上取代基的论述，本领域的技术人员将理解，术语“烷基”意图包括结合到除氢基以外的基团的碳原子的基团，如卤烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于对烷基所述的取代基，芳基和杂芳基的一般被称为“芳基取代基”。所述取代基选自(例如)：经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环烷基、-OR'、＝O、＝NR’、＝N-OR'、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R"’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R"’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目在零至芳香族环系统上的开放价态的总数范围内；并且其中R’、R"、R'"和R""优选独立地选自氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基和经取代或未经取代的杂芳基。当本发明化合物包括大于一个R基团时，例如，独立地选择每一个R基团，当存在R、R'、R"、R'"和R""基团中的大于一个时，R'、R"、R'"和R""基团也如此。
描述了多卤素试剂和多胺试剂的组合，其产生不含β羟基的超支化聚合物。超支化阴离子交换聚合物具有随着聚合物层从基材向外延伸而具有越来越多的分支的结构。越来越多的分支导致阴离子交换位点的密度朝向超支化结构的外部增加。使用各种试剂、试剂浓度和反应循环次数的组合，可以实现超支化结构的多种不同的容量和选择性。例如，可以产生具有高离子交换容量和高固定相pH的超支化阴离子交换结构。超支化阴离子交换结构具有类似于衍生自糖蛋白的高度支化聚糖的结构，因此，超支化阴离子交换结构适于通过提供选择性而不过度限制质量传递来分离高度支化的聚糖。阴离子交换固定相可以称为树脂。
聚糖包括与糖蛋白连接的大量碳水化合物。聚糖可包括糖亚基，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、半乳糖胺和葡糖胺。据信β羟基的pKa具有约13.9的pKa，其接近与聚糖连接的糖亚基的pKa。因此，导致聚糖部分被电离(作为阴离子)的pH值也可导致β羟基被电离，导致阴离子交换树脂的低保留。
在一个实施方案中，超支化聚合物可由二卤代烷基和全甲基化三胺形成。示例性试剂五甲基二亚丙基三胺102和1,4-二溴丁烷202可用于制备超支化聚合物，分别如图1和2所示。首先，将这两种试剂以1∶1的摩尔比一起在表面磺化的超大孔树脂上形成底层，然后与1,4-二溴丁烷交替反应，然后与五甲基二亚丙基三胺反应，生成超支化阴离子交换聚合物，其不具有任何β羟基。应注意，二卤代烷烃是不溶于水的，因此，使用有机溶剂溶解二卤代烷烃以与全甲基化三胺反应。二卤代烷烃和全甲基化三胺的反应产物是卤化物盐，其倾向于在有机溶剂中沉淀并使反应终止。卤化物盐更易溶于极性溶剂。然而，极性溶剂的使用倾向于过度降低反应速率，使得难以生产合适分子量聚合物。因此，为了制备底层，必须使两种试剂在溶剂(或溶剂混合物)中反应，这平衡了能够溶解反应物、反应产物的所有这些要求，并且具有合适的反应速率以达到所需的聚合物分子量。在一个实施方案中，具有使聚合物与乙腈保持在溶液中所需的最少量甲醇的溶剂混合物(例如，4份乙腈与1份甲醇)允许制备合适的聚合物。
申请人认为，超支化结构中的季离子交换位点的电荷密度可能太高，这将导致两个离子交换位点之间的键上的过度应力。在一个实施方案中，申请人认为，季胺基对之间的间隔基长度可以大约等于或大于丙基，使得离子交换位点密度不会太高。然而，如果间隔基团太长，则离子交换位点密度可能太低而不能有效地分离阴离子并提供足够高的离子交换容量。
在另一个实施方案中，全甲基化胺如五甲基二亚丁基三胺或五甲基二亚六亚甲基三胺可与1,4-二溴丁烷结合使用。这将允许季胺离子交换位点的定位通过丁基或己基间隔开。全甲基化胺试剂可以是三叔胺的形式，其中1,4-二溴丁烷的烷基化导致溴离子的释放，其可以与形成的季胺离子缔合。这些试剂还可以形成不含任何β羟基的超支化聚合物。
在另一个实施方案中，全甲基化二胺可以与1,3,5-三溴甲基苯结合使用以产生超支化结构。全甲基化二胺的实例是四甲基-1,4-丁二胺或四甲基-1,6-己二胺106。这些试剂还可以形成不含任何β羟基的超支化聚合物。
在一实施方案中，可以在基材上形成一系列缩合反应产物或聚合物层。在与聚烷基多胺和多卤代烃的聚合反应中形成的聚合物可称为缩聚物或缩聚物反应产物或缩聚物层。类似地，缩合反应产物CRP可以是来自聚合物和试剂(例如烷基卤化物或胺类试剂化学品)之间的缩合反应的产物，其导致卤化物或卤化物和氢的损失。应注意，烷基卤化物和叔胺类试剂的反应导致卤化物的损失并且不会产生氢的损失。烷基卤化物和伯胺或仲胺类试剂的反应导致卤化物和氢的损失，其中产生的氢可能干扰聚合过程。
聚烷基多胺可以是聚烷基三胺或聚烷基二胺。图1说明了2,6,10-三甲基-2,6,10-三氮杂十一烷(五甲基二丙基三胺，PMDPTA 102)和2,9,13-三甲基-2,9,13-三氮杂十七烷(五甲基二己基三胺，PMDHTA 104)形式的聚烷基三胺。参考图1，用于聚烷基三胺的烷基间隔基的n值可以为约3至约10，优选约3至约6。图1还说明了N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺TMHDA 106形式的聚烷基二胺。
聚烷基多胺可以是包含两个或更多个烷基和两个或更多个胺基的试剂化合物。在一个实施方案中，聚烷基多胺可以部分或全部胺基被烷基化。聚烷基多胺的烷基化胺基可具有部分或全部胺基为叔胺。尽管图1仅说明了具有与胺连接的烷基的聚烷基多胺试剂，但部分或全部烷基可以是烷基醚、环烷基、芳烷基及其组合。在一个实施方案中，连接在两个胺基团(即间隔基团)之间的烷烃可具有3至10个原子的长度，并且优选具有3至6个原子的长度。
多卤代烃可以是多卤代烷烃或多卤代烷基芳基。多卤代烷烃可以是二卤代烷烃，例如1-4-二溴丁烷DBB 202，如图2所示。多卤代烷基芳基可以是三卤代烷基芳基，例如1,3,5-三(溴甲基)苯TBMB 204，如图2所示。在一个实施方案中，二卤代烷烃可以由化学式206表示，如图2所示。与化学式206相关的值n可以为3至10，优选为3至6。
多卤代烃可以是包含两个或更多个与烃连接的卤基团的试剂化合物。卤基团可以是溴或碘基团。多卤代烃可具有2至10个卤基团，优选2至3个卤基团。在一个实施方案中，多卤代烃的两个卤基团之间的间隔基可具有3至10个原子的长度，并且优选具有3至6个原子的长度。在一对卤基团之间的多卤代烃的烃部分(间隔基)可包括烷基、环烷基、芳烷基、二烷基醚基团及其组合。
图3示出从与第一PMDPTA 102和第一DBB 202的反应形成的基础缩聚物层300的示意性表示，其中基础聚合物层300被连接到带负电荷的基材颗粒。带负电的基材颗粒可以作为填充床包含在色谱柱中。PMDPTA 102和二卤代烷烃202的溶液可以流过所述柱以在带负电的基材颗粒上形成基础缩聚物层。值得注意的是，基础缩聚物层300不具有β羟基，因为不使用环氧化物试剂。如图3所示，基础缩聚物层300包括季胺和叔胺。在一个方面，摩尔比可以是1：1摩尔比的PMDPTA 102和DBB 304以形成基础聚合物层。尽管基础聚合物层300被描绘为线性(通过PMDPTA 102的仅末端胺反应)，但如图3所示，可能的是一些中间胺基(例如302)被季铵化和形成支链或交联部分。基础层300可以在带负电的聚合颗粒的存在下形成，其中基础层与带负电的聚合颗粒缔合和/或部分结合，如图3所示。为简单起见，与季胺相关的溴化物盐未在图中显示。图3中的术语x可以为约5至约150。
带负电的聚合颗粒可以是在预期使用条件(例如，pH 0至14)下化学稳定的任何惰性聚合基材颗粒。聚合颗粒可以基于二乙烯基苯(DVB)交联单体和载体树脂单体，其中载体树脂单体可以为乙基乙烯基苯(EVB)单体、苯乙烯单体和其组合。DVB的摩尔百分比可以是55％，EVB可以是45％。载体树脂颗粒的直径范围可为约1微米至约20微米，优选约2微米至约10微米，并且更优选约3微米至约7微米。载体树脂颗粒的表面积范围可为约20m2/g至约800m2/g，优选约20m2/g至约500m2/g、更优选约20m2/g至约100m2/g，并且再更优选为约20m2/g至约30m2/g。载体树脂颗粒的孔径范围可为约1000埃至约2000埃。
在一些实施例中，带负电的基材颗粒可包括一种或多种超大孔颗粒(SMP)。SMP可以从商业来源获得，包括Agilent PLRP-s1000A和Waters Styragel HR4-HR6。超大孔颗粒的直径为4-6μm，表面积为20-30m2/g，孔径为
替代地，聚合颗粒可以基于其它乙烯基芳香族单体，如α-甲基苯乙烯、氯苯乙烯、氯甲基苯乙烯、乙烯基甲苯、乙烯基萘和其组合。聚合颗粒也可基于不饱和单体以及以上乙烯基芳香族单体和不饱和单体的共聚物。优选地，这类单体将与乙烯基芳香族交联单体(如二乙烯基苯)共聚，但也可使用其它乙烯基芳香族交联单体，如三乙烯基苯、二乙烯基萘和其组合。
可以将聚合颗粒磺化以至少在颗粒表面上产生负电荷。例如，用55％DVB和45％EVB制成的颗粒可以通过用冰醋酸和浓硫酸处理颗粒来磺化。
基础层300可以用试剂的许多反应循环反应，以形成聚烷基多胺缩聚物层。在一个实施方案中，反应循环的数量可以为1至10，优选3至10，更优选3至6。每个反应循环包括a)二卤代烷烃处理和b)聚烷基三胺处理。在进行多个反应循环后，聚烷基多胺缩聚物层可以与单卤代烷烃处理反应以烷基化任何残留的叔胺。
对于第一循环的第一步骤a)，第二DBB 202可与基础层300的叔胺反应，以形成具有侧链环氧基团402的第一烷基缩合反应产物(CRP)400，如图4所示。此外，将基础层300的至少一部分的叔胺302烷基化以形成具有正电荷的季胺。值得注意的是，季胺的这类正电荷被认为有助于基础层300离子结合到带负电的颗粒。基础缩聚物层300的季胺通过第一间隔基406或第二间隔基408间隔开。第一间隔基406由PMDPTA 102衍生和第二间隔基408由DBB202衍生，如图3和4所示。
对于第一循环的第二步骤b)，第一烷基CRP 400的侧链卤基团402可与第二PMDPTA(第二聚烷基三胺)反应以形成第一聚烷基多胺CRP 500，如图5所示。第一聚烷基多胺CRP500与第一烷基CRP 400共价连接。第一聚烷基多胺CRP 500的每个分支包括季胺502和两个叔胺504和506，如图5所示。尽管图5示出PMDPTA作为仅与仅一个末端胺基团502反应，但可能的是一些PMDPTA化合物通过使两个或三个胺基与第一烷基CRP 400的卤基团反应进行交联。此外，可能的是仅PMDPTA的中间胺基504与第一烷基CRP 400的卤化物基反应。
现在已经执行了两个步骤的一个反应循环，可以执行两个步骤的第二循环以产生超支化结构。对于第二循环的第一步骤a)，第一聚烷基多胺CRP 500的两个叔胺504和506可各自与两个二卤代烷(第三DBB)反应以形成第二烷基缩合反应产物600，如图6所示。第二烷基CRP 600与第一聚烷基多胺CRP 500共价连接。
虽然图6示出了每个二卤代烷化合物为仅与(两个卤基团的)仅一个卤基团反应，但可能的是某些二卤代烷化合物通过2个卤基团都与第一聚烷基多胺CRP 500反应交联或者二卤烷烃的一个卤基团与第一聚烷基多胺CRP 500的一部分反应而相同二卤烷烃的另一卤基团与第一聚烷基多胺CRP 500的另一部分反应。
对于第二循环的第二步骤b)，第二烷基CRP 600的侧链卤基团然后可与第三PMDPTA反应以形成第二聚烷基多胺CRP 700，其具有季胺702和两个叔胺704和706，如图7所示。第二聚烷基多胺CRP 700被共价连接至第二烷基CRP 600。
两个步骤的第三个反应循环可以用第二聚烷基多胺CRP 700来执行。对于第三循环的第一步骤a)，第一聚烷基多胺CRP 700的两个叔胺704和706可各自与两个二卤代烷烃(第四DBB)反应以形成第三烷基CRP(未示出)。应当指出，第三烷基CRP的结构类似于第二烷基CRP 600的结构。
对于第三循环的第二步骤b)，第三烷基CRP的侧链卤基团然后可与第四PMDPTA反应以形成具有两个叔胺的第三聚烷基多胺CRP(未示出)。应当指出，第三聚烷基多胺CRP的结构类似于第二聚烷基多胺CRP 700的结构。
在一个实施方案中，可以通过重复步骤a)和b)进行多于3个循环。应该注意，如图3至7所示，使用PMDPTA的反应可以通过用PMDHTA代替PMDPTA来改变。使用PMDPTA的阴离子交换固定相比使用PMDHTA的阴离子交换固定相具有更高密度的阴离子交换位点，因为间隔基链的长度从C3到C6增加。还应注意，图3至7是示例性的，并且PMDPTA可以被本文所述的其他聚烷基多胺取代，并且DBB也可以被本文所述的其他多卤代烃取代。
在另一个实施方案中，将描述使用三卤代烷基芳基化合物和聚烷基二胺的超支化离子交换固定相。图15示出了由与第一TMHDA 106和第一TBMB 204反应形成的基础缩聚物层1500的示意图，其中基础聚合物层1500附接到带负电的基材颗粒上。如图15所示，基础缩聚物层1500包括季胺。图15中的术语x可以为约5至约150。
基础层1500可以以试剂的若干反应循环反应，以形成聚烷基多胺缩聚物层。在一个实施方案中，反应循环的数量可以为1至10，优选3至10，更优选3至6。每个反应循环包括a)聚烷基二胺处理和b)三卤代烷基芳基处理。在进行多个反应循环后，聚烷基多胺缩聚物层可以与叔胺处理反应，以将剩余的溴甲基转化为季胺。
对于第一循环的第一步骤a)，第二TMHDA 106可与基础聚合物层1500的侧挂卤基团反应以形成第一聚烷基多胺CRP 1600，如图16所示。基础缩聚物层1500的季胺通过第一间隔基1602或第二间隔基1604间隔开。第一间隔基1602衍生自TBMB 204和第二间隔基1604衍生自TMHDA 106导出，如图15和16所示。
对于第一循环的第二步骤b)，第一聚烷基多胺CRP 1600的侧链叔胺1606可与第二TBMB 204(第二三卤代烷基芳基)反应以形成第一聚烷基芳基CRP1700，如图17所示。第一聚烷基芳基CRP 1700与第一聚烷基多胺CRP 1600共价连接。第一聚烷基芳基CRP 1700中每个苄基环包括两个卤基团，如图17所示。
现在已经执行了两个步骤的一个反应循环，可以执行两个步骤的第二循环以产生超支化结构。对于第二循环的第一步骤a)，聚烷基芳基CRP 1700的每个苄基环中的两个卤基团可以与第三TMHDA 106反应以形成第二聚烷基多胺CRP 1800，如图18所示。第二聚烷基多胺CRP 1800与第一聚烷基芳基CRP1700共价连接。
对于第二循环的第二步骤b)，第二聚烷基多胺CRP 1800的侧链叔胺基然后可以与第三TBMB 204进行反应，以形成第二聚烷基芳CRP 1900，如图19所示。所述第二聚烷基芳CRP 1900共价连接至所述第二聚烷基多胺CRP1800。
两个步骤的第三个反应循环可以用第二聚烷基芳基CRP 1900来执行。对于第三循环的第一步骤a)，所述第二聚烷基芳基CRP 1900的每个苄基环中的两个卤基团可以与第三TMHDA 106反应以形成第三聚烷基多胺CRP(未示出)。第三聚烷基多胺CRP与第二聚烷基芳基CRP 1900共价连接。应当指出，第三聚烷基多胺CRP的结构类似于第二聚烷基多胺CRP1800的结构。
对于第三循环的第二步骤b)，第三聚烷基多胺CRP的侧链叔胺基团然后可以与第四TBMB 204反应，形成第三聚烷基芳基CRP(未示出)。所述第三聚烷基芳基CRP共价连接至第三聚烷基多胺CRP(未示出)。应注意，第三聚烷基芳基CRP的结构类似于第二聚烷基芳基CRP 1900的结构。
在一个实施方案中，可以通过重复步骤a)和b)进行多于3个循环。当反应循环次数完成时，聚烷基多胺缩聚物层可以与叔胺处理反应，以将剩余的溴甲基转化为季胺。还应当指出，图15至19是示例性的，TMHDA可用具有至少两个胺基的其他聚烷基多胺取代以及TBMB204也可以用具有三个或更多卤基团的多卤烃取代。
以下将描述适用于包含四个电压的波形的色谱系统。图14示出色谱系统的实施方案，它是离子色谱系统1400，包括泵1402、电解洗脱液产生装置1403、脱气组件1410、注射阀1412、色谱分离装置1414、检测器1416和微处理器1418。再循环管线1420可用于将液体从检测器1416的输出转移到脱气组件1410的再生通道。脱气组件也可以是真空脱气机的形式。
泵1402可以被配置成从液体源抽吸液体并与电解洗脱液产生装置1403流体连接。电解洗脱液产生装置1403被配置成产生洗脱液，例如NaOH或甲磺酸。关于电解洗脱液产生装置(例如，洗脱液产生器)的详情可见于美国专利第6,225,129号和第6,682,701号中。在一个实施方案中，可以在洗脱液中产生或存在残余气体如二氧化碳、氢气和氧气。可以使用再循环液体通过位于检测器1416下游的再循环管线1420用脱气组件1410清除该气体。注射阀1412可用于将样品的等分试样注入到洗脱液流中。色谱分离装置1414(例如离子交换色谱柱)可用于将存在于液体样品中的各种基质组分与相关分析物分离。色谱分离装置1414的输出端可与检测器1416流体连接，以测量液体样品中分离的化学成分的存在。色谱分离装置1414可以在不同保留时间分离从色谱分离装置1414输出的样品的一种或多种分析物。
检测器1416可以是电化学检测器的形式，其包括流动通道，该流动通道构造成与至少工作电极、参考电极和任选的对电极流体接触。关于电化学检测器流通池和一次性工作电极的细节可以在美国专利8,925,374；8,342,007；和6,783,645中找到，其在此全部引入作为参考。电化学检测器还包括恒电位器或分析装置，以在工作电极和参考电极之间施加电压波形，并且可选地在对电极和工作电极之间传递电流。关于应用四极电压波形的分析装置的细节可以在美国专利8,636,885中找到，该专利在此全文引入作为参考。
电子电路可包括微处理器1418和存储器部分。微处理器1418可用于控制色谱系统1400的操作。微处理器1418可以整合到色谱系统1400中或为与色谱系统1400联通的个人电脑的一部分。微处理器1418可以被配置成与色谱系统的一个或多个组件，如泵1402、电解洗脱液产生装置1403、注射阀1412和检测器1416联通并对其加以控制。存储器部分可以包含关于如何应用一个或多个电压波形的幅度、极性和时序的指令。在测量方面，存储器部分还可以包含关于采样当前值以整合信号和/或测量特定时间段的总电荷的时间段的指令。
实施例1-使用五甲基二丙基三胺和1,4-二氨基丁烷合成阴离子交换树脂
在4×250mm(直径×长度)的色谱柱中填充6.5μm直径的颗粒，其具有表面磺化的(在室温下一小时)20.8m2/g宽-孔(DVB/EVB)。通过以下将基础缩合层施加到填充柱：使五甲基二丙基三胺(PMDPTA):1,4-二氨基丁烷(DBB)溶液混合物(在20％甲醇/80％乙腈中1:1摩尔比，相对于PMDPTA 50％(wt/wt％):相对于DBB 38％(wt/wt％))以0.5毫升/分钟流过70℃的柱持续90分钟以形成基础缩聚物300(参见图3)。接下来，4个试剂处理循环以0.5毫升/分钟流过70℃的柱。单个试剂处理循环包括第一步骤a)使38％(wt/wt％)DBB的20％甲醇/80％乙腈溶液流过柱持续60分钟以形成第一烷基缩合反应产物400(参见图4)，和第二步骤b)使50％(wt/wt％)PMDPTA的20％甲醇/80％乙腈溶液流过柱持续60分钟以形成第一聚烷基多胺缩合反应产物500(参见图5)。在完成第一试剂处理循环(步骤a)至b))之后，执行另外三个试剂处理循环。
实施例2-五甲基二己基三胺(PMDHTA)的合成
在一小时的时间内，将甲酸(150mL)滴加到65℃的双(六亚甲基)三胺(86克)和甲醛溶液(37％，223mL)的混合物中。使反应继续另外3小时。将反应冷却至环境温度后，加入氢氧化钠(固体，薄片，纯度：97％)直至pH为14。将反应混合物用***萃取，用盐水(饱和NaCl溶液)洗涤，然后用硫酸镁干燥。用旋转蒸发器除去挥发物后，通过Kugelrohr蒸馏在1.2mmHg和140℃下纯化残余物，得到63克PMDHTA。
实施例3-使用五甲基二己基三胺和1,4-二氨基丁烷合成阴离子交换树脂
使用6.2克超大孔树脂颗粒，其具有表面磺化(室温下1小时)、6.5μm直径和20.8m2/g宽孔(DVB/EVB)。用异丙醇(IPA)冲洗树脂以除去水。将漂洗过的树脂转移到小瓶中。接下来，将以下成分添加到小瓶中，其为6.0克IPA、2.9克PMDHTA和2克DBB。将具有添加成分的小瓶加热至70℃并使其反应165分钟。来自小瓶的反应成分形成附着在树脂颗粒上的基础缩聚层，将其过滤，然后用IPA洗涤。
接下来，将具有基础缩合层的过滤颗粒添加到小瓶中，其中在70℃下进行三个循环的试剂处理。单个循环的试剂处理包括第一反应步骤a)将6克IPA和2克DBB加入到含有过滤颗粒的小瓶中，并使其在70℃下反应120分钟。反应后，过滤小瓶中的内容物并用IPA洗涤。第二反应步骤b)将2克IPA和1.5克PMDHTA加入到含有步骤a)的过滤颗粒的小瓶中，并使其在70℃下反应120分钟。反应后，过滤小瓶中的内容物并用IPA洗涤。在完成试剂处理的第一循环(步骤a)至b))之后，进行另外两个试剂处理循环，其导致聚烷基多胺层与基础缩合层结合。
接下来，将具有聚烷基多胺层的过滤颗粒加入到小瓶中，使得任何剩余的叔胺可以季铵化。将2克IPA和1.5克甲基碘加入到含有过滤颗粒的小瓶中，并使其在70℃下反应120分钟。反应后，过滤小瓶中的内容物并用IPA、水和1M NaOH洗涤。将过滤和洗涤的颗粒装入色谱柱中。
实施例4-使用N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺和1,3,5-三(溴甲基)苯合成阴离子交换树脂
使用6.4克超大孔树脂颗粒，其具有表面磺化(室温下1小时)、6.5μm直径和20.8m2/g宽孔(DVB/EVB)。用溶剂混合物(20％甲醇/80％乙腈)冲洗树脂以除去水。将漂洗过的树脂转移到小瓶中。接着，将6.0克溶剂混合物和1.35克1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)加入到小瓶中并在加盖小瓶中在50℃下在烘箱中加热10分钟，以溶解TBMB。使用1.5克溶剂混合物将0.65克N,N,N′,N′-四甲基-1,6-己二胺(TMHDA)溶解在另一个小瓶中。在搅拌下将溶解的TMHDA滴加到含有TBMB的小瓶中。然后盖上小瓶并使其在50℃下反应30分钟。反应后，过滤小瓶的内容物并用溶剂混合物洗涤，得到具有基础缩合层的树脂颗粒。
接下来，将具有基础缩合层的过滤颗粒添加到小瓶中，其中在50℃下进行三个循环的试剂处理。单个循环的试剂处理包括第一反应步骤a)将3克溶剂混合物(20％甲醇/80％乙腈)和0.9克TMHDA加入到含有过滤颗粒的小瓶中，并使其在50℃下反应30分钟。反应后，过滤小瓶中的内容物并用溶剂混合物洗涤。第二反应步骤b)将3克溶剂混合物和0.9克TBMB加入到含有步骤a)的过滤颗粒的小瓶中，并使其在50℃下反应30分钟。反应后，过滤小瓶中的内容物并用溶剂混合物洗涤。在完成试剂处理的第一循环(步骤a)至b))之后，进行另外两个试剂处理循环，其导致聚烷基多胺层与基础缩合层结合。
接下来，将具有聚烷基多胺层的过滤颗粒加入到小瓶中，使得任何剩余的溴甲基基团可以反应。将2克溶剂混合物和1.5克33％三甲胺的乙醇溶液加入到含有过滤颗粒的小瓶中，并在环境温度下反应过夜。反应后，过滤小瓶中的内容物并用溶剂混合物、水和1MNaOH洗涤。将过滤和洗涤的颗粒装入色谱柱中。
实施例5-使用基于PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂的一系列洗脱液浓度的含有各种碳水化合物的标准溶液的色谱图
将实施例3的色谱柱安装到Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱系统(可从加利福尼亚州桑尼维尔的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，Sunnyvale，California)商购获得)中，方式类似于图14。使用泵将去离子水泵入ThermoScientific Dionex EGC 500NaOH柱(Thermo Fisher Scientific，Sunnyvale，Califomia)，以产生六种不同浓度之一的NaOH，即10、20、30、40、50和60mM NaOH。使用温度调节器将柱温保持在30℃。流速为1毫升/分钟，进样量为25L。检测器为装有一次性PTFE金电极的Thermo Scientific电化学检测器。该检测器在使用四波形的积分脉冲安培模式下操作。表1显示了四倍电压波形的施加电位和持续时间。
表1
时间(s)
电势(V)
积分
0.00
0.10
0.20
0.10
开始
0.40
0.10
结束
0.41
-2.00
0.42
-2.00
0.43
0.60
0.44
-0.10
0.50
-0.10
图8显示了六个色谱图，其中每个色谱图使用不同的NaOH洗脱液浓度。色谱图使用包含PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂和含有五种不同碳水化合物的标准溶液进行，其是卫矛醇(峰1，10ppm)、甘露醇(峰2，10ppm)、葡萄糖(峰3，10ppm)、果糖(峰4，10ppm)、蔗糖(峰5，10ppm)和乳糖(峰6，10ppm)。在测试的NaOH浓度范围内，卫矛醇和甘露醇(分别为峰1和2)具有相对恒定的保留时间。相反，葡萄糖、果糖和蔗糖峰(分别为峰3、4和5)随着NaOH洗脱液浓度的降低而具有增加的保留时间。每个峰3-5的保留时间的增加对洗脱液浓度具有不同的依赖性，因此对于60mM NaOH和10mM NaOH，峰洗脱顺序是不同的。峰3-5顺序的这种变化提供了操纵峰的保留时间的更大灵活性的优点，这可能是避免可能存在的潜在干扰阴离子所需的。使用10mM NaOH洗脱液(pH 12)，蔗糖(pKa为12.62)在果糖(pKa为12.03)之前很好地洗脱的事实表明固定相pH小于基于乳胶的Thermo Scientific Dionex CarboPac PA1固定相的pH值。当使用CarboPac PA1固定相时，申请人发现果糖和蔗糖在相同条件下共洗脱。在现有商业柱不能以低洗脱剂浓度(例如10mM)分离碳水化合物的重要混合物的情况下，这种固定相pH值的差异可用于提供替代的分离选择性。
实施例6-使用基于PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂的含有各种碳水化合物的标准溶液的色谱图
将实施例3的色谱柱安装到Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱系统(可从加利福尼亚州桑尼维尔的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Sunnyvale,California)商购获得)中，方式和条件类似于实施例5。然而，洗脱液浓度保持恒定在60mM NaOH，并使用含有蔗糖和乳糖的另外的标准溶液。
图9说明了两个色谱图，其中上部色谱图使用实施例5的标准溶液，下部色谱图使用含有蔗糖和乳糖的标准溶液(分别地峰值5在10ppm、峰值6在10ppm)。使用含有与实施例5相同的阴离子交换树脂的色谱柱进行色谱。上下色谱图一起表明所有六种碳水化合物都可以在一次色谱运行中解析。在下部色谱图中，应注意蔗糖和乳糖(分别为峰5和6)完全解析，这是一个优势，因为这些碳水化合物在色谱条件下难以解析。
实施例7-使用基于TBMB和TMHDA的阴离子交换树脂的一系列洗脱液浓度的含有各种碳水化合物的标准溶液的色谱图
将实施例4的色谱柱安装到Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱系统(可从加利福尼亚州桑尼维尔的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Sunnyvale,California)商购获得)中，方式类似于实施例5。与实施例5相反，仅使用三种NaOH浓度而不是六种。三种NaOH浓度为10、30和60mM NaOH。
图10显示了三个色谱图，其中每个色谱图使用不同的NaOH洗脱液浓度。色谱图使用包含TBMB和TMHDA的阴离子交换树脂和含有五种不同碳水化合物的标准溶液进行，其是卫矛醇(峰1，10ppm)、甘露醇(峰2，10ppm)、葡萄糖(峰3，10ppm)、果糖(峰4，10ppm)、蔗糖(峰5，10ppm)和乳糖(峰6，10ppm)。与实施例5类似，在测试的NaOH浓度范围内，卫矛醇和甘露醇(分别为峰1和2)具有相对恒定的保留时间。与实施例5类似，葡萄糖、果糖和蔗糖峰(分别为峰3、4和5)随着NaOH洗脱液浓度的降低而具有增加的保留时间。每个峰3-5的保留时间的增加对洗脱液浓度具有不同的依赖性，因此对于60mM NaOH和10mM NaOH，峰洗脱顺序是不同的。峰3-5顺序的这种变化提供了操纵峰的保留时间的更大灵活性的优点，这可能是避免可能存在的潜在干扰阴离子所需的。
实施例8-使用基于TBMB和TMHDA的阴离子交换树脂的含有各种碳水化合物的标准溶液的色谱图
将实施例4的色谱柱安装到Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱系统(可从加利福尼亚州桑尼维尔的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Sunnyvale,California)商购获得)中，方式和条件类似于实施例6。
图11说明了两个色谱图，其中上部色谱图使用实施例5的标准溶液，下部色谱图使用含有蔗糖和乳糖的标准溶液(分别地峰值5在10ppm、峰值6在10ppm)。使用含有与实施例4相同的阴离子交换树脂的色谱柱进行色谱。上下色谱图一起表明所有六种碳水化合物都可以在一次色谱运行中解析。在下部色谱图中，应注意蔗糖和乳糖(分别为峰5和6)完全解析，这是一个优势，因为这些碳水化合物在色谱条件下难以解析。
实施例9-使用基于PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂的含有胎球蛋白醛醇的样品溶液的色谱图
将实施例4的色谱柱安装到Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱系统(可从加利福尼亚州桑尼维尔的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Sunnyvale,California)商购获得)中，方式和条件类似于实施例5。使用泵泵送三种溶液的混合物(A.去离子水，B.0.1M NaOH和C.0.1M NaOH和0.25M乙酸钠)，在0.1M NaOH下在80分钟内梯度洗脱20至225mM乙酸钠。使用温度调节器将柱温保持在30℃。流速为1毫升/分钟和进样量为10μL的50μM胎球蛋白醛醇。使用酶PNGase F，从胎球蛋白释放糖醇。检测器为装有一次性PTFE金电极的Thermo Scientific电化学检测器。该检测器在使用四波形的积分脉冲安培模式下操作，如实施例5的表1中所述。
图12示出的色谱使用包括PMDHTA和DBB的阴离子交换树脂。将样品溶液注入含有胎球蛋白醛醇的色谱柱中，产生38个峰的测量。图12的色谱图显示了使用实施例4的色谱柱表征胎球蛋白释放的聚糖的效用。
实施例10-使用基于TBMB和TMHDA的阴离子交换树脂的含有胎球蛋白醛醇的样品溶液的色谱图
将实施例5的色谱柱安装到Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱系统(可从加利福尼亚州桑尼维尔的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Sunnyvale,California)商购获得)中，方式和条件类似于实施例9。图13示出的色谱使用包括TBMB和TMHDA阴离子交换树脂。将样品溶液注入含有胎球蛋白醛醇的色谱柱中，产生28个峰的测量。图13的色谱图显示了使用实施例5的色谱柱表征胎球蛋白释放的聚糖的效用。
虽然已经在本文中展示和描述本发明的优选实施方案，但本领域的技术人员应清楚，这类实施方案仅是作为举例而提供的。本领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下想到众多变化、改变和取代。虽然已经依据特定变型和说明性图式而描述本发明，但本领域的普通技术人员将认识到本发明不限于所描述的变型或图式。另外，在其中上述方法和步骤指示某些事件以某种次序存在的情况下，本领域的普通技术人员将认识到某些步骤的次序可以被修改并且这类修改符合本发明的变型。另外，这些步骤中的某些在可能时可以在一个平行过程中同时进行，以及如上文所描述依次进行。因此，在处于本公开的精神内或与权利要求书中所见发明等效的本发明变型所能达到的程度内，这一专利将意图同样涵盖那些变型。
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