阅读说明：本技术 pH比率型荧光探针SP-DCCH的制备方法及生物成像应用 (preparation method of pH ratio type fluorescent probe SP-DCCH and biological imaging application ) 是由 何晓俊 沈建良 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种pH比率型荧光探针SP-DCCH的制备方法及生物成像应用,用于酸性以及弱碱条件下与生物成像,通过检测该探针在不同pH缓冲液(1.68～7.21)中的荧光光谱,可以看出随着pH值的降低,pH比率型荧光探针在λ＝525nm处的荧光强度逐渐降低,在λ＝629nm处的荧光强度逐渐升高,说明pH比率型荧光探针对pH非常敏感,因此在pH检测方面具有良好的应用前景。(The invention discloses a preparation method of a pH ratio type fluorescent probe SP-DCCH and a biological imaging application, which are used for biological imaging under acidic and weak alkali conditions, and the fluorescence spectra of the probe in different pH buffer solutions (1.68-7.21) are detected, so that the fluorescence intensity of the pH ratio type fluorescent probe at the position of lambda 525nm is gradually reduced along with the reduction of the pH value, and the fluorescence intensity at the position of lambda 629nm is gradually increased, which shows that the pH ratio type fluorescent probe is very sensitive to pH, and therefore, the pH ratio type fluorescent probe has a good application prospect in the aspect of pH detection.)

pH比率型荧光探针SP-DCCH的制备方法及生物成像应用

技术领域

本发明涉及荧光成像分子探针领域，尤其是涉及一种pH比率型荧光探针SP-DCCH的制备方法及生物成像应用。

背景技术

细胞内环境中的pH在细胞活动中起重要作用。它与细胞增殖、凋亡、离子运输等密切相关。细胞内pH异常可能会造成一系列不良后果，甚至诱发细胞突变等。最新研究表明，pH的变化可能与某些疾病密不可分，例如神经退行性疾病，心血管疾病和癌症。

因此，准确检测细胞内的pH变化非常重要，这可以为我们研究细胞生理和病理过程提供有用的信息。传统检测pH的方法有电化学分析法、核磁共振法、紫外吸收光谱法、电化学法等，虽然这些方法也具有良好的准确性和灵敏度，但它们存在需要复杂的样品处理技术，仪器成本高以及灵敏度低等缺点。相较于这些分析方法，荧光分析法具有操作简单、灵敏度高、耗时短、选择专一、原位成像及无创检测等显著的优势。因此，荧光分析法广泛应用于环境科学、军事、生物医药、基因检测等领域。

目前已经有各种pH荧光探针问世。但这些探针在复杂的生物系统中都或多或少表现出不同的缺点，例如光漂白、较低的负载率和作用时间短。因此，有必要设计一种具有良好的光稳定性，高选择性和作用时间稳定的pH荧光探针。由于细胞本身的复杂性及其内环境不断变化，使用比率型荧光分析法已成为一种有效的检测方法，它可以抵消大多数因探针浓度、外部环境变化及光漂白的影响。因此，比率荧光分析可在复杂条件下提供更可靠的检测。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种良好的稳定性和高选择性的pH荧光探针。

为实现上述目的，本发明提供一种pH比率型荧光探针SP-DCCH，所述分子探针分子式为C₃₈H₄₂N₄O₄，其结构式为：

本发明还提供上述pH比率型荧光探针的制备方法，具体包括如下步骤：

含6-叔丁基-1′，3′，3′-三甲基螺并[2，2′-二氢吲哚]-8-甲醛的无水乙醇溶液制备的混合溶液的体积摩尔浓度为0.02-0.1mol/L，加入7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-碳酰肼，混合反应，过滤后用洗涤液洗涤得到产物，所述6-叔丁基-1′，3′，3′-三甲基螺并[2，2′-二氢吲哚]-8-甲醛和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-碳酰肼的摩尔比为：1∶1-2。

作为进一步改进，所述洗涤液为冷却后的乙醇或乙醚或两者混合液。

作为进一步改进，所述6-叔丁基-1′，3′，3′-三甲基螺并[2，2′-二氢吲哚]-8-甲醛和7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-碳酰肼的摩尔比为1∶1。

本发明还提供上述pH比率型荧光探针检测、识别环境中或生物样品中pH值的应用。

作为本发明的一种应用范围，所述pH比率型荧光探针检测、识别环境中或生物样品中pH值的应用，所述pH比率型荧光探针利用荧光成像检测正常细胞和活体体内的pH值的应用。

作为本发明的一种应用范围，pH比率型荧光探针检测、识别酸性或者弱碱性环境中或生物样品中pH值的应用。

作为本发明的一种应用方式，通过荧光分光光度法，以456nm为激发波长，在525nm、629nm的波长处测定pH值的荧光强度，通过计算F525/F629的荧光发射强度比率来测定pH值。

进一步的，所述F525/F629荧光发射强度比率与pH值检测结果的曲线关系为：y＝3.39*x-13.1。

进一步的，pH比率型荧光探针检测、识别酸性或者弱碱性环境中或生物样品中pH值的应用，精确检测范围为pH值4.0-6.0之间。

本发明具有如下优点：本发明设计了一种新型的pH比率型荧光探针并将其用于酸性以及弱碱条件下与生物成像。通过检测该探针在不同pH缓冲液(1.68～7.21)中的荧光光谱，可以看出随着pH值的降低，pH比率型荧光探针在λ＝525nm处的荧光强度逐渐降低，在λ＝629nm处的荧光强度逐渐升高，说明pH比率型荧光探针对pH非常敏感，随着pH的降低，探针分子由闭环结构逐渐变成开环结构，并可以在较长的时间里保持稳定。通过反复多次实验，该探针在pH为1.68和7.21的缓冲液中可逆程度高，稳定性较强。而且通过与不同阳离子及阴离子混合后的荧光强度比(F₅₂₅/F₆₂₉)检测结果，说明不易于受到其他离子的影响。后续在不同的pH下，MRC-5细胞中pH比率型荧光探针的共聚焦荧光成像示该探针具有良好的细胞膜渗透性，并且在pH＝1.68下MRC-5细胞在不同时间点的荧光显像可见该探针稳定性强、持续时间长。生物成像中，斑马鱼实验也印证了猜想。所以，本发明设计的pH比率型荧光探针可以用于检测溶液、活细胞以及斑马鱼中的pH，合成方法简单，操作方便，不需要苛刻的条件，因此在pH检测方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1：探针SP-DCCH的合成路线。

图2：(a)在各种pH值下(7.21至1.68)，SP-DCCH(20μM)在EtOH-PBS(1/100，V/V)中的吸收光谱；(b)在各种pH值下(7.30至1.68，λex＝456nm，Ex/Em＝2/2nm)，在EtOH/PBS(1/100，V/V)中SP-DCCH(10μM)的荧光光谱；(c)不同pH值下525nm和629nm下的荧光强度；(d)在不同pH值的EtOH-PBS缓冲液中SP-DCCH(10μM)的荧光强度比(F525/F629)。插图：F525/F629与pH值(4.20-7.21)之间的线性关系。

图3：(a)SP-DCCH(10μM)与各种pH值EtOH-PBS溶液的荧光强度比(F525/F629)随时间的变化；(b)pH 7.35和1.10之间的SP-DCCH(10μM)的荧光强度比(F525/F629)可逆情况；(c)用各种不同的pH值下拍摄的SP-DCCH(10μM)荧光和颜色；(d)在pH 7.21和3.02的缓冲溶液中与不同阳离子(1-12分别为：1：SP-DCCH，2：Zn²⁺，3：Ni²⁺，4：Cd²⁺，5：Al³⁺，6：Fe³⁺，7：pb²⁺，8：Co²⁺，9：Fe²⁺，10：Cr³⁺，11：Mn²⁺，12：Cu²⁺)混合的SP-DCCH(10μM)的荧光强度比(F525/F629)；(e)在pH 7.21和3.02的缓冲溶液中与不同阴离子(A-L分别为：A：SP-DCCH，B：SO₄ ^2-，C：CIO^-，D：HS^-，E：PO₄ ^3-，F：NO₃ ^-，G：Cl^-，H：CO₃ ^2-，I：S₂O₃ ^2-，J：SO₃ ^2-，K：Br-，L：SCN-.)混合的SP-DCCH(10μM)的荧光强度比(F525/F629)。

图4：SP-DCCH和SP-DCCH+H⁺分子轨道理论计算

图5：不同的pH条件下，MRC-5细胞中SP-DCCH(10μM)的共聚焦荧光成像。

图6：不同的pH条件下，铜绿假单胞菌中SP-DCCH(10μM)的共聚焦荧光成像。

图7：不同的pH条件下，斑马鱼中SP-DCCH(10μM)的共聚焦荧光成像。

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。

实施例1合成小分子探针

在20mL的无水乙醇中制备6-叔丁基-1′，3′，3′-三甲基螺并[2，2′-二氢吲哚]-8-甲醛(250mg，1.0mmol)，并充分搅拌在25℃下放置30分钟。将(210mg，1.0mmol)的7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-碳酰肼添加到上述反应体系中。在25℃下将反应搅拌20小时，将反应溶液过滤，并将固体用冰冷的乙醇和乙醚洗涤几次，以获得215mg目标产物(记为SP-DCCH)。固体粉末为橙色。产率：54％。

¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δin ppm：11.82(br s，2H)，8.54(s，1H)，8.78(s，1H)，8.43(s，1H)，8.35(s，1H)，7.73(s，1H)，7.81(br s，2H)，7.73-7.52(m，5H)，3.42(q，J＝6.8Hz，4H)，2.37(s，3H)，1.17(t，J＝6.8Hz，6H)，1.14(s，9H)，1.12(s，3H)，1.02(s，3H)；

HRMS(ESI)m/z[M+1]⁺：Calcd for C₃₈H₄₃N₄O₄，619.3279，found，619.3275。

合成小分子探针的路线图如图1所示，图1表示合成小分子探针的路线图，其中EtOH为乙醇。

实施例2小分子探针对pH值响应的紫外和荧光光谱

制备1mL小分子探针(10μM)的EtOH-PBS(v/v,１∶100)溶液。其中缓冲溶液选择不同的pH值实验组(7.2１至1.68)。

为了探索SP-DCCH对pH的光学响应，在不同pH梯度下进行了吸收和荧光光谱滴定。如图2a所示，SP-DCCH在中性介质(pH 7.21)中具有360至480nm的强吸收带，最大吸收波长为428nm。当pH逐渐降低时，在428nm处的谱带逐渐降低并消失。同时在410nm和500nm(λmax＝463nm)范围内产生了新的谱带，溶液的颜色从绿色变为黄色。该结果表明SP-DCCH可以用作通过光谱吸收强度监测pH的基础，或者可以粗略地用作肉眼pH检测器。SP-DCCH在中性介质(pH 7.21)中显示出明显的绿色荧光，并且在420nm激发时最大荧光波长为525nm。相反，如图2b所示，由于溶液系统的pH值下调(从7.21到1.68)，在相同的激发波长下，荧光逐渐从绿色变为红色，最大发射波长为629nm。而且，当pH从中性变为酸性(从7.21到1.68)时，随着酸度的增加，吸收光谱和荧光光谱分别发生红移35nm和104nm。

令人振奋的是，525nm和629nm的F525/F629荧光强度之比显示出10.2倍的增强(图2c)，并且根据经典的Henderson-Hasselbalch方程(log[((Fmax-F)/(F-Fmin))]＝pH-pKa)，计算得出SP-DCCH的pKa值为4.87(图2d)。

通过在(7.2１至1.68)的pH值下绘制相应的荧光强度比值(F525/F629)对应pH值进行线性校正，如图2d所示，通过绘制曲线，其计算公式为y＝3.39x-13.1(y表示pH值，x为读取的荧光强度)，可以获得良好的线性关系(R²＝0.9907)。此外，SP-DCCH可以响应低pH值，检测限为pH＝1.68。

值得注意的是，该比率与pH值在4.0和6.0之间具有良好的线性关系(R＝0.9907)，这表明该传感器具有以比率法检测pH值(4.0-6.0)的潜力。结果表明，比色和比色的单波长激发能有效消除背景干扰，提高检测精度。

实施例3验证小分子探针对pH响应的时间动力学研究

实验结果见图3(a)可见在较长的时间里，不同pH条件下荧光强度比(F₅₂₅/F₆₂₉)检测保持稳定。SP-DCCH探针在pH值酸性条件下，荧光增强并达到值的时间在150s以内，在150s后达到稳定。

图3(b)所示在pH＝1.68和pH＝7.21的条件下，对SP-DCCH的F₅₂₅/F₆₂₉随时间迁移变化进行的研究，共检测20次。可见通过反复多次实验，该探针在pH为1.68和7.21的缓冲液中可逆程度高，稳定性较强。

图3(d和e)不同阳离子和阴离子对小分子探针响应不同pH值影响，附图3d中的阳离子1-12分别是1：SP-DCCH，2：Zn²⁺，3：Ni²⁺，4：Cd²⁺，5：Al³⁺，6：Fe³⁺，7：pb²⁺，8：Co²⁺，9：Fe²⁺，10：Cr³⁺，11：Mn²⁺，12：Cu²⁺，图3e中的阴离子A-L分别是，A：SP-DCCH，B：SO₄ ^2-，C：ClO^-，D：HS^-，E：PO₄ ^3-，F：NO₃ ^-，G：Cl^-，H：CO₃ ^2-，I：S₂O₃ ^2-，J：SO₃ ^2-，K：Br^-，L：SCN^-。通过与不同阳离子及阴离子混合后的荧光强度比(F₅₂₅/F₆₂₉)检测稳定通过反复多次实验，该探针在为1.68和7.21的缓冲液中可逆程度高，稳定性较强。图3(d)、(e)分别示与不同阳离子或阴离子混合后的荧光强度比(F₅₂₅/F₆₂₉)检测稳定，说明该探针不易于受到其他离子的影响，稳定性与选择性强。

实施例4小分子探针在中性和酸性条件下分子轨道理论计算

为了了解SP-DCCH和SP-DCCH+H⁺质子化处理的光学性质，使用了随时间变化的密度泛函理论进行计算。如图4所示，SP-DCCH的最高占据分子轨道(HOMO)基本位于共轭体系的′DCCH′分子主链上，而最低未占据分子轨道(LUMO)主要集中在′SP′共轭体系的一部分。但是，SP-DCCH+H⁺的HOMO本质上位于“SP”分子骨架上，而LUMO主要集中于共轭体系的“DCCH”部分。两种形式的电子云分布完全相反，这进一步表明荧光信号在两个官能团之间切换。此外，以上实验结果证实了SP-DCCH和SP-DCCH+H⁺的最低能量跃迁均具有从HOMO到LUMO的独特性。此外，SP-DCCH+H⁺的HOMO-LUMO能隙(2.5896eV)明显小于SP-DCCH(3.2775eV)，这表明螺吡喃环开环后氧原子的质子化诱导了激活FRET过程。因此，光谱分析和理论计算有力地确定了反应机理。

实施例5小分子探针在正常细胞中成像效果

为了证明该探针检测活细胞内的pH值的能力，我们以对照组和实验组进行了成像分析。如图5所示，在不同的pH下，MRC-5细胞中SP-DCCH(10μM)的共聚焦荧光成像。可见该探针具有良好的细胞膜渗透性，随着pH的降低，绿色逐渐变为红色。图5为pH＝1.68下MRC-5细胞在不同时间点的荧光显像，可见该探针稳定性强、持续时间长。

实施例6小分子探针的在细菌中成像效果

细菌的重要运动通常受到外部环境的影响。在各种环境因素中，酸性环境是影响细菌存活的不利因素。大多数细菌已经进化形成有效的机制，以减少苛刻的酸性环境的影响。另外，据报道细菌能够通过自我调节在细胞质的相对酸性环境中维持相对较高的pH，这有助于其在人胃中存活。最重要的是，细菌内部的pH值对细菌细胞的生长，钙的调节，内吞作用，耐药性，细胞粘附和其他过程具有至关重要的作用。因此，测量细菌内部的pH变化对研究其抗酸机理，致病机理和预防有害细菌感染具有重要的现实意义。然而，很少有关于细菌中pH定位的研究的报道，这要求传感器具有较强的荧光强度和良好的生物相容性。为了进一步探索生物学应用，SP-DCCH通过生物成像技术用于检测铜绿假单胞菌的pH。如图6所示，铜绿假单胞菌与5μMSP-DCCH在pH7.21下孵育20分钟，并在绿色通道中显示出明显的荧光。随着pH值分别下调至5.09、3.02和1.68，绿通道中的铜绿假单胞菌的荧光信号被运走，红通道中的绿脓杆菌逐渐变亮，细菌的“棒状”形荧光图清晰可见。通过介导红色和绿色通道图像捕获重叠图像(Fred/Fgreen)，这是在pH降低后红色通道的突出运动。这些结果证明SP-DCCH可以在铜绿假单胞菌的pH图中实现，这是探索细菌致病机理的有力工具

实施例7小分子探针的在斑马鱼中成像效果

图7为在斑马鱼中的共聚焦荧光成像，显示出该探针在生物成像中也具有不错的效果。斑马鱼在胚胎培养基中培养，并与游离探针SP-DCCH(10μM)孵育20分钟以使SP-DCCH渗透到斑马鱼的整个组织中，它们在斑马鱼腹部区域显示出可见的绿色荧光，这表明该探针能够穿透斑马鱼组织并发出荧光。用SP-DCCH预处理体内pH值呈中性时斑马鱼时，红通道几乎没有发现荧光，在调节斑马鱼的体内pH值后，红色通道出现红色荧光，绿色通道的绿色荧光逐渐减弱消失。此外，体内pH值为1.68的斑马鱼用SP-DCCH处理染色，然后分别孵育5、10、20分钟，显示出明显的变化，绿色荧光逐渐消失，在斑马鱼的头和腹部红色荧光越来越突出。

本发明设计的pH比率型荧光探针可以用于检测溶液、活细胞以及斑马鱼中的pH值，合成方法简单，操作方便，不需要苛刻的条件，而且合成产率和纯度都很高，因此在pH检测方面具有良好的应用前景。

本发明所述的小分子探针可通过荧光光谱技术检测溶液的pH值。

本发明具有如下优点：本发明巧妙设计了一种新型的pH比率型荧光探针并将其用于极酸性条件下与生物成像。此探针可以用于检测溶液、活细胞以及斑马鱼中的pH值，合成方法简单，操作方便，不需要苛刻的条件，而且该探针在不同pH条件下可逆程度高，稳定性与选择性强，具有良好的细胞膜渗透性及定位能力。因此在pH检测方面具有良好的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。