阅读说明：本技术 羊种布鲁氏菌疫苗株m5提取的脂多糖在制备诊断人布鲁氏菌病的产品中的应用 (Application of lipopolysaccharide extracted from Brucella melitensis vaccine strain M5 in preparation of products for diagnosing human brucellosis ) 是由 张文宝 郭刚 李军 游锡火 贾斌 齐文静 吴熙然 郭宝平 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的脂多糖在作为人布鲁氏菌病诊断抗原中的应用。本发明发现从羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的LPS抗原作为诊断抗原的反应性明显优于目前市面上布病抗体快速检测试剂盒常用的布菌牛种S19株和布菌猪种S2株提取的LPS抗原,说明羊种布鲁氏菌疫苗株M5可以作为新的布病金标诊断LPS抗原的首选来源株,其提取的LPS对人感染布病具有较好的诊断价值,为人布病感染诊断抗原的选择提供了新的途径。本发明还发现无害化处理后的羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的LPS抗原并不影响其抗原性。(The invention discloses application of lipopolysaccharide extracted from a Brucella melitensis vaccine strain M5 in serving as a human Brucella disease diagnosis antigen. The invention finds that the reactivity of the LPS antigen extracted from the Brucella melitensis vaccine strain M5 taken as a diagnosis antigen is obviously superior to the LPS antigen extracted from the Brucella melitensis S19 strain and the Brucella melitensis S2 strain which are commonly used in the rapid detection kit for Brucella melitensis antibodies on the market at present, which indicates that the Brucella melitensis vaccine strain M5 can be taken as a first-choice source strain of a new Brucella melitensis gold-labeled diagnosis LPS antigen, the extracted LPS has good diagnosis value on human infectious brucellosis, and a new way is provided for selecting the human Brucella melitensis infection diagnosis antigen. The invention also finds that the LPS antigen extracted from the harmless treated Brucella melitensis vaccine strain M5 does not influence the antigenicity thereof.)

羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的脂多糖在制备诊断人布鲁氏菌 病的产品中的应用

技术领域

本发明涉及布鲁氏菌活疫苗提取抗原的应用技术领域，具体涉及羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的脂多糖在作为人布鲁氏菌病诊断抗原中的应用。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella，简称布菌)引起的严重人畜共患传染病，给人类健康造成了极大的危害，同时也给畜牧业造成了严重的经济损失。世界统计资料表明，每年布鲁氏菌病造成的经济损失将近30亿美元。由它引发的人类波浪热和低热，慢性感染引起的心脏、骨骼和神经系统病变，以及反刍动物流产和睾丸炎等疾病，至今仍无法根治。此外，布鲁氏菌还被用作生物武器。其在我国流行尤为严重，并被列为国家乙类法定报告传染病，对我国经济建设、人民的健康生活、国家安全等存在着严重威胁。

布病病原体为革兰氏染色阴性的小球杆状菌，营细胞内寄生，是具有独特的胞内生存机制及免疫机制的细胞内寄生菌。它侵入机体后，往往能够逃避机体的免疫应答从而得到生存及繁殖，这也是中晚期布病无法根治的主要原因。人感染布菌后临床表现较为复杂，可出现轻重不一的发热，多汗，关节痛等症状，由于临床症状非特异，发病隐匿及农牧区医疗条件等原因，往往使感染者错过了最佳治疗时间，导致长期迁延不愈，甚至出现严重并发症，丧失劳动能力。因此，布病的诊断对疾病的治疗和预后起关键作用，早诊断早发现是治愈布病的一个关键步骤，研发一款能够适用于农牧区基层使用的特异度和敏感度较高的快速诊断试剂盒，对早期诊断和发现患者显得尤为重要。目前虎红平板凝集试验(RBPT)是使用最为广泛的诊断方法，其具有价格便宜，检测快速等特点，但也存在抗原标准化生产困难，结果判定受人为因素影响及易与大肠埃希氏菌等革兰氏阴性菌出现交叉反应等问题。

布菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是菌体表面内毒素成分，由3个保守的结构域组成，即类脂A(内毒素性质)、核心寡聚糖和O抗原侧链多糖。布菌粗糙型LPS缺少O抗原组分，毒力相对光滑型弱。从布菌LPS中也可分离得到具有表面抗原成分的半抗原多糖(NH)和多糖B，LPS含有的外露多糖链阻碍了菌体外膜蛋白(OMPS、Bp26等)的暴露，而自身在刺激机体产生抗体方面起重要作用，从而成为机体保护性免疫反应的重要组分。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种脂多糖。

本发明提供的脂多糖是从羊种布鲁氏菌疫苗株M5中提取得到的脂多糖或是从经无害化处理后的羊种布鲁氏菌疫苗株M5中提取得到的脂多糖。

进一步的，所述无害化处理的方法为将羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液进行加热处理。

所述加热处理的条件可为95-100℃加热30-60min。

所述羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液为将羊种布鲁氏菌疫苗株M5接种至培养基进行培养后得到的菌液。

更进一步的，所述加热处理的条件为100℃加热30min。

所述培养基为LB液体培养基或布鲁氏菌培养基。所述LB液体培养基配方具体如下：氯化钠10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌。所述布鲁氏菌培养基配方具体如下：哥伦比亚琼脂(ISO)43g、葡萄糖10g，加1L去离子水，加热搅拌煮沸1min，使其完全溶解，高压蒸汽灭菌，待冷却至50℃左右时加入抗生素和灭活的马血清。

所述培养的条件为37℃振荡培养4h。

所述加热处理是通过可提供高温环境的设备和/或仪器来实现，所述可提供高温环境的设备和/或仪器可为水浴锅或其他任何可将溶液加热至95-100℃的设备和/或仪器。在实际应用中，可将含有所述羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液的容器置于水浴锅中进行加热处理，也可在含有所述羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液的容器里用蒸汽加热或直接煮沸的方式进行加热处理。

在本发明中，所述无害化处理的方法如下：将羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液置于10mL离心管中，然后将含有菌液的离心管放入水浴锅100℃煮30min。

所述脂多糖的提取方法可参照现有技术中的常规方法(如文献“Liu,Y.,Fratamico,P.,Debroy,C.,Bumbaugh,A.C.,&Allen,J.W..(2008).DNA sequencing andidentification of serogroup-specific genes in the Escherichia coli O118 Oantigen gene cluster and demonstration of antigenic diversity but only minorvariation in DNA sequence of the O antigen clusters of E.coli O118 andO151.Foodborne Pathogens and Disease,5(4),449-457.”中公开的方法)进行，也可采用脂多糖提取试剂盒(LPS Extraction Kit，韩国iNtRON公司，货号：17141)按照试剂盒中的说明书进行。

本发明的第二个目的是提供上述脂多糖在如下a)-c)中任一种中的应用：

a)制备人布鲁氏菌病诊断抗原；

b)作为人布鲁氏菌病诊断抗原；

c)制备诊断人布鲁氏菌病的产品。

本发明的第三个目的是提供一种胶体金试纸条。

本发明提供的胶体金试纸条包括底板、放置在其上的样品垫、包被有金标抗体的金标垫、含有检测线T和质控线C的检测垫和吸水垫；

所述检测线T包被有上述脂多糖。

进一步的，所述质控线C包被有羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体。

所述金标抗体为胶体金标记的羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体。

更进一步的，所述脂多糖为脂多糖溶液(溶剂为Tris buffer或PBS或生理盐水)，所述脂多糖溶液中的脂多糖浓度可为0.001-0.1mg/mL，具体为0.01mg/mL或0.02mg/mL。

所述羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体为羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体溶液或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体溶液(溶剂为Trisbuffer或PBS或生理盐水)，所述羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体溶液或所述羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体溶液中的抗体浓度可为0.1-2mg/mL，具体为1mg/mL。

本发明的第四个目的是提供一种制备上述胶体金试纸条的方法。

本发明提供的制备上述胶体金试纸条的方法包括如下步骤：

1)制备包被有金标抗体的金标垫和含有检测线T和质控线C的检测垫；

所述包被有金标抗体的金标垫按照如下方法制备：将胶体金溶液和抗体溶液混匀，反应，得到金标抗体；再将所述金标抗体加到玻璃纤维素膜上，得到包被有金标抗体的金标垫；

所述含有检测线T和质控线C的检测垫为将上述脂多糖和羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体分别包被在硝酸纤维素膜上，形成含有检测线T和质控线C的检测垫；

2)将所述包被有金标抗体的金标垫、样品垫、所述含有检测线T和质控线C的检测垫和吸水垫组装到底板上，得到所述胶体金试纸条。

上述方法中，所述1)中，所述胶体金溶液的制备方法(配制比例)具体如下：用超纯水清洗移液管，重复2-3次，用清洗过的移液管吸取1mL 1％(质量比体积)氯金酸加入到锥形瓶中，锡纸封口，磁力搅拌器上加热并搅拌，得到0.01％氯金酸溶液；在100mL的0.01％氯金酸溶液沸腾后，迅速加入2mL 1％(质量比体积)的柠檬酸三钠水溶液，继续加热10min，期间观察其颜色变化；室温冷却后，用超纯水定容至100mL，得到胶体金溶液。

所述胶体金粒径可为5-20nm。进一步的，所述胶体金粒径可为10-20nm。更进一步的，所述胶体金粒径为20nm。

所述抗体溶液为羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体溶液或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体溶液。所述羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体溶液或所述羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体溶液中的抗体浓度可为0.1-2mg/mL，具体为1mg/mL。

所述脂多糖为脂多糖溶液(溶剂为Tris buffer或PBS或生理盐水)，所述脂多糖溶液中的脂多糖浓度可为0.001-0.1mg/mL，具体为0.01mg/mL或0.02mg/mL。

所述羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体为羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体溶液或羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体溶液(溶剂为Trisbuffer或PBS或生理盐水)，所述羊(或任何实验动物)抗人IgG抗体溶液或所述羊(或任何实验动物)抗人IgM抗体溶液中的抗体浓度可为0.1-2mg/mL，具体为1mg/mL。

所述2)中，所述组装的具体步骤如下：

2-1)将样品垫和吸水垫裁剪成30×1.7cm大小，金标垫裁剪成30×0.5cm大小。

2-2)在底板上粘贴所述检测垫。

2-3)粘贴金标垫，将金标垫的1-1.5mm覆盖在检测垫上。

2-4)粘贴样品垫，将样品垫的2mm覆盖在金标垫上。

2-5)粘贴吸水垫，将吸水垫的1-1.5mm覆盖在检测垫上。

2-6)用衔接胶带固定每层的衔接部分。

2-7)将组装好的底板裁剪成2-6mm(如4mm)宽的试纸条，密封保存备用，得到胶体金试纸条。

上述胶体金试纸条或按照上述方法制备得到的胶体金试纸条在制备诊断人布鲁氏菌病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第五个目的是提供一种病原菌的无害化处理方法。

本发明提供的病原菌的无害化处理方法包括将病原菌菌液进行加热处理的步骤。

进一步的，所述菌液为将病原菌接种至培养基进行培养后得到的菌液。

所述病原菌为传染性病原菌，如布鲁氏菌，金黄色葡萄球菌，福氏志贺菌，肺炎链球菌，大肠埃希氏菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，结核分枝杆菌等。

所述无害化处理的方法为将所述菌液进行加热处理。

所述加热处理的条件可为95-100℃加热30-60min。

更进一步的，所述病原菌为布鲁氏菌(如羊种布鲁氏菌疫苗株M5、牛种布鲁氏菌S19株、猪种布鲁氏菌S2株)或金黄色葡萄球菌或福氏志贺菌。

所述加热处理的条件为100℃加热30min。

所述培养的条件为37℃振荡培养4h。

所述加热处理是通过可提供高温环境的设备和/或仪器来实现，所述可提供高温环境的设备和/或仪器可为水浴锅或其他任何可将溶液加热至95-100℃的设备和/或仪器。在实际应用中，可将含有所述羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液的容器置于水浴锅中进行加热处理，也可在含有所述羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液的容器里用蒸汽加热或直接煮沸的方式进行加热处理。

在本发明中，所述无害化处理的方法如下：将羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液或牛种布鲁氏菌S19株菌液或猪种布鲁氏菌S2株菌液或金黄色葡萄球菌菌液或福氏志贺菌或大肠杆菌或结核分枝杆菌菌液置于10mL离心管中，然后将含有菌液的离心管放入水浴锅100℃煮30min。

上述无害化处理方法在如下A1)或A2)中的应用也属于本发明的保护范围：

A1)消除病原菌的感染性；

A2)制备病原菌所致疾病诊断抗原。

进一步的，所述A1)中，所述病原菌为传染性病原菌；所述消除病原菌的感染性为消除传染性病原菌的感染性且保持传染性病原菌的抗原性。

所述A2)中，所述病原菌所致疾病诊断抗原不具有感染性。

更进一步的，所述A1)中，所述病原菌为布鲁氏菌(如羊种布鲁氏菌疫苗株M5、牛种布鲁氏菌S19株、猪种布鲁氏菌S2株)或金黄色葡萄球菌或福氏志贺菌或大肠杆菌或结核分枝杆菌。

所述A2)中，所述病原菌所致疾病为布鲁氏菌所致疾病(如布鲁氏菌病)或金黄色葡萄球菌所致疾病或福氏志贺菌或大肠杆菌或结核分枝杆菌所致疾病。

本发明首次公开了羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的脂多糖(LPS)在作为人布病诊断抗原中的应用。通过实验结果可知，从羊种布鲁氏菌疫苗株M5中提取的LPS抗原作为金标快速诊断抗原其反应性明显优于目前市面上布病抗体快速检测试剂盒常用的牛种S19株及猪种S2株提取的LPS抗原，说明该布菌疫苗株可以作为新的布病金标诊断LPS抗原的首选来源株，其提取的LPS对人布病具有较好的诊断价值，为人布病感染快速诊断抗原的选择提供了新的途径。本发明还发现无害化处理后的羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的LPS抗原并不影响其抗原性。无害化处理可以完全消除布鲁氏菌的感染性，使之后续的处理过程对人和对环境做到无感染危害。

附图说明

图1为羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的LPS作为诊断抗原与其他来源的LPS的敏感度和特异度比较。图1A中检测血清为阳性血清；图1B中检测血清为阴性血清。其中，a为布菌牛种S19株菌体经无害化处理后提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；b为羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌体经无害化处理后提取的LPS(浓度为0.02mg/mL)；c为福氏志贺菌菌体经无害化处理后提取的LPS(浓度为05mg/mL)；d为从金黄色葡萄球菌菌体经无害化处理后提取的肽聚糖(浓度为0.5mg/mL)；e为正常人血清(质控点)。

图2为布菌猪种S2株、布菌牛种S19株菌体经(或未经)无害化处理后提取的LPS及布菌膜蛋白Omp2a作为诊断抗原的反应性比较。1为布菌牛种S19株菌体未经无害化处理后提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；2为布菌猪种S2株菌体经无害化处理后提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；3为LPS成品(浓度为0.5mg/mL)；4为布菌牛种S19株菌体经无害化处理后提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；5为布菌Omp2a膜蛋白(浓度为0.4mg/mL)。

图3为胶体金试纸条对布菌阳性血清的检测结果。

图4为胶体金试纸条对布菌阴性血清的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的羊种布鲁氏菌疫苗株M5是新疆天康畜牧生物技术股份有限公司的产品，产品目录号为CVCC18。

下述实施例中的布菌牛种S19株是重庆澳龙生物制品有限公司的产品。

下述实施例中的布菌猪种S2株是重庆澳龙生物制品有限公司的产品。

下述实施例中的LPS成品是杭州亿米诺生物科技有限公司的产品，其为从布菌牛种S19株提取获得的产品。

下述实施例中的布菌Omp2a膜蛋白记载于文献“Pathak P,Kumar A,ThavaselvamD.Evaluation of recombinant porin(rOmp2a)protein as a potential antigencandidate for serodiagnosis of Human Brucellosis[J].BMC Infectious Diseases,2017,17(1):485”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、羊种布鲁氏菌疫苗株M5的LPS抗原提取

供试菌株：羊种布鲁氏菌疫苗株M5、布菌猪种S2株、布菌牛种S19株、福氏志贺菌(福氏志贺菌分离自新疆医科大学第一附属医院住院患者，经鉴定确认为福氏志贺菌，患者知情同意)、金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌分离自新疆医科大学第一附属医院住院患者，经鉴定确认为金黄色葡萄球菌，患者知情同意)。

一、菌株培养及无害化处理

实验开始之前所有实验操作人员应做好防护措施，穿戴一次性手套、一次性手术防护衣、一次性防护口罩、一次性鞋套等，在生物安全柜内操作。实验操作步骤如下：

1、从4℃冰箱里取出含30％甘油的液体培养基里冻存的菌种，使用之前要仔细观察菌株，如发现浑浊现象，请勿使用。

2、将供试菌株用PBS进行1：10稀释，取10μL稀释后的菌液划线于LB营养琼脂平板(布鲁氏菌使用血琼脂平板)。

3、待菌落长出后，挑取菌落转接于新鲜的LB液体培养基(LB液体培养基配方：氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌)中，37℃振荡培养4h至OD₆₀₀值为1.0时停止培养。

4、将菌液置于离心管中，然后将含有菌液的离心管放入水浴锅100℃煮30min进行无害化处理，无害化处理后5000g离心5min，收集菌体备用。

二、LPS提取

使用脂多糖提取试剂盒(LPS Extraction Kit，韩国iNtRON公司，货号：17141)提取步骤一获得的菌体中的LPS(金黄色葡萄球菌菌体中提取肽聚糖，肽聚糖提取方法同LPS提取方法)，获得菌体LPS(或肽聚糖)。LPS的提取率与培养基的体积成正比，在5mL的培养基中，LPS的产量最高。通常在OD₆₀₀为0.8-1.2条件下，每个提取单位用菌量为2mL培养菌液，整个提取实验步骤分三步，分别为裂解、纯化、洗涤。

1、裂解：细菌细胞被试剂盒提供的裂解液裂解。细胞膜的磷脂和蛋白质成分被破坏，细胞成分在溶液中释放。具体操作步骤如下：

①取细菌培养液2mL，在室温下以13000转/分的离心速度，沉淀细菌，弃去上清液，对于沉淀的细胞，通过重复敲打试管的方式，让细胞沉淀彻底松弛。如果不充分松弛细胞沉淀可能导致无效溶解和降低LPS产量。

②加入1mL裂解缓冲液并进行震荡。注意：为了提高细菌的充分裂解应用力的去震荡直到细胞团消失。

③加入200μL氯仿后，用力震荡10-20秒，在室温下孵育5分钟。注：在震荡之前观察试管。当加入氯仿时，氯仿层向下移动时，会看到上层的蓝色沉淀的下面形成一条白线。氯仿层往下移动的时候可以看到白色的线，这个区域包含了细胞裂解的碎片、蛋白质、基因组DNA和RNA。加入氯仿的目的是去除蛋白。以13000转/分的转速在4℃下离心10分钟。转移400mL上清液至新的1.5mL试管。注：当上层移液时，注意形成白色沉淀物，不要把白色沉淀物吸取。

2、纯化：纯化的主要目的就是用高盐浓度溶液纯化释放细胞组分中的LPS。具体操作步骤如下：加入800μL纯化缓冲液，搅拌均匀。在-20℃下孵育10分钟。注意：该步骤的目的把LPS从蛋白质、核酸、脂类中取出来。4℃，13000转/分离心15分钟后，移除上层以获得LPS沉淀颗粒。

3、洗涤：对于高质量的LPS，通过洗涤步骤去除盐类。具体操作步骤如下：

①加入1mL 70％(体积分数)的乙醇溶液，通过将试管倒置的方法进行2～3次，洗涤LPS颗粒。将混合物在4℃条件下以13000转/分的速度离心3分钟。丢弃上层，干燥剩余的LPS颗粒。注意：该阶段为清洗阶段，用于去除盐等杂质。须在室温下干燥LPS沉淀颗粒。

②LPS颗粒中加入30-50μL 10mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。震荡或用移液枪混匀。煮沸2分钟以便完全溶解LPS。

实施例2、羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的LPS抗原在作为人布病诊断抗原中的筛选、确认和应用

分别使用实施例1中从羊种布鲁氏菌疫苗株M5、布菌猪种S2株、布菌牛种S19株、福氏志贺菌中提取的LPS，从金黄色葡萄球菌提取的肽聚糖，以及购买自杭州亿米诺生物科技有限公司的LPS成品结合免疫渗透金标检测技术比较不同来源的LPS或肽聚糖作为诊断抗原的反应性。具体步骤如下：

1、将不同来源和不同浓度的抗原各取0.5μL加入加样孔内硝酸纤维膜(NC膜，孔径0.45μm，GE公司，货号为10600002)，等待薄膜吸入。各抗原的加样位置如图1和图2所示，加入抗原及浓度分别如下：

①羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌体经无害化处理(煮沸半小时)后提取的LPS(浓度为0.02mg/mL)；

②布菌牛种S19株(重庆澳龙生物制品有限公司)菌体未经无害化处理直接提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；

③布菌牛种S19株(重庆澳龙生物制品有限公司)菌体经无害化处理(煮沸半小时)后提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；

④布菌猪种S2株(重庆澳龙生物制品有限公司)菌体经无害化处理(煮沸半小时)提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；

⑤福氏志贺菌菌体经无害化处理(煮沸半小时)提取的LPS(浓度为0.5mg/mL)；

⑥金黄色葡萄球菌菌体经无害化处理(煮沸半小时)提取的肽聚糖(浓度为0.5mg/mL)；

⑦LPS成品(浓度为0.5mg/mL)；

⑧布菌Omp2a膜蛋白(浓度为0.4mg/mL)；

⑨正常人血清(布病抗体阴性)。

2、用封闭液封闭NC膜。

3、取检测血清(用样品稀释液1:5稀释，检测血清为阳性血清或阴性血清，阳性血清为布病患者血清，阴性血清为非布病患者血清)100μL加入反应孔，等待薄膜吸入。

4、在反应孔中滴加2滴(约100μL)洗涤液。

5、在反应孔中加入1滴(约50μL)标记胶体金的羊抗人IgG抗体(购自Sigma公司)，在下行渗透的过程中，与已锚定在膜上的待检物质反应而将胶体金滞留下来，呈现出红色的斑点。

6、在反应孔滴加2滴(约100μL)洗涤液。观察并记录结果。

结果表明：羊种布鲁氏菌疫苗株M5经无害化处理后提取的LPS(0.02mg/mL)其反应性与布菌牛种S19株经无害化处理后提取的LPS(0.5mg/mL)的反应性相似，其敏感度是后者的25倍(图1)，而来源于福氏志贺菌的LPS及来源于金黄色葡萄球菌的肽聚糖，与布病患者血清不反应。另外由图2可见，布菌猪种S2株和布菌牛种S19株(经或不经无害化处理)的LPS上样浓度为0.5mg/mL时，反应性最佳且二者反应效果相当。以上结果说明本发明的羊种布鲁氏菌疫苗株M5所提取的LPS诊断价值最高，其反应敏感度明显优于布菌猪种S2株和布菌牛种S19株所提取的LPS。

实施例3、胶体金试纸条的制备及其敏感度与特异度检测

一、胶体金试纸条的制备

1、含有检测线T和质控线C的检测垫的制备

1)包被抗原的制备

将实施例1中从羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取的LPS配制成浓度为0.01mg/mL的LPS抗原溶液(溶剂为Tris buffer)。

2)含有检测线T和质控线C的检测垫的制备

在硝酸纤维素膜(Millipore Hi-Flow Puls HFB13502)上分别包被检测线(T线)和质控线(C线)：T线包被羊种布鲁氏菌疫苗株M5提取LPS抗原溶液(用pH8.0，Tris-HCl缓冲液稀释至0.01mg/mL划线)；C线包被羊抗人IgG抗体(购自Sigma公司)溶液(用Tris buffer稀释至1mg/mL划线)，得到包被抗原的检测垫。

2、金标垫的制备

1)胶体金溶液的制备

利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，具体步骤如下：用超纯水清洗1mL移液管，重复2-3次，用清洗过的移液管吸取1mL 1％(质量比体积)氯金酸加入到锥形瓶中，锡纸封口，磁力搅拌器上加热并搅拌，得到0.01％氯金酸溶液；在100mL的0.01％氯金酸溶液沸腾后，迅速加入2mL 1％(质量比体积)的柠檬酸三钠水溶液，继续加热10min，期间观察其颜色变化；室温冷却后，用超纯水定容至100mL，得到胶体金溶液(胶体金粒径为20nm)；4℃保存。

2)金标抗体的制备

将羊抗人IgG抗体(购自Sigma公司)用生理盐水稀释至浓度为1mg/mL，得到抗体溶液；然后将100mL的胶体金溶液与0.3mL的抗体溶液混匀，4℃避光孵育50-60min，再加入封闭液(含30-50％的蔗糖、5-10％鱼胶蛋白或牛血清白蛋白的Tris-HCL缓冲液)混匀进行封闭，以孔径为0.22μM的滤膜过滤，得到金标单抗蛋白复合物；将金标单抗蛋白复合物于4℃、15000r/min条件下离心40分钟，弃上清，收集沉淀；向沉淀中加入1/10体积的胶体金抗体保存溶液，得到金标抗体溶液。

3)金标垫的制备

将上述2)制备的金标抗体溶液均匀地滴加医疗等级的玻璃纤维素膜(玻纤8965，上海捷宁生物)上，37℃烤箱中2h，锡纸包好后干燥器内保存备用，得到包被有金标抗体的金标垫。

3、胶体金试纸条的组装

试纸条按照层析方向依次由样品垫(GF-06，上海捷宁生物)、上述2制备的金标垫、上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫(Sartorius CN140，6613，上海捷宁生物)组成。具体组装步骤如下：

1)将样品垫和吸水垫裁剪成30×1.7cm大小，金标垫裁剪成30×0.5cm大小。

2)在底板上粘贴上述1制备的检测垫。

3)粘贴金标垫，将上述2制备的金标垫的1-1.5mm覆盖在检测垫上。

4)粘贴样品垫，将样品垫的2mm覆盖在金标垫上。

5)粘贴吸水垫，将吸水垫的1-1.5mm覆盖在检测垫上。

6)用衔接胶带固定每层的衔接部分。

7)将组装好的底板裁剪成4mm宽的试纸条，密封保存备用，得到胶体金试纸条。

4、胶体金试纸条的检测方法

取原倍或1:1倍稀释后的血清样品5μL滴加于上述3制备的胶体金试纸条的样品垫上，然后滴加50-100μL的抗体稀释液，10min内判定结果。根据T线、C线的显色情况判断是否感染布病：C线显示红色色带，T线显示红色色带，判为阳性；C线显示红色色带，T线不显示红色色带，判为阴性。C线不显示红色色带，无论T线是否显示红色色带，该结果均判为无效。

二、胶体金试纸条的敏感度检测

1、供试样本一敏感度检测

供试样本一：从新疆布病疫区收集的139份经虎红平板凝集试验(RBPT)与试管凝集试验(SAT)诊断鉴定均为布鲁氏菌病患者(患者均知情同意)的血清。

用步骤一中制备的胶体金试纸条检测供试样本。

检测结果如表1所示。结果显示：本发明制备的胶体金试纸条的检测敏感度达100％。部分样本在胶体金试纸条上的显色结果如图3所示。

表1、金标法与RBPT、SAT检测阳性比较的敏感度

样品来源	RBPT阳性数(例)	SAT阳性数(例)	金标阳性数(例)	敏感度％
					霍城县	35	35	35	100
裕民县	39	39	39	100
					托里县	40	40	40	100
额敏县	25	25	25	100
					合计	139	139	139	100

注：*试管凝集试验效价<1/100。

2、供试样本二敏感度检测

供试样本二：来源于新疆塔城地区的19例发热两周的经ELISA法检测的布病IgM抗体均为阳性的布鲁氏菌病患者(患者均知情同意)的血清。

用步骤一中制备的胶体金试纸条检测供试样本。

检测结果如表2所示。结果显示：本发明制备的胶体金试纸条的检测敏感度达100％。对布病的早期诊断早期治疗具有重要意义。

表2、金标法与ELISA法检测布病IgM抗体阳性比较的敏感度

样品来源	ELISA阳性数(例)	金标阳性数(例)	敏感度％(例)
				新疆塔城地区	19	19	100
合计	19	19	100

注：IgG是反映过去感染的指标；IgM是反映近期是否感染的指标。

3、供试样本三敏感度检测

供试样本三：来自于新疆昌吉州地区的10例经诊断鉴定为布鲁氏菌阳性的羊血清。用步骤一中制备的胶体金试纸条检测供试样本。

结果显示：10例布鲁氏菌阳性的羊血清的检测结果均为阳性。本发明制备的胶体金试纸条的检测敏感度达100％。

三、胶体金试纸条的特异度检测

供试样本：从新疆各地及上海收集的363份非布病血清，包括健康体检人群、肝硬化和肝癌患者、类风湿等自身免疫性疾病患者及新疆地方病(结核病，包虫病等)患者血清。用步骤一中制备的胶体金试纸条检测供试样本。

结果如表3所示，结果显示：本发明制备的胶体金试纸条的特异度在91.4％以上，特异度良好。部分样本在胶体金试纸条上的显色结果如图4所示。

表3、金标法检测布病抗体特异度检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。