阅读说明：本技术 维生素d3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞中的应用 (Application of vitamin D3 and analogues thereof in promoting differentiation of human skin fibroblasts into adipocytes ) 是由 张传茂 王向阳 于 2020-04-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供维生素D3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞中的应用,其是将人皮肤成纤维细胞在进行体外诱导分化之前,用终浓度为10-100nM的维生素D3或其类似物对细胞进行预处理。本发明在原有“6+2+8”诱导分化模式的基础上,通过维生素D3或其类似物的预处理,显著地提高了人皮肤成纤维细胞分化成脂肪细胞的效率。采用本方法可以高效地将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞,为临床上的皮肤创伤愈合、疤痕修复以及脂营养不良症的治疗提供了新思路、新方法。(The invention provides an application of vitamin D3 and an analogue thereof in promoting human skin fibroblasts to differentiate into adipocytes, which is to pre-treat human skin fibroblasts with vitamin D3 or an analogue thereof with a final concentration of 10-100nM before the human skin fibroblasts are subjected to in vitro induced differentiation. On the basis of the original 6+2+8 induced differentiation mode, the invention obviously improves the efficiency of differentiating the human skin fibroblasts into the adipocytes by the pretreatment of the vitamin D3 or the analogues thereof. The method can efficiently induce and differentiate human skin fibroblasts into adipocytes, and provides a new thought and a new method for clinical skin wound healing, scar repair and treatment of lipodystrophy.)

维生素D3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细 胞中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及维生素D3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞中的应用。

背景技术

CN201910876049.6公开了一种体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，利用此法人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的效率相对较低，很难在临床上广泛用于创伤修复、疤痕修复以及脂营养不良症治疗等。

发明内容

本发明的目的是提供维生素D3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞中的应用。

本发明的另一目的是提供一种高效地体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供维生素D3及其类似物在促进人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞中的应用。

所述应用包括：人皮肤成纤维细胞在进行体外诱导分化之前，用终浓度为10-100nM(优选10nM或50nM)的维生素D3或其类似物对细胞进行预处理。

本发明中，维生素D3的类似物可以是钙泊三醇(Calcipotriol)。

第二方面，本发明提供体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，将人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养，待细胞汇合度达50-70％，加入终浓度为10-100nM(优选10nM或50nM)的维生素D3或其类似物(钙泊三醇)，对细胞预处理12-48小时，然后进行诱导分化；

诱导分化的步骤包括：将培养基换成诱导分化培养基①，培养6-10天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2-4天；最后，将诱导分化培养基②换成基础培养基，培养8-14天，每两天换液一次；

其中，所述基础培养基为含10-20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基；

所述诱导分化培养基①为含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素、1-2μM罗格列酮和0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；

所述诱导分化培养基②为含10-20μg/mL胰岛素的基础培养基。

优选地，所述基础培养基为含20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基。

优选地，所述诱导分化培养基①为含1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮和0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。

优选地，所述诱导分化培养基②为含20μg/mL胰岛素的基础培养基。

上述培养基最好现配现用，避免药物的有效成分降解。

在本发明的一个

具体实施方式

中，体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法包括：将人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养并传至10代以内(优选2-7代，更优选7代)，待细胞汇合度达50-70％，加入终浓度为10-100nM(优选10nM或50nM)的维生素D3或其类似物，对细胞预处理24小时；然后，将培养基换成诱导分化培养基①，培养6天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2天；最后，将诱导分化培养基②换成基础培养基，培养8天，每两天换液一次；

其中，所述基础培养基为含20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基；

所述诱导分化培养基①为含1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮和0.5mM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；

所述诱导分化培养基②为含20μg/mL胰岛素的基础培养基。

本发明中，细胞培养条件为：35℃～37℃，5％CO₂，优选37℃，5％CO₂。

第三方面，本发明提供按照上述方法制备的脂肪细胞。

第四方面，本发明提供所述脂肪细胞的以下任一应用：

(1)用于制备生物医用材料及组织修复材料；

(2)用于创伤修复和疤痕修复；

(3)用于治疗脂营养不良症。

本发明中使用的细胞来源是原代人皮肤成纤维细胞(HDF)，取材及分离方便。细胞分离方法如下：首先，从志愿者皮肤上取下直径为1mm的皮肤组织，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3次；然后，在超净工作台中用眼科剪去除多余的脂肪组织，并且剪碎剩下的组织，用PBS清洗3次；然后加入0.25％的胰酶1-2mL浸没所有的组织块，放在含有5％CO₂的细胞培养箱中，37℃消化5-10min；消化结束后，加入1mL基础培养基终止消化。然后用移液枪轻轻反复吹吸，将细胞团吹散。最后，将细胞悬液分别转移到35mm培养皿中，加入4mL基础培养基，放在细胞培养箱中，在5％CO₂，37℃条件下培养4-6天。培养过程中，可以根据培养皿内培养基的量，适当补加培养基。最后，分离出的细胞就是原代人皮肤成纤维细胞。待细胞长满后，进行传代培养。在整个细胞分离过程中，要保证无菌操作，避免污染。待细胞分离出来后，要进行支原体检测，确定没有支原体污染后，细胞才可以用于后续实验。我们通过多次诱导分化实验发现，用于诱导分化的HDF细胞代数不要太高，最好在10代以内；10代以上的HDF细胞诱导分化效率比较低，并且代数越高，诱导分化越难，分化效率越低。因此，为了便于以后的诱导分化实验，要尽可能多地冻存代数低的HDF细胞。

诱导分化方案：整个HDF细胞诱导分化过程主要包括预处理、诱导分化两部分。首先，在HDF细胞汇合度达到50-70％时，进行维生素D3(1,25-Dihydroxyvitamin D3，Calcitriol)或其类似物钙泊三醇(Calcipotriol)预处理24小时。然后，按照“6+2+8＝16天”分化模式进行诱导分化，即诱导分化培养基①诱导6天，诱导分化培养基②诱导2天，基础培养基继续培养8天。这种“先用维生素D3或其类似物预处理，再诱导分化”的模式，极大地提高了人皮肤成纤维细胞分化成脂肪细胞的效率。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明在原有“6+2+8”诱导分化模式的基础上，通过维生素D3或其类似物(钙泊三醇)的预处理，显著地提高了人皮肤成纤维细胞分化成脂肪细胞的效率。以钙泊三醇为例，先对人成纤维细胞进行10nM钙泊三醇预处理24小时，再按照“6+2+8”模式进行诱导分化，最后获得的脂肪细胞数是对照组(未经钙泊三醇预处理)的2.5倍，脂肪细胞标志基因(Adiponectin、Fabp4和Leptin)表达量提高了2倍。采用本方法可以高效地将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞，为临床上的皮肤创伤愈合、疤痕修复以及脂营养不良症的治疗提供了新思路、新方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。

图2为本发明实施例1中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。

图3为本发明实施例1中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。

图4为本发明实施例2中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。

图5为本发明实施例2中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。

图6为本发明实施例2中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。

图7为本发明实施例3中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。

图8为本发明实施例3中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。

图9为本发明实施例3中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。

图10为本发明实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。

图11为本发明实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。

图12为本发明实施例4中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。

图2-图3，图5-图6，图8-图9，图11-图12中，***表示P<0.001，****P<0.0001，不同处理组之间的差异具有统计学意义。

具体实施方式

本发明提供一种高效地体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。包括以下步骤：

1、取出泡在75％酒精中的盖玻片，在酒精灯上灼烧灭菌，然后铺在35mm的培养皿中，每个培养皿铺4个盖玻片；

2、向培养皿中加入4ml基础培养基，并用镊子将重叠的盖玻片铺开，以备后面细胞传代使用；

3、待10cm培养皿里的原代HDF细胞长满后，吸掉培养皿中的培养基，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2次，每次2ml；然后吸掉PBS，加入1ml浓度为0.25％的胰酶，双手反复晃动培养皿，使胰酶均匀浸润培养皿底部；最后放在含有5％CO₂的细胞培养箱中，37℃消化1-2min；

4、取出消化的细胞，往培养皿中加入0.5ml基础培养基，终止消化；然后用移液器反复吹吸，将细胞吹匀，并切转移到1.5ml离心管中，1000rpm/min离心4分钟；

5、吸掉上清，加入1ml基础培养基，轻轻反复吹吸，将细胞混匀；然后按1：4的传代比例，将细胞悬液平均分到4个铺有盖玻片的35mm培养皿中，双手反复晃动培养皿，使细胞混匀，然后放在细胞培养箱中培养；

6、待细胞汇合度达到50-70％后，加入终浓度为10-100nM的维生素D3或10-100nM的其类似物钙泊三醇，对细胞预处理24小时；

7、吸掉基础培养基，加入3ml诱导分化培养基①，放回细胞培养箱中连续诱导培养6天，每两天更换一次新鲜培养基；在更换培养基时，将轻轻地沿着培养皿壁添加培养基；

8、吸掉诱导分化培养基①，加入3ml诱导分化培养基②，诱导培养2天；随着诱导分化的进行，在10倍显微镜下会发现细胞内逐渐出现亮闪闪的圆形脂肪滴；

9、吸掉诱导分化培养基②，加入3ml基础培养基，继续培养8天，每两天更换一次新鲜培养基；在显微镜下会发现，含有脂肪滴的细胞越来越多，并且细胞内的脂肪滴越来越大；

10、诱导分化结束后，取出培养皿中的盖玻片进行油红染色，检测诱导分化效果；另外，提取培养皿剩余细胞的RNA，进行荧光定量PCR，检测成熟脂肪细胞的标志基因Adiponectin，Fabp4和Leptin的表达，进一步验证诱导分化的结果。

诱导分化结果的检测：

⑴油红染色

油红O是一种很强的脂溶剂和染脂剂，能够与甘油三酯结合，因此经常被用于脂肪染色。我们对诱导分化后的细胞进行油红染色，来检测成熟脂肪细胞内的脂肪滴。

具体操作如下：

1)将盖玻片用PBS洗3次，然后用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟；

2)用PBS洗3次后，用60％异丙醇平衡5分钟；

3)用浓度为3g/L的油红O(溶解在60％异丙醇中)密闭染色10分钟；

4)用60％异丙醇洗3次；

5)用苏木精染色2分钟；

6)用PBS洗3次，晾干后封片进行成像；

7)统计油红染色呈阳性的细胞数。

⑵成熟脂肪细胞标志基因检测

Adiponectin、Fabp4和Leptin是成熟脂肪细胞的标志基因，经常被用来衡量脂肪细胞诱导分化的效果。我们用Trizol从诱导分化后的细胞中提取总RNA，反转录后进行荧光定量PCR，检测Adiponectin、Fabp4和Leptin这三个基因的表达水平。

所用PCR引物序列如下：

Adiponectin:5’-GATGGCAGAGATGGCAC-3’

5’-GCTGAGCGGTATACATAGG-3’

Fabp4:5’-ACGAGAGGATGATAAACTGGTGG-3’

5’-GCGAACTTCAGTCCAGGTCAAC-3’

Leptin:5’-CACCAAAACCCTCATCAAGACA-3’

5’-CTTTCTGTTTGGAGGAGACTGACT-3’

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的培养基：

基础培养基为含20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基。

诱导分化培养基①为含1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮和0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。

诱导分化培养基②为含20μg/mL胰岛素的基础培养基。

高糖DMEM培养基购自Gibco公司。

实施例1高效地体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法

本实施例以10nM维生素D3(Calcitriol)预处理24小时为例，阐述诱导分化的结果。

诱导分化方法如下：

1、将分离的原代HDF细胞传代到铺有盖玻片的35mm的培养皿中，加入3ml基础培养基，放在含有5％CO₂的细胞培养箱中，37℃培养；

2、待细胞汇合度达到50-70％后，加入终浓度为10nM的维生素D3，对细胞预处理24小时；

3、吸掉基础培养基，加入诱导分化培养基①，连续诱导培养6天，每两天更换一次新鲜培养基；

4、吸掉诱导分化培养基①，加入诱导分化培养基②，诱导培养2天；

5、吸掉诱导分化培养基②，加入基础培养基，继续培养8天，每两天更换一次新鲜培养基。

诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。结果如下：

①油红染色结果

如图1所示，红色部分是染色的脂肪，未诱导的HDF细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的HDF细胞有明显的脂肪累积。并且相对于对照组(未经维生素D3预处理)，10nM维生素D3预处理24小时后再诱导能明显促进脂肪细胞分化。

②油红染色统计结果

如图2所示，未诱导的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0，诱导分化16天的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数分别为：对照组130个/cm²，10nM维生素D3预处理组271个/cm²。

③成熟脂肪细胞标志基因检测

如图3所示，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。10nM维生素D3预处理组三个标志基因的表达明显高于对照组。

实施例2高效地体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法

本实施例以50nM维生素D3(Calcitriol)预处理24小时为例，阐述诱导分化的结果。

诱导分化方法同实施例1，也采用“6+2+8”诱导分化模式。不同之处在于，预处理改为50nM维生素D3预处理24小时。

诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。结果如下：

①油红染色结果

如图4所示，红色部分是染色的脂肪，未诱导的HDF细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的HDF细胞有明显的脂肪累积。并且相对于对照组，50nM维生素D3预处理24小时后再诱导能明显促进脂肪细胞分化。

②油红染色统计结果

如图5所示，未诱导的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0，诱导分化16天的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数分别为：对照组(未经维生素D3预处理)118个/cm²，50nM维生素D3预处理组542个/cm²。

③成熟脂肪细胞标志基因检测

如图6所示，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。50nM维生素D3预处理组三个标志基因的表达明显高于对照组。

实施例3高效地体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法

本实施例以10nM钙泊三醇(Calcipotriol)预处理24小时为例，阐述诱导分化的结果。

诱导分化方法同实施例1，也采用“6+2+8”诱导分化模式。不同之处在于，预处理改为10nM钙泊三醇预处理24小时。

诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。结果如下：

①油红染色结果

如图7所示，红色部分是染色的脂肪，未诱导的HDF细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的HDF细胞有明显的脂肪累积。并且相对于对照组(未经钙泊三醇预处理)，10nM钙泊三醇预处理24小时后再诱导能明显促进脂肪细胞分化。

②油红染色统计结果

如图8所示，未诱导的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0，诱导分化16天的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数分别为：对照组115个/cm²，10nM钙泊三醇预处理组250个/cm²。

③成熟脂肪细胞标志基因检测

如图9所示，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。10nM钙泊三醇预处理组三个标志基因的表达明显高于对照组。

实施例4高效地体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法

本实施例以50nM钙泊三醇(Calcipotriol)预处理24小时为例，阐述诱导分化的结果。

诱导分化方法同实施例1，也采用“6+2+8”诱导分化模式。不同之处在于，预处理改为50nM钙泊三醇预处理24小时。

诱导分化结束后，通过油红染色和成熟脂肪细胞标志基因检测来检测诱导分化的结果。结果如下：

①油红染色结果

如图10所示，红色部分是染色的脂肪，未诱导的HDF细胞没有脂肪累积，而诱导分化16天的HDF细胞有明显的脂肪累积。并且相对于对照组(未经钙泊三醇预处理)，50nM钙泊三醇预处理24小时后再诱导能明显促进脂肪细胞分化。

②油红染色统计结果

如图11所示，未诱导的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0，诱导分化16天的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数分别为：对照组122个/cm²，50nM Calcipotriol预处理组523个/cm²。

③成熟脂肪细胞标志基因检测

如图12所示，通过定量PCR(quantitative PCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。50nM钙泊三醇预处理组三个标志基因的表达明显高于对照组。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。