阅读说明：本技术 一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总rna的提取方法 (Method for extracting high-quality total RNA of grass carp mesenteric adipose tissue ) 是由 姜鹏 李胜杰 樊佳佳 马冬梅 杜金星 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法,包括样品液氮速冻,TRIzol试剂裂解与机械匀浆,离心去除油脂层,氯仿分离含RNA水相,异丙醇沉淀和75％乙醇洗涤等步骤。在样品前处理阶段,本发明通过增加取样量至30mg,可提升产量以满足常规分子生物学实验对RNA量的需求；样品采用液氮速冻,无需人工研磨,并将冻样在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆,时长3min,可显著降低RNA降解发生,同时增加2次离心去除油脂层等操作步骤,获得的总RNA纯度和完整性较高。本发明的提取方法有效解决了草鱼脂肪组织RNA提取易降解,产量低等问题,且操作简单,批处理效果稳定,可满足转录组测序等高质量RNA要求的实验,也适用于其它鱼类脂肪组织总RNA的提取。(The invention discloses a method for extracting high-quality total RNA from grass carp intestinal system adipose tissue, which comprises the steps of quick freezing of a sample by liquid nitrogen, cracking by a TRIzol reagent, mechanical homogenization, centrifugal removal of an oil layer, separation of an RNA-containing water phase by chloroform, isopropanol precipitation, washing by 75% ethanol and the like. In the sample pretreatment stage, the yield can be improved to meet the requirement of a conventional molecular biology experiment on the RNA amount by increasing the sampling amount to 30 mg; the sample is quickly frozen by liquid nitrogen, manual grinding is not needed, the frozen sample is mechanically homogenized in a TRIzol reagent for a long time of 3min, the occurrence of RNA degradation can be obviously reduced, operation steps of centrifuging for 2 times to remove a grease layer and the like are added, and the purity and the integrity of the obtained total RNA are high. The extraction method effectively solves the problems of easy degradation, low yield and the like of the grass carp adipose tissue RNA extraction, has simple operation and stable batch processing effect, can meet the experiment of high-quality RNA requirements such as transcriptome sequencing and the like, and is also suitable for extracting the total RNA of other fish adipose tissues.)

一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及鱼类RNA提取领域，具体涉及一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法。

背景技术

动物脂肪组织不仅是机体能量贮存库，也是活跃的内分泌器官，其分泌的多种激素和细胞因子在机体代谢平衡、免疫应答等方面发挥重要作用(Scherer,2006；Wellen,Hotamisligil,2003)。在组织功能研究中，分子水平研究必不可少，其中RNA提取纯化是常涉及的分子生物学实验技术。然而，由于脂肪组织含有丰富油脂，RNA丰度低，导致高质量总RNA提取常常存在一定难度，影响到下游实验的高效开展。

目前，RNA提取广泛采用经典的酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿一步提取法(Chomczynski,Sacchi,1987)。该方法具有操作便捷，无需复杂设备辅助等优点，并配备有成熟的TRIzol等即用型商品化试剂(Wilfinger et al.,2010)。针对脂肪组织RNA含量低、难提取等问题，大多学者选择在一步法基础上进行优化改良。例如，吴江维等(2006)以猪脂肪组织为材料，发现增加样品量，延长静置裂解时间，去除油脂层污染等操作，可改善RNA提取的质量。采用类似优化步骤，在肉牛、绵羊等动物脂肪组织也获得了较高质量的总RNA样品(李娜等,2018；徐红伟等,2008)。

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是中国养殖产量最高的淡水经济鱼类，养殖过程中通常出现体脂过度沉积现象(姜鹏等,2019)。试验发现，常规方法操作下，草鱼脂肪组织RNA提取易发生降解，干扰到后续分子生物学实验的有序推进。草鱼脂肪组织主要蓄积在腹腔肠道周围，与哺乳动物的脂肪组织相比，质地构造存在明显差异。试验还发现，目前公开的优化改良方法或策略未能稳定获得高质量的草鱼脂肪组织RNA。因此，有必要研究开发一种草鱼脂肪组织高质量总RNA的提取方法，以解决目前存在的难题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，通过对常规酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿一步提取法进行优化改进，实现对草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的高效提取。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，所述提取方法包括：在前处理阶段，草鱼肠系膜脂肪组织样品采用液氮速冻，并在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆。

优选的，草鱼肠系膜脂肪组织在TRIzol试剂中机械匀浆时间为3min。

优选的，在前处理阶段将草鱼肠系膜脂肪组织放入液氮中速冻，冻样在TRIzol试剂裂解前无需进行人工或机械研磨粉碎。

本发明同时提供一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的具体提取方法，包括前处理阶段和后提取阶段，其中，前处理阶段包括以下步骤：

(1)将清洁好的匀浆器转头，用锡纸包裹，150℃高温处理2h，待降至室温后放入-20℃低温冰箱预冷备用,以避免随后的长时间匀浆操作引起转头过热而造成RNA分解；

(2)取1.5mL离心管，加入1.3mL TRIzol试剂，放入-20℃冰箱中预冷备用；

(3)将草鱼麻醉，剪断其颈椎放血后解剖，快速取肠系膜脂肪组织约30mg，迅速放入液氮中速冻；

(4)取出上述离心管、匀浆器转头放置在冰盒上，再把上述冻样加入到离心管中，立即机械研磨匀浆3min，之后进行离心操作；

(5)将匀浆后的脂肪组织于4℃离心5min，离心后小心吸弃200μL上层油脂；

(6)于4℃再离心3min，离心后再吸弃100μL上层油脂，并将下层大部分液体转移至另一新离心管，勿吸取底层杂质，之后进行RNA萃取操作。

作为一种优选的技术方案,后提取阶段包括以下步骤:

(7)往上述新离心管中加入300μL氯仿，盖紧离心管，上下剧烈震荡15s，之后室温放置5min；

(8)将离心管于4℃离心15min，离心后小心吸取上层水相移入另一新离心管中；

(9)往新离心管中加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育5min；

(10)将离心管于4℃离心15min，至管底可见白色RNA沉淀物，弃上清液，再次简短离心并小心吸弃管底残液；

(11)往离心管中加入1.3mL由DEPC水配制的75％乙醇，上下颠倒离心管，洗涤白色RNA沉淀物，之后4℃离心5min，弃上清液，再次简短离心并吸弃管底残余液体；

(12)挥发干燥约5min，得白色沉淀物质即为高质量的草鱼肠系膜脂肪组织总RNA。

作为一种优选的技术方案,步骤(5)、步骤(6)、步骤(8)、步骤(10)离心操作时离心的转速均为12000g；步骤(11)离心操作时离心的转速小于7500g。

作为一种优选的技术方案,步骤(6)中下层液体的吸取量为0.8～1.0mL。

作为一种优选的技术方案,步骤(7)中所述氯仿预先经过冰冷。

作为一种优选的技术方案，步骤(8)中将上层水相移入新离心管的次数为3次，前两次分别移入200μL，后一次移入不超过100μL。

作为一种优选的技术方案,后处理阶段还包括以下步骤：

(13)根据白色沉淀物质的量，加入30～50μL DEPC水溶解RNA，轻弹管底促进溶解，之后简短离心；

(14)跑胶检测提取效果，测量OD值，最后将总RNA样品于-80℃中保存备用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明所提供的提取方法通过增加取样量至约30mg,可提升产量以满足常规分子生物学实验对RNA量的需求；样品采用液氮速冻,无需人工研磨，并将冻样在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆，时长约3min,可显著降低RNA降解发生,同时增加2次离心去除油脂层等操作步骤,获得的总RNA纯度和完整性较高。本方法有效解决了草鱼脂肪组织RNA提取易降解、产量低等问题，且操作简单，批处理效果稳定，可满足转录组测序等高质量RNA要求的实验，也适用于其它鱼类脂肪组织总RNA的提取。

附图说明

图1是T1-T8组的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图2是T8组Agilent 2200生物分析仪生成的凝胶样图像及电泳色谱峰图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

1.材料与方法

1.1试验用鱼

试验所用草鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所生物技术养殖基地。从正常饲养的养殖群体中随机挑选健康个体，体质量范围约为80～150g。

1.2试验耗材与仪器

TRIzol试剂选用TaKaRa公司RNAiso Plus产品(Code No.9108)，DEPC水购自Beyotime公司，氯仿和异丙醇试剂为国产分析纯，PRO200型精密匀浆器购自PROScientific公司(美国)，高速冷冻离心机5417R购自Eppendorf公司(德国)，TGem微量分光光度计(OSE-260)购自天根生化科技(北京)有限公司。离心管和移液枪头等均使用RNase-free产品。

1.3常规的总RNA提取方法

草鱼活体使用MS-222轻微麻醉，剪断脊柱放血后解剖，快速剪取肝、脾、肠(不含肠系膜脂肪)、肠系膜脂肪组织，对应样品组编号为T1-T4。采用常规方法进行组织总RNA提取，每组测试3-5尾鱼，具体操作步骤如下：

取8～20mg新鲜组织样品放入预冷的1.0mL TRIzol试剂中，迅速均质匀浆约30s，然后室温静置5min；加入300μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min后，4℃离心15min(离心转速12000g)，小心吸取上层水相转移至另一新离心管中；加入500μL的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置5min后，4℃离心15min(离心转速12000g)；弃上清，得到白色RNA沉淀物，加入1.3mL DEPC水配制的75％乙醇，翻转洗脱，4℃离心5min(离心转速7500g)；弃上清，室温干燥沉淀物约5min，加入30～50μL的DEPC处理水溶解RNA。质检后，-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4优化的总RNA提取方法

根据预实验结果，将草鱼脂肪组织的样品量增加至约30mg，TRIzol试剂量增至1.3mL/样，并对常规总RNA提取步骤进行优化操作对比。

A.优化操作1：取新鲜样品至TRIzol试剂中机械匀浆30s后，4℃离心5min(离心转速12000g)，吸弃上层油脂约150μL，重复操作1次，将大部分余液移至新管，其余步骤与常规方法相同，对应样品组编号为T5。

B.优化操作2：取新鲜样品至液氮中急速冷冻，研钵内人工充分研磨，然后将粉末状样品加入TRIzol试剂中剧烈振荡30s裂解，吸弃油脂等步骤与优化操作1相同，对应样品组编号为T6。

C.优化操作3：与优化操作1基本相同，只增加样品机械匀浆的时间至约3min，对应样品组编号为T7。

D.优化操作4：取新鲜样品至液氮速冻，再转移冻样至TRIzol试剂中机械匀浆约3min，对应样品组编号为T8。

优化操作4具体操作过程如下。

准备工作：

(1)清洗数个剪刀、镊子、匀浆器转头等器材，150℃高温处理；放入-20℃冰箱冷冻备用；

(2)制冰少许；

(3)备好液氮；

(4)按2个样品计，备好2.6mL TRIzol试剂、氯仿800μL、异丙醇1.2mL、DEPC水、无水乙醇试剂；

(5)备好匀浆器，RNase free离心管，200μL、1000μL无RNase枪头；打开低温离心机预冷。

具体操作步骤(以2个样品为例)：

(1)取2个1.5mL离心管加入1.3mL TRIzol试剂，放入-20℃冰箱预冷备用；

(2)试验鱼麻醉、剪断颈椎放血后解剖，快速取肠系膜脂肪组织约30mg，放入液氮中速冻；

(3)将上述离心管放置在冰盒上，再把上述冻样加入其中，并立即机械研磨匀浆3min；

(4)4℃离心5min，离心转速12000g，离心后小心吸弃上油层约200μL；

(5)4℃离心3min，离心转速12000g，离心后小心吸弃上油层约100μL；将下层大部分红色液体小心吸取至新离心管中，量约0.8-1.0mL，弃去底层小部分；

(6)加入300μL氯仿(冰上预冷)，盖紧离心管，上下剧烈振荡15s，室温放置5min；

(7)4℃离心15min，离心转速12000g，离心后小心吸取上层水相移入另一新管，移入分3次，前2次移取200μL，后一次移取不超过100μL，移取时动作要细微，枪头不碰管壁及下层物质；

(8)加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育5min；

(9)4℃离心15min,离心转速12000g；期间配置2管75％乙醇(1mL乙醇+334μL DEPC水)备用；

(10)离心后见白色沉淀即RNA物质，弃上清，简短离心并吸弃管底残液，吸弃时不触碰沉淀；

(11)加入1.3mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤白色沉淀物质；

(12)4℃离心5min，离心转速小于7500g,弃上清，简短离心并吸弃残余液体；

(13)挥发干燥约5min，勿过分干燥，即得高质量总RNA；

(14)视沉淀物的量，加入30～50μL DEPC水溶解RNA，轻弹管底促进溶解，并简短离心；

(15)跑胶检测提取效果，测量OD值等,-80℃低温保存备用。

需要说明的是：以上所述的“简短离心”即表示短时间离心，可视具体情况，将离心的时间控制在10s～1min不等。

以上每组(T1-T8)各取3～5尾鱼测试。

1.5RNA质量检测

各取2.0μL RNA样品，利用微量分光光度计检测RNA样品浓度与纯度。配制1.5％非变性琼脂糖凝胶，取1.0-2.0μL适量RNA，140V电泳15min，紫外灯光下观察总RNA条带情况，评估提取质量。

从提取质量较好的T8组中，随机取3个样品送金唯智生物科技有限公司进行高通量测序平台质检，主要包括使用NanoDrop 2000分光光度计检测总RNA浓度和质量，以及Agilent 2200生物分析仪评估RNA完整性。

2.结果

2.1常规方法提取草鱼不同组织总RNA的质量比较

采用常规方法提取的草鱼不同组织总RNA，质量检测情况见表1。试验发现，与肝、脾、肠组织相比，草鱼肠系膜脂肪组织总RNA的提取量偏少，说明草鱼脂肪组织RNA含量较低，而在优化操作中适当增加组织量(25-35mg)，提取量有所提升，可满足常规生物分子试验用量的需求。常规提取方法下，草鱼肝、脾、肠和肠系膜脂肪组织总RNA的A260/A280比值基本保持在2.0左右，符合1.9-2.0的标准范围，说明常规方法提取的不同组织核酸纯度均较高。样品的A260/A230比值稍小于2.0，说明可能有微量胍盐或有机溶剂等杂质残留，实践经验其对下游分子试验影响轻微。

表1分光光度计检测的总RNA质量情况

注：T1-T4分别为常规方法提取的草鱼肝、脾、肠和肠系膜脂肪组织总RNA；T5-T8为采用不同优化方法提取的草鱼肠系膜脂肪组织总RNA，下同。

样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，图1展示了各组代表性样品的检测结果(图1中M代表DL2000 DNA分子量标准)。从图1中可见，T1-T3组肝、脾、肠组织样品的总RNA在凝胶上显示出清晰的28s和18s rRNA特征性条带，T4组脂肪组织样品则出现严重拖带现象，28s rRNA条带亮度也明显弱于18s rRNA，说明常规方法下提取的草鱼脂肪组织RNA有降解现象。以上不同组织间的对比试验表明，草鱼肠系膜脂肪组织RNA不仅含量少，而且易发生降解。

2.2不同优化操作提取草鱼脂肪组织总RNA的比较

分光光度计检测显示，4种优化方法提取的草鱼脂肪组织总RNA纯度均保持了较高水平。进一步从琼脂糖凝胶电泳结果(图1)中发现，T5组样品经简单去除油脂层操作并未有效改善RNA降解问题，而T6组样品前处理改用液氮速冻研磨方式，结果显示RNA降解有所缓解，但仍有一定程度拖带现象。当T7组样品仅增加了样品机械匀浆时间时，RNA降解问题得以显著改善，尤其是采用液氮速冻的同时增加样品机械匀浆时间，提取的T8组脂肪组织总RNA展示出较高质量的电泳条带特征。

试验表明，在TRIzol试剂裂解过程中，增加样品机械匀浆时间(约3min)可显著降低RNA降解程度，而且匀浆前样品采用液氮速冻处理可减轻取样操作可能带来的降解问题。

2.3草鱼脂肪组织优化提取总RNA的质检分析

为进一步明确优化操作4提取的总RNA样品质量，随机挑选T8组3个样品送测序公司进行质检分析。检测发现，3个样品RNA纯度较高，关键的RIN(RNA integrity number)值范围为8.7-9.0(详见表2)，依据公司评级标准，3个样品均为最佳的A级(A级标准：核酸质量≥2μg，A260/A280≥2.0，RIN值≥7，28S/18S≥1.0，核酸浓度≥100mg/L，体积≥10μL，5S峰形正常等)，表明RNA完整性好，质量满足高通量转录组建库测序要求。此外，从Agilent2200生物分析仪生成的凝胶样图像及电泳色谱峰图(图2)来看，3个总RNA样品的质量水平较高，其峰图基线较平整，无明显降解杂峰，28S与18S峰形正常。

表2 T8组改良方法提取草鱼肠系膜脂肪总RNA的质量情况

3.分析

RNA酶是一种专一水解RNA磷酸二酯键的蛋白酶，在环境中广泛存在，而且可耐受高温煮沸等严苛处理条件(Evans,Kamdar,1990)。因此，想要获得高质量RNA需要严格防范内源性和外源性RNA酶的破坏。为了避免外界环境中RNA酶的干扰，通常需要采用RNase-free耗材，清洁的实验环境以及科学规范的操作。除此之外，为了有效抑制样品组织细胞内包含的内源性RNA酶，需要依赖裂解试剂中异硫氰酸胍等强效蛋白变性剂。

显然，在本方案中，草鱼肠系膜脂肪组织RNA降解问题主要是源于常规提取方法未能有效阻止内源性RNA酶的水解作用。初步分析，RNA降解可能发生在取样起始阶段，也可能在组织裂解过程中，或是二者兼有。为此，在样品取样阶段尝试采用液氮速冻人工研磨的方法，期望利用超低温环境来抑制组织内RNA酶的活性，并尽可能缩短样品空气暴露时间。但多次实操发现，液氮速冻研磨操作对样品RNA降解虽有一定缓解，但凝胶电泳仍显示出不同程度拖带现象，甚至时常出现严重降解个例，说明RNA降解在组织裂解过程中也有发生。这意味着TRIzol试剂中的异硫氰酸胍等成分未能高效抑制肠系膜脂肪组织中的RNA酶。考虑到脂肪组织特异性因素，推测脂肪组织所包含的大量油脂很可能影响了蛋白变性剂发挥效能。

如何破除油脂影响，有学者利用液态油滴比重低的特点，采用简单离心去除油脂层方法(刘品等,2013)；也有学者通过调整试剂配方来强化脂肪乳化剂分离油脂的效果(Sharma et al.,2018)。以上方法在草鱼肠系膜脂肪中验证效果均不理想。基于上述实际情况，拟尝试在裂解过程中加入剧烈振荡等物理手段。经反复摸索测试后发现，当样品采用机械匀浆，并将匀浆时间从原有约30s延长至约3min时，RNA降解得以显著改善，而且批量验证效果也较为稳定。据此推测，长时间机械匀浆所形成的持续剪切冲击力或许有助于TRIzol试剂中的异硫氰酸胍等成分突破油滴阻碍而有效抑制内源性RNA酶。

需要特别说明的是，草鱼肠系膜脂肪组织中实际包裹有难以分离的胰腺组织。通常认为，动物的胰腺组织因富含RNA酶，RNA较难提取(Griffin et al.,2012；Kiba et al.,2007)，这可能是造成草鱼肠系膜脂肪组织RNA易发生降解的原因之一。

4.结论

本发明所提供的草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA提取的方法，在常规方法的基础上进行改良，将取样量增至约30mg，有助于提升RNA产量以满足常规生物分子试验的需求；样品前处理采用液氮速冻方式(非人工研磨)，并将样品在TRIzol试剂中长时间匀浆至约3min，从而显著降低RNA降解的发生，同时增加2次离心去除油脂层等操作步骤。通过本发明方法所获得的总RNA纯度和完整性较高，批处理效果稳定，可满足转录组建库测序等试验要求。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。