阅读说明：本技术 一种常温保护液及其配制方法与应用 (Normal-temperature protection solution and preparation method and application thereof ) 是由 安娜 宋飞 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种常温保护液,包括1.0～1.5g氯化钠、0.03～0.06g氯化钾、0.01～0.03g氯化钙、0.1～0.6ml吐温-20、2～8Mol盐酸胍、10～50mMol Tris-HCl及50～100ml无菌水。常温保护液的配制方法,包括(1)将1.0～1.5g氯化钠、0.03～0.06g氯化钾、0.01～0.03g氯化钙加入50～100ml无菌水中,混合均匀配制成溶解液；(2)再依次向溶解液中加入0.1～0.6ml吐温-20、2～8Mol盐酸胍及10～50mMol Tris-HCl,混合均匀后得到常温保护液。上述的常温保护液作为常温条件下储运DNA病原样品的保护液的应用。(The invention discloses a normal-temperature protection solution which comprises 1.0-1.5 g of sodium chloride, 0.03-0.06 g of potassium chloride, 0.01-0.03 g of calcium chloride, 0.1-0.6 ml of Tween-20, 2-8 Mol of guanidine hydrochloride, 10-50 mMol of Tris-HCl and 50-100 ml of sterile water. A preparation method of a normal-temperature protection solution comprises (1) adding 1.0-1.5 g of sodium chloride, 0.03-0.06 g of potassium chloride and 0.01-0.03 g of calcium chloride into 50-100 ml of sterile water, and uniformly mixing to prepare a solution; (2) and sequentially adding 0.1-0.6 ml of Tween-20, 2-8 Mol of guanidine hydrochloride and 10-50 mMol of Tris-HCl into the dissolved solution, and uniformly mixing to obtain the normal-temperature protection solution. The normal-temperature protective solution is applied as a protective solution for storing and transporting DNA pathogen samples at normal temperature.)

一种常温保护液及其配制方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种常温保护液及其配制方法与应用。

背景技术

猪口腔液指猪口腔中的唾液和血清渗出液组成的混合液体。唾液是由大小唾液腺分泌的混合液体，无色无味近于中性(pH 6.6～7.1)，其中水分约占99％，其余成分主要是黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶、富脯氨酸糖蛋白等；血清渗出液是通过口腔黏膜和口腔黏膜上的齿龈沟和毛细血管进入口腔的液体。口腔液具有广泛的生物学功能，口腔液样品可以用于抗体检测和PCR检测抗原，一定程度上可替代血清样品，为监测猪群传染病提供一种新的技术手段。

猪口腔液样品已经广泛应用于许多疫病的PCR方法检测病原或Elisa等方法测定抗体，以评估猪群的实时健康动态。科尔捷(Corthier)最早报道了采集感染猪瘟病毒的试验猪口腔液以检测猪抗体，随后许多学者相继报道了利用猪口腔液检测猪大肠杆菌病、传染性胸膜肺炎、猪传染性胃肠炎、猪繁殖和呼吸综合征、口蹄疫、猪伪狂犬病、A型流感、猪空肠弯曲菌病、链球菌病等猪传染病的抗体或抗原，以确认猪群感染状况。猪口腔液作为病原样品对猪群进行各种疾病的分析、检测为猪疾病的诊断和防控提供了必要的保障。

猪口腔液可以用于早期诊断，某些猪传染病的病毒血症在感染猪出现临床症状前已经存在于猪口腔液中，因此可采用猪口腔液作为口蹄疫、猪伪狂犬病等传染病处于潜伏期或亚临床阶段的病原进行检测，从而早期揭露感染情况。同理，某些细菌性传染病，如螺旋菌引起的胃溃疡，通常要尸检后方能观察到病变，也可采集猪口腔液进行PCR检测而提前确诊，进而对传染病实施有效的防控。

聚合酶链式反应(PCR)技术自1985年问世以来,因其灵敏度高、特异性强和检测速度快等特性,被广泛的应用于医学和分子生物学等诸多领域。PCR结果的准确性很大程度上取决于待检样本核酸的质量。然而,用于PCR检测的样本在采集、运输、保存等过程中,受人为和客观因素的影响,会导致核酸降解等而影响被检核酸的质量,造成PCR检测结果的假阴性,因此样品采集后的保存及运输条件显得尤为重要。

目前现有多数保存样品的方式主要为样品采集后直接低温保存，如：干冰、液氮、冰袋等必须保持在低温条件下进行保存及运输。

以上所述的低温保存这种方法有较大的限制性，一是采用低温保存成本较高；二是体现在对于需长时间或者远途运输的样品，保证样品可持续性低温条件的局限性，例如：采用液氮保存，液氮罐特殊设备的需求；干冰的挥发；冰袋的融化等。如果不能将新鲜采集的样品立刻置于低温条件下进行保存，核酸分子可能发生降解，也可能有其他影响因素使核酸状态发生改变；或是运输过程中保存不当，都会给后续的实验带来操作误差，影响最终的实验结果。

此外，虽然现在已有些常温下的样品保护液，如中国发明专利申请CN105145545A，《用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液》，此专利申请涉及一种核酸保护液及其应用，特别是涉及一种核酸保护液及其在常温下保存和运输组织样本中的应用。虽然此专利公开的保护液也是用于样品核酸的保护，但其主要针对组织样品，仅仅适用于人和除人以外的哺乳动物的神经细胞瘤组织的常温下保存和运输。此外，除以上专利中所述组织样本保护液外，其他一些核酸DNA类的样品保护液，使用后，样品容易分层，导致DNA回收率下降，影响检测结果的准确性；或所用的保护液在常温条件下对样品的保护效果不佳，并不能对样品的核酸DNA起到充分的保护作用。

发明内容

发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明的第一个目的在于公开一种常温保护液，其能够在常温状态下对DNA病原临床样品进行有效的保护。本发明的第二个目的在于公开一种常温保护液的配制方法。本发明的第三个目的在于公开一种常温保护液的应用。

本发明能够提供一种用于常温条件下储运DNA病原样品的保护液，对所采集的大量DNA病原样品进行快速简单地处理，可直接与本样品保护液进行等体积混匀后常温保存或运输，能有效防止所采集的样品发生污染和腐败，更好的延长DNA病原样品的保存时间，便于样品的保存和运输；且该DNA病原样品保护液制备方法简单、快速，适用多种DNA病原样品的处理，操作简单，方便保存。

技术方案：一种常温保护液，包括：

1.0～1.5g氯化钠、0.03～0.06g氯化钾、0.01～0.03g氯化钙、0.1～0.6ml吐温-20、2～8Mol盐酸胍、10～50mMol Tris-HCl及50～100ml无菌水。

进一步地，所述常温为4～37摄氏度。

一种常温保护液的配制方法，包括以下具体实施步骤：

(1)分别将1.0～1.5g氯化钠、0.03～0.06g氯化钾、0.01～0.03g氯化钙加入至50～100ml的无菌水中，充分溶解混合均匀后配制成溶解液；

(2)再依次向步骤(1)得到的溶解液中加入0.1～0.6ml吐温-20、2～8Mol盐酸胍及10～50mMol Tris-HCl，混合均匀后即得到常温保护液。

进一步地，所述常温为4～37摄氏度。

上述的常温保护液作为常温条件下储运DNA病原样品的保护液的应用。

进一步地，所述DNA病原样品为猪禽口腔液。本发明公开的常温保护液能够使其在常温下稳定，有效避免总DNA降解，从而保护DNA分子的完整性。

进一步地，上述的常温保护液作为常温条件下储运猪禽口腔液的保护液的应用时，直接将猪禽口腔液与常温保护液进行等体积混匀即可进行常温保存或运输。

有益效果：本发明公开的一种常温保护液及其配制方法与应用具有以下有益效果：

1、常温保护液能有效防止所采集的样品发生污染和腐败，更好的延长DNA病原样品的保存时间，便于样品的保存和运输；

2、常温保护液的配置方法简单、快速；

3、常温保护液适用于猪禽口腔液DNA病原样品的处理，操作简单，方便保存。

附图说明

图1为4℃条件下常温保护液与样品混液、PBS与样品混液分别保存0d、1d、3d、7d后检测图；

图2为27℃条件下常温保护液与样品混液、PBS与样品混液分别保存0d、1d、3d、7d后检测图；

图3为37℃条件下常温保护液与样品混液、PBS与样品混液分别保存0d、1d、3d、7d后检测图；

其中：Od表示配制完成后即进行取样作为初始对照。

具体实施方式

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下面对本发明的具体实施方式详细说明。

现通过详细说明根据本发明的DNA病原样品保存液的较佳具体实施例，以对本发明做进一步阐述。下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限于本发明的保护范围和应用范围。以下实施例中用到实验试剂如无特殊说明，均可通过商业手段获得。

具体实施例1

一种常温保护液，包括：

1.0g氯化钠、0.03g氯化钾、0.01g氯化钙、0.1ml吐温-20、2Mol盐酸胍、10mMolTris-HCl及50ml无菌水。

进一步地，所述常温为4摄氏度。

一种常温保护液的配制方法，包括以下具体实施步骤：

(1)分别将1.0g氯化钠、0.03g氯化钾、0.01g氯化钙加入至50ml的无菌水中，充分溶解混合均匀后配制成溶解液；

(2)再依次向步骤(1)得到的溶解液中加入0.1ml吐温-20、2Mol盐酸胍及10mMolTris-HCl，混合均匀后即得到常温保护液。

进一步地，所述常温为4摄氏度。

上述的常温保护液作为常温条件下储运DNA病原样品的保护液的应用。

进一步地，所述DNA病原样品为猪禽口腔液。本发明公开的常温保护液能够使其在常温下稳定，有效避免总DNA降解，从而保护DNA分子的完整性。

进一步地，上述的常温保护液作为常温条件下储运猪禽口腔液的保护液的应用时，直接将猪禽口腔液与常温保护液进行等体积混匀即可进行常温保存或运输。

具体实施例2

一种常温保护液，包括：

1.5g氯化钠、0.06g氯化钾、0.03g氯化钙、0.6ml吐温-20、8Mol盐酸胍、50mMolTris-HCl及100ml无菌水。

进一步地，所述常温为37摄氏度。

一种常温保护液的配制方法，包括以下具体实施步骤：

(1)分别将1.5g氯化钠、0.06g氯化钾、0.03g氯化钙加入至100ml的无菌水中，充分溶解混合均匀后配制成溶解液；

(2)再依次向步骤(1)得到的溶解液中加入0.6ml吐温-20、8Mol盐酸胍及50mMolTris-HCl，混合均匀后即得到常温保护液。

进一步地，所述常温为37摄氏度。

上述的常温保护液作为常温条件下储运DNA病原样品的保护液的应用。

进一步地，所述DNA病原样品为猪禽口腔液。本发明公开的常温保护液能够使其在常温下稳定，有效避免总DNA降解，从而保护DNA分子的完整性。

进一步地，上述的常温保护液作为常温条件下储运猪禽口腔液的保护液的应用时，直接将猪禽口腔液与常温保护液进行等体积混匀即可进行常温保存或运输。

具体实施例3

一种常温保护液，包括：

1.2g氯化钠、0.05g氯化钾、0.02g氯化钙、0.5ml吐温-20、6Mol盐酸胍、20mMolTris-HCl及90ml无菌水。

进一步地，所述常温为4～37摄氏度。

一种常温保护液的配制方法，包括以下具体实施步骤：

(1)分别将1.2g氯化钠、0.05g氯化钾、0.02g氯化钙加入至90ml的无菌水中，充分溶解混合均匀后配制成溶解液；

(2)再依次向步骤(1)得到的溶解液中加入0.5ml吐温-20、6Mol盐酸胍及20mMolTris-HCl，混合均匀后即得到常温保护液。

进一步地，所述常温为27摄氏度。

上述的常温保护液作为常温条件下储运DNA病原样品的保护液的应用。

进一步地，所述DNA病原样品为猪禽口腔液。本发明公开的常温保护液能够使其在常温下稳定，有效避免总DNA降解，从而保护DNA分子的完整性。

进一步地，上述的常温保护液作为常温条件下储运猪禽口腔液的保护液的应用时，直接将猪禽口腔液与常温保护液进行等体积混匀即可进行常温保存或运输。

将本发明的具体实施例3的常温保护液、PBS分别与同一猪禽口腔液样品等体积混合均匀，然后分别在在4℃、27℃、37℃不同温度条件下保存0d、1d、3d、7d不同时间后，进行平行取样统一提取样品核酸的检测结果。

结果分析：由图可见本发明公开的常温保护液与DNA病原样品的混液，在4℃、27℃、37℃不同温度条件下分别保存0d、1d、3d、7d不同的时间后，所对应的核酸样品均无明显降解；而PBS与DNA病原样品的混液所对应的核酸样品，在4℃、27℃、37℃不同温度条件下保存一定时间后均开始出现降解，尤其是置于常温27℃和37℃的PBS与病原样品混液所对应的核酸样品，保存短时间内后便开始降解，使用该常温保护液的DNA病原猪禽口腔液样品在37℃高温条件下短期内也具有良好的保护作用。因此，据本公开的常温保护液的实验结果，说明本公开的DNA病原样品的常温保护液，可在常温条件下对病原样品的核酸DNA进行有效的保护，使DNA病原样品便于保存和储运。

上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。