阅读说明：本技术 中草药微生物培养方法及dna提取方法 (Chinese herbal medicine microorganism culture method and DNA extraction method ) 是由 黄容琴 卢晨阳 张雅萍 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种中草药微生物培养方法及DNA提取方法,该方法结合结构生物学对DNA高级结构的预测分析,运用计算机模型对各个细菌DNA的功能区序列进行设计和优化密码子,从而得到能够高效表达出目标细菌功能的基因序列,再将上述目标序列连接到合适的表达载体上,然后利用氯化铯密度梯度超速离心纯化,从样本中提取微生物DNA,从而以基因组的多样性反映物种的多样性。(The invention relates to a Chinese herbal medicine microorganism culture method and a DNA extraction method, the method combines the prediction analysis of structural biology on the higher structure of DNA, a computer model is used for designing and optimizing codons for functional region sequences of various bacterial DNAs so as to obtain a gene sequence capable of efficiently expressing the functions of target bacteria, then the target sequence is connected to a proper expression vector, and then cesium chloride density gradient ultracentrifugation purification is utilized to extract microorganism DNA from a sample, so that the diversity of species is reflected by the diversity of genome.)

中草药微生物培养方法及DNA提取方法

技术领域

本发明涉及一种中草药微生物培养方法及DNA提取方法，属于微生物工程领域。

背景技术

垃圾堆填埋场除臭方法，大多数使用自动喷淋系统和喷洒车祛除垃圾散发恶臭物质。通过覆盖喷洒植物液和生物菌两种除臭剂。目前大多数还是使用植物液。垃圾填埋场夏天时，容易产生渗滤液外漏，渗滤液对环境又有害，所以一般都会进行回收处理，但是渗滤液会散发很臭的气体。一般的除臭剂解决不了这些问题。

微生物除臭能快速解决渗滤液外漏的情况，由于产品复合了很多菌种，所以针对渗滤液这个高复合恶臭物质气体，具有显著的祛除效果。然而，传统的微生物提取技术中，微生物群落多样性及结构分析是将微生物进行分离培养,然后通过一般的生物化学性状及特定的表现型来分析。传统提取技术存在以下局限性：

·局限于从固体培养基上分离微生物；

·纯培养方法和原理大多从医药微生物引过来的，有些方法对特定微生物研究并不很适合,譬如某些微生物处于贫营养，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定某一环境中活细菌的总数，大量的贫营养微生物不适宜生长，测定结果误差大；

·大多数微生物在现阶段是无法培养的；

故简单提取和平板培养计数不能得到微生物在特定生态系统中的生活特征和生态功能的信息，从而埋没了大量有很大应用价值的微生物资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中草药微生物培养方法及DNA提取方法，能从中草药微生物中提取DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性，得到的产品含高达122种微生物，多种微生物的共同作用，更有利于吸收、分解有害气体。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种中草药微生物DNA提取方法，其包括以下步骤：

S1、运用计算机模型对中草药中的微生物DNA功能区域进行分析，得到能够高效表达出目标微生物功能的目标基因序列；

S2、用玻璃珠震荡法提取所述中草药中的微生物，再通过液氮冻融、梅法和sds法相结合的方式使微生物原位细胞裂解；

S3、将步骤S2中得到的粗提DNA经过氯化铯密度梯度超速离心纯化，得到上清液，再加入醋酸钾进行沉淀，将得到的沉淀物加入至TE溶液中，以得到中草药微生物DNA溶液；

S4、稀释所述中药草微生物DNA溶液，对目标微生物的DNA进行部分酶切得到所述目标基因序列和扩增。

进一步地，步骤S2具体包括：

称取中草药于含有玻璃珠的溶液的离心管中，震荡后离心得到所述中草药中的微生物；随后在液氮中反复冻融，并加入细胞裂解液、DNA提取液、溶菌酶和SDS溶液，使所述微生物发生细胞裂解释放DNA，最后再进行离心得到所述粗提DNA。

进一步地，步骤S3具体包括：

将所述粗提DNA溶于TE中，加入氯化铯待所述粗提DNA完全溶解后进行密度梯度超速离心，随后加入异丙醇进行纯化，再加入醋酸钾进行离心沉淀并将沉淀物溶于TE中，得到所述中草药微生物DNA溶液。

进一步地，步骤S4中，所述部分酶切的具体步骤包括：

稀释所述中草药微生物DNA溶液，加入酶切缓冲液得到中草药微生物DNA稀释液，再根据计算机模型的分析结果向其中加入限制性内切酶，混匀培养后灭活所述限制性内切酶。

进一步地，步骤S4中，所述扩增的具体步骤包括：

根据计算机模型的分析结果向所述中草药微生物DNA溶液加入引物进行PCR扩增。

本发明还提供一种中草药微生物培养方法，其包括以下步骤：

进行所述的中草药微生物DNA提取方法，将所述目标序列连接至载体后转入至所述中草药微生物中，再将所述中草药微生物至于细菌菌群溶液中培养。

进一步地，所述细菌菌群溶液通过以下方法制备得到：

取艾草、蒲公英、鱼腥草的细胞液混合，向其中加入樟木粉、竹炭粉和蒸馏水进行摇匀混合，随后进行离心除去杂质，得到的细菌菌群溶液在-80～-50℃下保存。

进一步地，将所述扩增后的DNA产物通过DGGE进行分离，对得到的DGGE胶片进行染色后扫描得到电子图谱，并通过软件分析生产条带的信号强度分布图。

进一步地，对转入载体后的中草药微生物进行菌落PCR扩增，将扩增后的菌落产物与所述DNA产物同时进行DGGE分离和染色，通过对比所述电子图谱上的条带得知条带对应的微生物的特性

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的中草药微生物培养方法及DNA提取方法能从中草药微生物中提取DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性，得到的产品含高达122种微生物，多种微生物的共同作用，更有利于吸收、分解有害气体。同时，这些微生物又可以产生无机酸，同时形成不利于腐败微生物生活的酸性环境，并从根本上降解分解产生恶臭气体的物质。产品根据臭气的不同成份，通过该中草药微生物培养方法及DNA提取方法去筛选、驯化、培养特有的微生物，使产品更有针对性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并详细说明如后。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一中草药微生物DNA提取

运用计算机模型对中草药中的微生物DNA功能区域进行分析，得到能够高效表达出目标微生物功能的目标基因序列。

称取8g中草药样品于含有玻璃珠的溶液的离心管中，在室温条件下，以300rpm的转速震荡2-3h；随后过滤，滤液在12000-15000rpm的转速下离心2-5min，去除上清液，用去离子水洗涤沉淀后，再在12000-15000rpm的转速下离心2-5min，得到中草药样品的微生物菌体。

将微生物菌体在液氮中反复冻融4-6次，随后水浴加入细胞裂解液、DNA提取液、溶菌酶、SDS溶液、蛋白酶和氯仿/异戊醇混合液，使微生物发生细胞裂解并释放DNA，随后将溶液至于离心管中进行离心，取上清液再离心，得到粗提DNA沉淀。

将粗提DNA溶于TE中，加入氯化铯待所述粗提DNA完全溶解后进行密度梯度超速离心，随后加入异丙醇进行纯化，再加入醋酸钾进行离心沉淀并将沉淀物溶于TE中，得到中草药微生物DNA溶液。

实施例二中草药微生物DNA部分酶切得到目标基因序列

采用实施例一的方法得到中草药微生物DNA溶液，用双蒸水或TE稀释中草药微生物DNA溶液，向其中加入酶切缓冲液进行混匀，得到中草药微生物DNA稀释液，再根据计算机模型的分析结果向其中加入对应的限制性内切酶，混匀培养一端时间后进行灭活。

实施例三中草药微生物DNA扩增

采用实施例一的方法得到中草药微生物DNA溶液，根据计算机模型的分析结果向所述中草药微生物DNA溶液加入引物进行PCR扩增。

实施例四特异性中草药微生物培养

采用实施例一的方法得到中草药微生物DNA溶液，将部分酶切得到的目标序列连接至适应载体后转入至中草药微生物中，再将中草药微生物至于细菌菌群溶液中培养。其中，细菌菌群溶液主要来自于新鲜中草药的细胞液，主要提取艾草、蒲公英、鱼腥草等植物中草药细胞液；再取樟木粉，竹炭粉，蒸馏水等与细胞液混合，将液体培养液利用离心机作离心处理，将多余的杂质去除，保留单纯的液体培养液，再将单纯的液体培养液利用冰柜作冷冻处理，冷冻温度保持在-80～-50摄氏度的范围之内，冷冻72小时。使用时提前取出经处理后与微生物进行配比。

实施例五中草药微生物基因组的多样性反映物种的多样性

采用实施例四的方法得到中草药微生物，将扩增后的DNA产物通过DGGE进行分离，对得到的DGGE胶片进行染色后扫描得到电子图谱，并通过软件分析生产条带的信号强度分布图。对转入载体后的中草药微生物进行菌落PCR扩增，将扩增后的菌落产物与DNA产物同时进行DGGE分离和染色，通过对比电子图谱上的条带得知条带对应的微生物的特性。

综上所述：本发明的中草药微生物培养方法及DNA提取方法能从中草药微生物中提取DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性，得到的产品含高达122种微生物，多种微生物的共同作用，更有利于吸收、分解有害气体。同时，这些微生物又可以产生无机酸，同时形成不利于腐败微生物生活的酸性环境，并从根本上降解分解产生恶臭气体的物质。产品根据臭气的不同成份，通过该中草药微生物培养方法及DNA提取方法去筛选、驯化、培养特有的微生物，使产品更有针对性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。