一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建及其引物和应用
阅读说明：本技术 一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建及其引物和应用 (Construction of pET44a-scFv1956# expression vector, primer and application thereof ) 是由 王长琛 潘博 李正勇 邢梦婷 蒋海越 魏斌 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗体领域,具体涉及一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建及其引物和应用。所述引物的序列为：引物1(44a up)：5’-TC CCC CGG GGC AGC CAG GTC CAA TTT GTA G-3’；引物2(44a down)：5’-CCG CTC GAG TTA ATT CAG ATC CTC TTC T-3’。本发明的pET44a-scFv1956#表达载体的构建方法能够顺利的构建表达载体。本发明pET44a-scFv1956#由抗体重链可变区(VH)-连接链(G4S1)3-轻链可变区(VL)构成,是没有Fc段的单价抗体,其大小是抗体全长的六分之一,能够解决现有的处理方式容易引起补体系统激活引起的神经肌肉接头免疫损伤的技术问题。由于pET44a-scFv1956#表达载体能够有利于抑制乙酰胆碱受体的抗体,所以可以用来制备抗皱纹药物,对皱纹有着良好的治疗效果。(The invention relates to the field of antibodies, in particular to construction of a pET44a-scFv1956# expression vector, and a primer and application thereof. The sequence of the primer is as follows: primer 1(44a up): 5'-TC CCC CGG GGC AGC CAG GTC CAA TTT GTA G-3', respectively; primer 2(44a down): 5'-CCG CTC GAG TTA ATT CAG ATC CTC TTC T-3' are provided. The method for constructing the pET44a-scFv1956# expression vector of the invention can successfully construct the expression vector. The pET44a-scFv1956# is composed of an antibody heavy chain variable region (VH) -connecting chain (G4S1) 3-light chain variable region (VL), is a monovalent antibody without Fc segment, has the size of one sixth of the whole length of the antibody, and can solve the technical problem that the existing treatment mode easily causes the neuromuscular junction immune injury caused by the activation of a complement system. Since the pET44a-scFv1956# expression vector can be beneficial to inhibiting the antibody of acetylcholine receptor, the vector can be used for preparing anti-wrinkle drugs and has good treatment effect on wrinkles.)
技术领域
本发明属于抗体领域，具体涉及一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建及其引物和应用。
背景技术
皱纹分为体位性皱纹、动力性皱纹和重力性皱纹，其中，动力性皱纹是表情肌长期收缩的结果，主要表现在额肌的抬眉纹、皱眉肌的眉间纹、眼轮匝肌的鱼尾纹、口轮匝肌的口角纹和唇部竖纹、颧大肌和上唇方肌的颊部斜纹等。有效的阻断表情肌肉的过度收缩，使之松弛，可以改善皱纹。神经肌肉间的信号传递依赖于钙离子(Ca2+)的内流，当神经冲动传导到运动神经末梢时，突触前膜的特异区域去极化，Ca2+通过电压门控的Ca2+通道内流，改变突触前膜电位，吸引含有Ach(乙酰胆碱)的小囊泡到突触前膜，并以量子化方式释放到突触间隙。ACh与突触后膜的配体门控Na+通道乙酰胆碱受体AChR(乙酰胆碱受体)结合后一过性地增加对钠离子(Na+)的通透性，产生MEPP电位；当运动神经受刺激时，神经冲动传到神经末梢释放大量ACh分子，更多的Na+流入，当大量Na+内流引起的去极化幅度达到电压门控的Na+通道的阈值时，形成正反馈环路，突触后膜去极化产生AP，引起肌肉收缩。这一过程非常短暂，且ACh迅速地被乙酰胆碱酯酶降解灭活。正常情况下，神经冲动释放ACh越多，被激活的AChR越多。
骨骼肌NMJ处的AChR(成人型)是由2α、β、δ、ε-亚单位组成的5聚体。α-亚单位在NMJ传递过程中起关键作用。NMJ处突触前膜释放的乙酰胆碱(ACh，acetylcholine)与ACh Rα1-亚单位上的一处目前还没有非常精准定位的结合位点(大致位于氮端第185、199位氨基酸)，开放位于其中央的离子通道，Na+内流形成MEPP。肌无力患者体内的绝大多数ACh RAbs可与NMJ处的ACh Rα1-亚单位肽段64～76一个区域即所谓的主要免疫区(MIR，mainimmunogenic region)结合，引起NMJ处的传递障碍。设计特异性结合AChR的抗体，能阻断神经肌肉的信号传递，在局部可引起肌肉收缩障碍，改善皱纹情况。
但是现有技术中，往往研究患者体内的病理致性致病因子-乙酰胆碱受体的抗体，如T细胞、免疫细胞、炎性细胞因子和B细胞等，而由于肌肉收缩障碍的病因，重症肌无力患者和重症肌无力动物模型体内的病理性致病因子-乙酰胆碱受体抗体和神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，激活大量的补体并沉积于神经肌肉接头处溶解、破坏突触后膜和乙酰胆碱受体，导致神经肌肉接头处传递障碍。由此可见，现有的处理方式容易引起补体系统激活引起的神经肌肉接头免疫损伤。
发明内容
本发明为了解决上述背景技术中现有的处理方式容易引起补体系统激活引起的神经肌肉接头免疫损伤的技术问题，提供一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建及其引物和应用。
本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建的引物，其特征在于，所述引物的序列为：
引物1(44a up)：5’-TC CCC CGG GGC AGC CAG GTC CAA TTT GTA G-3’，
引物2(44a down)：5’-CCG CTC GAG TTA ATT CAG ATC CTC TTC T-3’，其中：
所述CCC CGG序列为Sma I的酶切位点；
所述CTC GAG序列为Xho I的酶切位点。
本发明的有益效果是：本发明的pET44a-scFv1956#与传统抗体相比,(1)结构上是由抗体重链可变区(VH)-连接链(G4S1)3-轻链可变区(VL)构成，是没有Fc段的单价抗体，其大小是抗体全长的六分之一；(2)乙酰胆碱受体单链抗体只有1个抗原结合位价，只能与乙酰胆碱受体上两个α-亚单位中的一个主要免疫原区结合，不会引起乙酰胆碱受体分子之间的交联导致的抗原调变；(3)此外，乙酰胆碱受体单链抗体没有Fc段，所以不能激活补体，从而避免了补体系统激活而引起的免疫损伤；(4)乙酰胆碱受体单链抗体能够特异性的与乙酰胆碱受体结合，封闭、阻断重症肌无力患者体内致病因子-乙酰胆碱受体抗体与乙酰胆碱受体结合，一方面保护乙酰胆碱受体免受重症肌无力患者体内致病性乙酰胆碱受体抗体的攻击，另一方面，这一特性使得单链抗体成为理想的靶向工具。所以本发明的pET44a-scFv1956#表达载体使得到纯化的可溶性抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#成为可能。能够解决现有的处理方式容易引起补体系统激活引起的神经肌肉接头免疫损伤的技术问题。pET44a-scFv1956#表达载体的构建的引物是pET44a-scFv1956#表达载体的构建的必要条件。
本发明另一方面提供了一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建方法，包括以下步骤：
一、AChR scFv1956#结构基因的扩增
1.1、以含抗人AChR scFv1956#的质粒pHEN1为模板，上述所述的引物1和引物2在5’端加上酶切位点Sma I，并且在3’端引入酶切位点Xho I：Pyrobest高保真DNA聚合酶PCR扩增所需克隆片段，得到产物；
1.2、取5μL步骤1.1中得到的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，得到所需PCR产物；
二、PCR回收产物并酶切该片段和载体
2.1、向步骤1.2中的PCR产物中加醋酸钠得到混合物，所述PCR产物与所述醋酸钠的体积比为10:1；
2.2、向步骤2.1中的混合物中加入2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后置于冰上15-20mi n，离心后取上清液；
2.3、向步骤2.2中的上清液内加入70wt％的乙醇，离心后弃掉上清液，接着用滤纸条吸干管壁的乙醇，接着常温下晾干，得到固体物；
2.4、将所述固体物用纯水重悬，得到PCR回收产物，接着先后用Sma I(酶切温度30℃)、Xho I酶切PCR回收产物和pET44a(+)载体，8g/L琼脂糖凝胶电泳后回收得到酶切后的PCR片段和pET44a(+)载体；
三、将PCR片段和pET44a(+)载体连接
3.1、用T4 DNA连接酶在16℃下加入PCR片段和pET44a(+)，将PCR片段和pET44a(+)载体连接，得到连接产物
3.2、取10μL连接产物转化100μL的感受态JM109，静置24h后挑取阳性克隆，涂布100mg/L氨苄青霉素2×YT琼脂平板培养24h后，提取质粒DNA；
3.3、将步骤3.2得到的质粒DNA进行DNA测序分析，筛选测序正确者命名为pET44a-scFv1956#，其中含有编码特异性结合乙酰胆碱受体的单链抗体与补体调节因子(DAF)融合蛋白的基因。
四、表达载体的构建
4.1、将步骤3.3中测序正确的pET44a-scFv1956#经过SmaI酶和Xho I酶消化后，胶回收1600bp的DNA片段，接着转化感受态DH5ɑ细胞，接着加入无抗的2×YT培养液8h,得到溶液；
4.2、将步骤4.1得到的溶液均匀涂布于AMP+的2×YT平板，37℃培养箱到对数生长期OD600＝0.6时加入I PTG，持续诱导4h后离心，弃掉上清液，完成pET44a-scFv1956#表达载体的构建。
本发明的有益效果是，上述pET44a-scFv1956#表达载体的构建方法能够顺利的得到pET44a-scFv1956#表达载体，从而为后续的得到纯化的可溶性抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#清除了障碍。能够解决现有的处理方式容易引起补体系统激活引起的神经肌肉接头免疫损伤的技术问题。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，在步骤2.2中，离心的频率为2000～3000r/min，离心时间为3～5min。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的参数有利于离心的彻底。
进一步，在步骤2.3中，离心的频率为1500～2000r/min，离心时间为10～15min。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的参数有利于离心的彻底，得到更加纯的分离物。
进一步，在步骤4.2中，离心的频率为1000～2000r/min，离心时间为5～10min。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的参数有利于离心的彻底，得到更加纯的分离物。
本发明另一方面还提供一种pET44a-scFv1956#表达载体在制备抗皱纹药物中的应用。
本发明的有益效果是，由于pET44a-scFv1956#表达载体能够有利于抑制乙酰胆碱受体的抗体，所以可以用来制备抗皱纹药物。并且能够取得良好的治疗皱纹的效果，填补了市面上缺少抗皱纹药物的空白，极大的促进了人们生活水平的提高，满足了人人爱美的需求。
本发明另一方面还提供一种pET44a-scFv1956#表达载体在制备乙酰胆碱受体的抗体的制剂中的应用。
本发明的有益效果是，pET44a-scFv1956#表达载体可以制作乙酰胆碱受体的抗体，防止肌无力等症状，从而防止皱纹。
附图说明
图1为本发明PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果图，序号1为PCR产物，序号2为DNAmarker。
图2为本发明用SmaI(酶切温度30℃)、Xho I酶切PCR回收产物和pET44a(+)载体的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1、
如图1和图2所示，一种pET44a-scFv1956#表达载体的构建方法，包括以下步骤：
一、AChR scFv1956#结构基因的扩增
1.1、以含抗人AChR scFv1956#的质粒pHEN1为模板，用引物1(44a up)：5’-TC CCCCGG GGC AGC CAG GTC CAA TTT GTA G-3’和引物2(44a down)：5’-CCG CTC GAG TTA ATTCAG ATC CTC TTC T-3’在5’端加上酶切位点Sma I，并且在3’端引入酶切位点Xho I：Pyrobest高保真DNA聚合酶PCR扩增所需克隆片段，得到产物；
1.2、取5μL步骤1.1中得到的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，得到所需PCR产物；如图1所示，扩增出来的DNA片段大小为780bp，与预期长度一致，证明了实验的正确性。
二、PCR回收产物并酶切该片段和载体
2.1、向步骤1.2中的PCR产物中加醋酸钠得到混合物，所述PCR产物与所述醋酸钠的体积比为10:1；
2.2、向步骤2.1中的混合物中加入2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后置于冰上15min，离心后取上清液；
2.3、向步骤2.2中的上清液内加入70wt％的乙醇，离心后弃掉上清液，接着用滤纸条吸干管壁的乙醇，接着常温下晾干，得到固体物；
2.4、将所述固体物用纯水重悬，得到PCR回收产物，接着先后用SmaI(酶切温度30℃)、Xho I酶切PCR回收产物和pET44a(+)载体，8g/L琼脂糖凝胶电泳后回收得到酶切后的PCR片段和pET44a(+)载体，如图2所示得到了pET44a-scFv1956#表达载体的酶切鉴定，所得片段为751bp，与scFv1956#大小相符，证实了有751bp的片段克隆进入pET44a表达载体。
三、将PCR片段和pET44a(+)载体连接
3.1、用T4 DNA连接酶在16℃下加入PCR片段和pET44a(+)，将PCR片段和pET44a(+)载体连接，得到连接产物
3.2、取10μL连接产物转化100μL的感受态JM109，静置24h后挑取阳性克隆，涂布100mg/L氨苄青霉素2×YT琼脂平板培养24h后，提取质粒DNA；
3.3、将步骤3.2得到的质粒DNA进行DNA测序分析，筛选测序正确者命名为pET44a-scFv1956#，其中含有编码特异性结合乙酰胆碱受体的单链抗体与补体调节因子(DAF)融合蛋白的基因。
四、表达载体的构建
4.1、将步骤3.3中测序正确的pET44a-scFv1956#经过SmaI酶和Xho I酶消化后，胶回收1600bp的DNA片段，接着转化感受态DH5ɑ细胞，接着加入无抗的2×YT培养液8h,得到溶液；
4.2、将步骤4.1得到的溶液均匀涂布于AMP+的2×YT平板，37℃培养箱到对数生长期OD600＝0.6时加入IPTG，持续诱导4h后离心，弃掉上清液，完成pET44a-scFv1956#表达载体的构建。
可选的，在步骤2.2中，离心的频率为2000r/min，离心时间为3min。
可选的，在步骤2.3中，离心的频率为2000r/min，离心时间为10min。
可选的，在步骤4.2中，离心的频率为2000r/min，离心时间为10min。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。