阅读说明：本技术 骆驼刺糖聚合物及其制备方法和应用 (Camel thorn sugar polymer and preparation method and application thereof ) 是由 严春艳 叶振泉 李天钰 于 2020-03-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了骆驼刺糖聚合物AP3-2、AP3-3及其提取方法和用途,该方法以骆驼刺地上部分为原料,通过水提醇沉、Sevag法脱蛋白、DEAE纤维素柱层析、凝胶柱层析等制备骆驼刺糖聚合物。其中,AP3-2是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖组成的糖聚物；AP3-3是由阿拉伯糖组成的糖聚物。同时,AP3-2在抗骨质疏松实验中显示其具有显著的促成骨活性。这些研究可为其将来在制备防治骨质疏松药物或保健品或功能食品中的应用提供依据。(The invention discloses camel thorn sugar polymers AP3-2 and AP3-3 as well as an extraction method and application thereof. Wherein AP3-2 is a glycomer consisting of mannose, rhamnose, glucuronic acid, galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, and xylose; AP3-3 is a glycomer consisting of arabinose. Meanwhile, AP3-2 has been shown to have significant contribution to bone activity in anti-osteoporosis experiments. The researches can provide a basis for the future application of the traditional Chinese medicine composition in preparing medicines or health products or functional foods for preventing and treating osteoporosis.)

骆驼刺糖聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及一种骆驼刺糖聚合物、精糖聚合物的制备方法，以及骆驼刺糖聚合物在防治骨质疏松中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis,0P)是多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。由于人口老龄化现象日趋严重，骨质疏松症发病率快速增长。妇女绝经后雌激素水平急剧下降，导致骨转换率升高，易诱发骨质疏松，骨质疏松症已成为当今社会面临的严重的公共健康问题。治疗这种常见的代谢性骨病的关键是保持骨吸收与骨形成之间的平衡。目前，激素替代疗法，双膦酸盐，选择性激素受体调节剂和降钙素用于降低临床中原发性和复发性骨折的风险，但这些药物在长期使用过程中多具有一定的副作用，因此高效、低毒的新型抗骨质疏松药物的研发势在必行。天然药物在治疗骨质疏松症方面具有历史悠久、副作用小等优势，受到人们的广泛关注。

骆驼刺(Alhagi pseudalhagi Desv.)，属于豆科骆驼刺属植物，分布于中国内蒙古、甘肃、青海和新疆。哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦、土库曼斯坦、吉尔吉斯斯坦和塔吉克斯坦也有分布。骆驼刺营养价值较高，它是反刍动物最常见的饲料。此外，骆驼刺还具有很高的药用价值。骆驼刺中具有多种生物活性物质，如黄酮类，生物碱，多糖，维生素，脂肪酸，类固醇，香豆素，丹宁等。它们在抗哮喘，壮阳，退热，开胃，抗风湿，利尿，镇静，祛痰，抗腹泻，抗炎，抗病毒，抗菌，降压，保肝，免疫调节以及皮肤病的治疗方面具有良好表现。

目前，国内外对骆驼刺的研究主要集中在骆驼刺小分子物质的提取、分离鉴定和粗提物的药理活性上。骆驼刺粗糖聚合物虽有报道，但是没有明确其结构特征和理化性质，还没有相关骆驼刺糖聚合物结构的报道。此外，国内外对骆驼刺糖聚合物在防治骨质疏松方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于提供一种骆驼刺糖聚合物。

本发明第二个方面的目的，在于提供上述骆驼刺糖聚合物的制备方法。

本发明第三个方面的目的，在于提供上述骆驼刺糖聚合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种骆驼刺糖聚合物，包括AP3-2和AP3-3，其中，AP3-2是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成的糖聚物，其结构式如式(I)所示：

其中，a、b的范围为1～1000；

AP3-2是由阿拉伯糖组成的糖聚物，其结构式如式(Ⅱ)所示：

其中，a的范围为1～1000。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的骆驼刺糖聚合物在制备预防和/或骨质疏松药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供本发明第一或第二个方面所述的骆驼刺糖聚合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.浸泡：取骆驼刺的地上部分，浸泡，得浸泡液A；

S2.水提：将浸泡液A进行加热提取，过滤，得提取液B和残渣C；

S3.分级醇沉：将提取液B减压浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a％，静置，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物AP1和上清液D；将上清液D再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b％，静置，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物AP2和上清液E；将上清液E再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为c％，静置，收集沉淀，得粗糖聚合物AP3，其中10≤a＜b＜c＜100；

S4.纯化：对上述粗糖聚合物AP1、AP2、AP3、AP4进行纯化，即得纯化粗糖聚合物AP1、AP2、AP3、AP4；

S5.离子交换柱层析：将步骤S4中得到的纯化粗糖聚合物AP3进行离子交换柱层析，用0～2M浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分，然后浓缩、透析、冷冻干燥，再分别用水进行溶解，离心分离后得到上清液H；

S6.分子筛凝胶柱层析：将步骤S5中上清液H进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩、冷冻干燥后获得权利要求1中所述骆驼刺糖聚合物AP3-2、AP3-3。

根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S1中所述骆驼刺的地上部分为骆驼刺的茎、枝、叶、花序。

根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S2中水提的具体操作为：用5～15倍体积的60～100℃的热水对骆驼刺地上部分提取1～10h。

根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中10≤a＜60，60≤b＜80，80≤c＜100。

根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S4中纯化的具体操作为：利用Sevag法分别对粗糖聚合物AP1、AP2、AP3进行除蛋白，除蛋白后再经透析袋透析、冻干，透析袋的截留分子量为1000Da。

根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S5中离子交换柱为离子交换纤维素或离子交换凝胶，透析袋的截留分子量为100Da。

根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S6中分子筛凝胶层析选用Sephadex G或Sephacryl S系列分子筛色谱柱。

本发明的有益效果：

1.本发明利用离子交换层析和分子筛凝胶柱层析方法纯化骆驼刺糖聚合物，制备出之前未报道过的骆驼刺精糖聚合物，并且对骆驼刺精糖聚合物的理化性质、分子量、单糖组成等进行系统的分析确认，成功得出骆驼刺精糖聚合物的特征结构。

2.本发明通过柱层析法对骆驼刺粗糖聚合物进行分离纯化，效果显著，首次制备出骆驼刺糖聚物AP3-2、AP3-3。

3.本发明对制备出的骆驼刺糖聚合物AP3-2、AP3-3进行了鉴定，明确了其理化性质及结构，为探究其药理活性机制提供结构依据。

4.本发明提供了骆驼刺中的粗糖聚合物、精糖聚合物的制备方法，及骆驼刺糖聚合物在防治骨质疏松方面的活性研究，为骆驼刺糖聚合物在医药等领域的应用提供依据，本发明还提供了骆驼刺糖聚合物在预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。

5.本发明还提供了骆驼刺糖聚合物的制备方法，与传统水煮法提取骆驼刺糖聚合物相比，本发明采用水提醇沉法，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对骆驼刺糖聚合物进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的糖聚合物与极性小、水溶性差的糖聚合物分离，使后期的分离纯化难度大大降低。且本制备工艺简单，操作方便，可以大规模生产。

附图说明

图1：AP3-2的红外图谱。

图2：AP3-2的¹³C NMR图谱。

图3：AP3-2的¹H NMR图谱。

图4：AP3-2的¹H-¹H COSY图谱。

图5：AP3-2的HSQC图谱。

图6：AP3-2的HMBC图谱。

图7：AP3-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响。

图8：AP3-2对MC3T3-E1细胞分化的影响。

图9：AP3-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响。

图10：AP3-3的红外图谱。

图11：AP3-3的¹³C NMR图谱。

图12：AP3-3的¹H NMR图谱。

图13：AP3-3的¹H-¹H COSY图谱。

图14：AP3-3的HSQC图谱。

图15：AP3-3的HMBC图谱。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

按以下步骤制备骆驼刺糖聚合物：

1)选材：将30kg的骆驼刺地上部分用水浸泡12h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的骆驼刺地上部分用10倍体积量热水(100℃)提取2h，收集提取液；

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为40％，室温静置24h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗糖聚合物AP1；将上清液一于60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为60％，室温静置24h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀即为粗糖聚合物AP2；将上清液二于60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为80％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物AP3；

4)纯化：利用Sevag法分别对各粗糖聚合物进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干，即得纯化粗糖聚合物AP1、AP2、AP3；

5)离子交换柱层析：取200mg纯化粗糖聚合物AP3，溶于10mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用不同盐浓度的洗脱液进行洗脱，出现3个峰，其中峰一为0M的NaCl洗脱部分，峰二为0.05M的NaCl洗脱部分，峰三为0.15M的NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液60℃减压浓缩、冷冻干燥后，得到三种糖聚合物(峰一糖聚合物、峰二糖聚合物、峰三糖聚合物)；

6)分子筛凝胶层析：将步骤5)得到的峰二糖聚合物样品，用水进行溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，分别收集主峰，60℃减压浓缩，冷冻干燥后得骆驼刺糖聚合物AP3-2。

纯度检测：将骆驼刺糖聚合物AP3-2配成2％浓度(W/V)的水溶液，HPGPC法测得保留时间。

经离子交换和凝胶过滤法分离纯化后得到的组分AP3-2呈单一峰，说明AP3-2为骆驼刺均一糖聚合物。

实施例2

按以下步骤制备骆驼刺糖聚合物：

1)选材：将30kg的骆驼刺地上部分用水浸泡6h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的骆驼刺地上部分用5倍体积量热水(60℃)提取3h，收集提取液和残渣，残渣晾干；

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为30％，室温静置10h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗糖聚合物AP1；将上清液一于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为60％，室温静置10h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀即为粗糖聚合物AP2；将上清液二于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为90％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物AP3；

4)纯化：利用Sevag法分别对各粗糖聚合物进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干，即得纯化粗糖聚合物AP1、AP2、AP3；

5)离子交换柱层析：取200mg纯化粗糖聚合物AP3，溶于10mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用不同盐浓度的洗脱液进行洗脱，出现3个峰，其中峰一为0M的NaCl洗脱部分，峰二为0.05M的NaCl洗脱部分，峰三为0.15M的NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液60℃减压浓缩、冷冻干燥后，得到三种糖聚合物(峰一糖聚合物、峰二糖聚合物、峰三糖聚合物)；

6)分子筛凝胶层析：将步骤5)得到的峰三糖聚合物样品，用水进行溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，分别收集主峰，40℃减压浓缩，冷冻干燥后得骆驼刺糖聚合物AP3-3。

实施例3

按以下步骤制备骆驼刺糖聚合物：

1)选材：将30kg的骆驼刺地上部分用水浸泡10h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的骆驼刺地上部分用15倍体积量热水(90℃)提取10h，收集提取液和残渣，残渣晾干；

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为60％，室温静置28h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗糖聚合物AP1；将上清液一于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为80％，室温静置28h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀即为粗糖聚合物AP2；将上清液二于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为99％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物AP3；

4)纯化：利用Sevag法分别对各粗糖聚合物进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干，即得纯化粗糖聚合物AP1、AP2、AP3；

5)离子交换柱层析：取200mg纯化粗糖聚合物AP3，溶于10mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用不同盐浓度的洗脱液进行洗脱，出现3个峰，其中峰一为0M的NaCl洗脱部分，峰二为0.05M的NaCl洗脱部分，峰三为0.15M的NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液60℃减压浓缩、冷冻干燥后，得到三种糖聚合物(峰一糖聚合物、峰二糖聚合物、峰三糖聚合物)；

7)分子筛凝胶层析：将步骤6)得到的峰二糖聚合物样品，用水进行溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，分别收集主峰，70℃减压浓缩，冷冻干燥后得骆驼刺糖聚合物AP3-2。

实施例4骆驼刺糖聚合物AP3-2、AP3-3的结构分析

下面对实施例1提取分离到的AP3-2作进一步结构分析：

(1)单糖组成分析

由完全酸水解产物采用PMP-柱前衍生化高效液相色谱法测得图谱可知，AP3-2单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。

(2)红外光谱检测

AP3-2的红外光谱(如附图1所示)检测结果显示，AP3-2含有糖的特征吸收峰。

(3)甲基化分析

样品经甲基化，水解，还原，乙酰化后GC-MS分析，结果表明AP3-2含有→5)-L-Araf-(1→,→3)-L-Araf-(1→,L-Rhap-(1→,D-GlcAp-(1→,→3,6)-D-Glcp-(1→,→4)-D-Manp-(1→,→4)-D-Xylp-(1→,→4)-D-GalAp-(1→和→6)-D-Galp-(1→糖残基。

(4)糖聚合物的核磁共振分析

将均一糖聚合物AP3-2样品置于核磁管中，用D₂O溶解后测谱，所得结果如图2～6所示。

根据附图2至6的核磁图谱可知各个碳和氢的归属，如下表1所示。

表1 AP3-2核磁共振分析结果

经上述完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示AP3-2是一种由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成的糖聚物，从甲基化分析说明其含有→5)-α-L-Araf-(1→,→3)-α-L-Araf-(1→,α-L-Rhap-(1→,α-D-GlcAp-(1→,→3,6)-α-D-Glcp-(1→,→4)-α-D-Manp-(1→,→4)-β-D-Xylp-(1→,→4)-β-D-GalAp-(1→和→6)-α-D-Galp-(1→糖残基，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出AP3-2的结构为：

其中，a、b的范围为1～1000。

下面对实施例2提取分离到的AP3-3作进一步结构分析：

(1)单糖组成分析

由完全酸水解产物采用PMP-柱前衍生化高效液相色谱法测得图谱可知，AP3-3单糖组成为阿拉伯糖。

(2)红外光谱检测

AP3-3的红外光谱(如附图10所示)检测结果显示，AP3-3含有糖的特征吸收峰。

(3)甲基化分析

样品经甲基化，水解，还原，乙酰化后GC-MS分析，结果表明AP3-3含有→5)-L-Araf-(1→糖残基。

(4)糖聚合物的核磁共振分析

将均一糖聚合物AP3-3样品置于核磁管中，用D₂O溶解后测谱，所得结果如附图11至15所示。

根据附图11至15的核磁图谱可知各个碳和氢的归属，如下表2所示。

表2 AP3-3核磁共振分析结果

经上述完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示AP3-3是一种由阿拉伯糖组成的糖聚物，从甲基化分析说明其含有→5)-α-L-Araf-(1→糖残基，糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出AP3-3的结构为:

其中，a的范围为1～1000。

以上均一糖聚合物可能是骆驼刺抗骨质疏松的活性成分，因而，均一糖聚合物的结构鉴定将为后续探究骆驼刺抗骨质疏松的机制提供有力依据。

实施例5骆驼刺糖聚合物AP3-2的抗骨质疏松作用研究

1实验方法

1.1糖聚合物AP3-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响

以新鲜的完全培养基将MC3T3-E1细胞悬液稀释至2.5×10⁴cells/mL，以每孔200μL种于96孔板内培养24h。用完全培养基将糖聚合物AP3-2稀释至2.4μM、4.8μM、9.6μM、19.2μM、38.5μM和76.9μM。在MC3T3-E1细胞贴壁24h后，更换成含有样品的完全培养基(200μL/well)，每个浓度设置6个复孔。同时设置给予完全培养基的正常组(Normal)，完全培养基+雌二醇(0.1μM)的阳性对照组。

糖聚合物对MC3T3-E1细胞作用48h后，将培养基吸出，每孔加入含10％CCK-8的新鲜培养基200μL，于37℃培养箱中孵育4h，同时检测492nm(空白)波长处的OD值。细胞增殖率的公式：(OD_Sample-OD_Normal)/OD_Normal×100％。

1.2糖聚合物AP3-2对MC3T3-E1细胞分化的影响

依据CCK-8检测结果，AP3-2选择2.4μM、4.8μM和9.6μM三个浓度进行下一步实验。用成骨诱导培养基将糖聚合物AP3-2分别稀释至2.4μM、4.8μM和9.6μM。以新鲜的完全培养基将细胞悬液稀释至2.6×10⁴cells/mL，以每孔500μL接种于24孔板内。72h后，更换成含有样品的诱导培养基(500μL/well)，每个浓度设置4个复孔。设置给予完全培养基的正常组(Normal)，给予成骨诱导培养基的对照组(Control)，成骨诱导培养基+雌二醇(0.1μM)的阳性对照组。

样品作用于MC3T3-E1细胞8d后，弃去培养基，每孔加300μL的PBS缓冲液清洗细胞，弃去PBS，每孔加入100μL的RIPA裂解液，4℃作用1h，收集裂解液离心(4℃,5min,12400×g)，收集蛋白上清，于-20℃保存待用。

参照BCA Protein Assay试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。检测562nm波长下的OD值，根据标准曲线计算各组蛋白的浓度。

采用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒，根据说明书进行实验。在96培养孔板中加入1μL上述蛋白上清液、49μL检测缓冲液和50μL的显色底物，置于37℃培养箱中孵育(具体时间视孔内颜色变化而定)，向各孔加入100μL的反应终止液，检测405nm波长下的OD值。由ALP标准曲线计算出各组蛋白上清中相当于β-nitrophenol的摩尔浓度；ALP活性(U/L)＝蛋白实际摩尔浓度×1000×100/60。

1.3糖聚合物AP3-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响

用成骨诱导培养基将糖聚合物AP3-2稀释至2.4μM、4.8μM和9.6μM。以新鲜的完全培养基将细胞悬液稀释至5.24×10⁴cells/mL，以每孔1mL接种于12孔板内培养72h。更换成含有样品的成骨诱导培养基(500μL/well)，每个浓度设置4个复孔。设置给予完全培养基的正常组(Normal)，给予成骨诱导培养基的对照组(Control)，成骨诱导培养基+雌二醇(0.1μM)的阳性对照组。给药诱导21天后，进行茜素红染色，显微镜下观察并拍照。每个浓度设3个复孔，检测562nm波长处的OD值。计算细胞的矿化率，矿化率＝(OD_Sample-OD_Normal)/OD_Normal×100％。

2实验结果

AP3-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响见附图7(^##P<0.01,^###P<0.001vs.Normal；)，如图所示，随着AP3-2浓度的增加，细胞的增殖率先升高后降低。2.4μM、4.8μM、9.6μM、19.2μM和38.5μM组显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，且4.8μM组增殖率最高。

碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞早期分化的标志。AP3-2对MC3T3-E1细胞分化的影响如附图8所示(^###P<0.001vs.Normal；*P<0.05,***P<0.001vs.Control)，与Normal组相比，Control组MC3T3-E1细胞的ALP活性显著增强(P<0.001)，说明成骨诱导的细胞模型造模成功。给药8d后，AP3-2对MC3T3-E1细胞的ALP活性呈剂量依赖性增强。且与Control组相比，4.8μM和9.6μM组的AP3-2显著促进ALP活性。

茜素红与基质中钙离子形成红色沉淀，即钙结节，可用于评价成骨细胞的矿化作用。AP3-2对MC3T3-E1细胞矿化的影响如附图9所示(图A为用不同浓度的APP90-2处理并用茜素红S染色的MC3T3-E1细胞的图像；图B为茜素红S染色后MC3T3-E1细胞钙结节的定量分析。***P<0.001vs.Control)，培养21d后，Control组MC3T3-E1细胞矿化率明显高于Normal组，表明成功诱导MC3T3-E1细胞矿化。与Control组比较，E2组和2.4μM、4.8μM、9.6μM的AP3-2组形成大量钙结节。可见AP3-2对MC3T3-E1细胞矿化有促进作用。

3结论

通过上述方法提取的骆驼刺糖聚合物AP3-2可以促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖，分化和矿化，证明其具有良好的体外促成骨活性，为后续对骆驼刺糖聚合物的抗骨质疏松机制进行研究提供了依据。因此，骆驼刺糖聚合物为制备防治骨质疏松药物中的应用提供了依据。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的普通技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。