阅读说明：本技术 具有抗氧化应激损伤的脉红螺多肽及其制备方法与应用 (Rapana venosa polypeptide with function of resisting oxidative stress damage as well as preparation method and application of rapana venosa polypeptide ) 是由 张姗姗 刘可春 李晓彬 张轩铭 张云 侯海荣 夏青 孙晨 于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有抗氧化应激损伤的脉红螺多肽及其制备方法与应用。一种具有氧化应激损伤功能的脉红螺多肽复合物,氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。本发明还公开了上述多肽作为药效成分在制备治疗氧化应激损伤引起的疾病的药物或者作为保健成分在制备抗氧化保健品中的应用。本发明所述5种多肽化合物均可以单独通过清除体内ROS的产生,减少斑马鱼体内巨噬细胞聚集,抑制血管中血管紧张素转化酶的生成以及抑制炎症细胞因子白细胞介素1(IL-11)的生成,修复由氧化应激导致的机体损伤,具有广阔的市场前景。(The invention relates to a rhodospirillum polypeptide with oxidative stress damage resistance and a preparation method and application thereof.A rhodospirillum polypeptide compound with oxidative stress damage resistance function has an amino acid sequence shown as SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5 or SEQ ID No. 6. the invention also discloses the application of the polypeptide as a drug effect component in the preparation of a drug for treating diseases caused by oxidative stress damage or as a health-care component in the preparation of an antioxidant health-care product.)

具有抗氧化应激损伤的脉红螺多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗氧化应激损伤的脉红螺多肽及其制备方法与应用，属于功能多肽技术领域。

背景技术

氧化应激是指机体由于内源性(各种代谢反应产生的内源性活性氧自由基)或外源性(环境因素、药物、机体衰老)的原因，体内产生大量的活性氧簇(ROS)等氧化物质，使机体氧化还原平衡能力失调，进而导致机体内蓄积过多ROS，而体内过多的ROS，会使机体自身抗氧化能力下降，产生脂质过氧化反应，使细胞DNA损伤甚至凋亡，促进炎症因子生成，阻碍营养物质代谢，损伤组织功能，从而导致疾病的产生。现代研究表明，氧化应激与心脑血管疾病、神经疾病、炎性疾病等慢性非传染性疾病等的发生和发展至关重要，随着人民生活水平的不断提升，氧化应激损伤引起的疾病成为影响人们身体健康的主要疾病，并且随着我国老龄化形势不断加剧，老年人口因身体机能的下降，罹患氧化应激损伤相关疾病的概率更高，对家庭和生活造成极大的经济负担，因此，对机体的氧化应激状态进行早期干预，改善机体氧化还原失衡状态，降低疾病的发生和发展，成为现今医药研发及大健康产业的研究热点。

海洋生物种类繁多，数量庞大，来自于海洋生物的活性物质，如肽类、多糖、萜类物质等有着好的抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等活性^[1]。随着国家“海洋强国”政策的推进，近年来对于海洋生物的开发也越来越受到重视。海洋生物因其生活环境与陆地生物存在极大的不同，来源于海洋生物的活性物质往往具有新颖的结构和独特的生物活性，可为新药研发所需的先导化合物提供更多的可能性。

如中国专利文献CN109180781A(申请号201810915407.5)公开了一种具有修复氧化损伤功能的多肽及其制备方法与应用。一种具有修复氧化损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了上述多肽作为药效成分在制备治疗氧化损伤引起的疾病的药物或者作为保健成分在制备抗氧化保健品中的应用。本发明首次公开了从香螺中提取的含有10个氨基酸残基的多肽化合物，通过检测发现，该多肽化合物可以通过清除体内ROS的产生，抑制血管中血管紧张素转化酶的生成，抑制血糖的升高，修复由过氧化物导致的氧化应激损伤，可以进行后续治疗氧化损伤引起的疾病的药物及抗氧化保健品的开发。

脉红螺(Raoana venosa)属软体动物门(Mollusca)，腹足纲(Gastropoda)，前鳃亚纲(Prosobranchia)，新腹足目(Neogastropoda)，骨螺科(Muricidae)，是一种有重要经济价值的大型海产动物。它主要分布在我国的黄海、渤海和东海以及日本沿海、朝鲜半岛等区域。脉红螺的软体部由头部、足部及内脏团三部分组成，肉质肥厚紧致，味道鲜美，营养价值高。到目前为止，大多数有关脉红螺的研究主要集中在其生物学上，如基因组，营养学，生殖特征等，或者是其营养成分，如粗蛋白，多糖，粗脂质等。目前与脉红螺的活性成分相关的报道较少。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供具有抗氧化应激损伤功能的多肽及其制备方法与应用。

本发明技术方案如下：

具有抗氧化应激损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：Met-Val-Leu-Leu-Gly-Val-Leu-Met-Gly MVLLGLVLMG。

具有抗氧化应激损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：Ala-Arg-Leu-Gly-Leu-Ala-Thr-Leu ARLGLATL

具有抗氧化应激损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：Leu-Leu-Thr-Arg-Ala-Gly-Leu LLTRAGL

具有抗氧化应激损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5：Lys-Ser-Thr-Glu-Leu-Leu-Ile KSTELLI

具有抗氧化应激损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.6：Phe-Gly-Ile-Asn-Leu-Ile-Gln FGINLIQ

一种具有抗氧化应激损伤功能的多肽组合，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6共同构成的多肽组合。

一种提取上述具有抗氧化应激损伤功能的多肽的方法，步骤如下：

(1)将脉红螺去壳后，取全部软体组织部分，磨碎，然后加入软体组织重量1～10倍的酸溶液，酸溶液pH值1.0～4.0，然后加入软体组织重量5～20％的胃蛋白酶，35～40℃条件下振荡酶解1～5h，然后调pH值至7.0～9.0，加入软体组织重量5～20％的胰蛋白酶和糜蛋白酶，35～40℃条件下振荡酶解1～5h，离心，取上清液，然后经浓缩、冻干，制得脉红螺多肽提取物；

(2)将步骤(1)制得的脉红螺多肽提取物用缓冲盐溶液复溶，用葡聚糖凝胶G25进行柱分离，pH值6.0～8.0缓冲盐溶液为洗脱剂，洗脱5个柱体积，收集第3～5柱体积馏分，冻干，干粉盐水溶解，以Sephadex LH-20进行分离，以盐水为洗脱剂，按照10mL/45min的速度收集样品，每45min收集一份，将第14～20份的活性段洗脱液合并，经浓缩，制得多肽活性段粗提物；

(3)将步骤(2)制得的多肽活性段粗提物用浓度10mM、pH5.8～6.2的乙酸铵缓冲液溶解，经4.5μm微孔膜过滤，然后经Welch HILIC Amide柱分离，二元流动相为乙腈(ACN)和浓度10mM、pH5.8～6.2的乙酸铵缓冲液，乙腈(ACN)与乙酸铵缓冲液的体积比为85:15，流速为0.8ml·min^-1，收集210nm处具有体外DPPH自由基清除活性的吸收峰的洗脱液，鉴定确定氨基酸组成，冻干，制得具有抗氧化应激损伤功能的多肽。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，胃蛋白酶酶解pH值2.0～3.0，胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解pH值为7.2～8.0；进一步优选的，所述步骤(1)中，pH调节剂为盐酸和氢氧化钠。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述胰蛋白酶与糜蛋白酶的酶活比例为1：(0.2～5)。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，缓冲盐体系为磷酸盐缓冲体系，pH值6.8～7.2。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，鉴定确定氨基酸组成采用LC-MS蛋白鉴定技术。

上述具有抗氧化应激损伤功能的多肽之一或者二者以上的组合作为药效成分在制备治疗氧化应激损伤疾病药物中的应用。

上述具有抗氧化应激损伤功能的多肽之一或者二者以上的组合作为有效成分在制备抗氧化保健食品中的应用。

有益效果

本发明首次公开了从脉红螺中提取的5个抗氧化应激活性肽，通过检测发现，上述5种多肽化合物均可以单独通过清除体内ROS的产生，减少斑马鱼体内巨噬细胞聚集，抑制血管中血管紧张素转化酶的生成以及抑制炎症细胞因子白细胞介素1(IL-11)的生成，修复由氧化应激导致的机体损伤，可以进行后续预防氧化应激损伤导致的疾病的药物及抗氧化保健品的开发，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1实施例中所用脉红螺原料照片；

图中：A、脉红螺整体外观；B脉红螺软组织；

图2采用凝胶渗透色谱法测定从脉红螺活性段的分子量(MW)分布结果图；

图3活性肽氨基酸序列MS/MS质谱结果图；

其中：图3-1是SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的MS/MS质谱结果图；

图3-2是SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的MS/MS质谱结果图；

图3-3是SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的MS/MS质谱结果图；

图3-4是SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的MS/MS质谱结果图；

图3-5是SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的MS/MS质谱结果图；

图3-6是SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的MS/MS质谱结果图；

图4脉红螺Sephadex LH-20洗脱各馏分段活性检测结果曲线图；

图5脉红螺活性段粗提物HILIC色谱柱检测结果；

图6对比例1中各馏分段样品的HILIC色谱柱检测结果图；

图中：A第8～13份样品的HILIC色谱图；B第21～29份样品的HILIC色谱图；

图7对比例2中馏分段样品的HILIC色谱柱检测结果图；

图8各样品对斑马鱼体内氧化损伤修复效果图；

图9各样品对斑马鱼体内抗炎效果图；

图中：A空白对照；B模型组；C阳性对照组；D实施例1组；E实施例2-1；F实施例2-2；G实施例2-3；H实施例2-4；I实施例2-5；J实施例2-6；

图10基于分子对接技术的各样品与ACE酶对接效果图；

其中：图10-1是实施例2-1和实施例2-4与ACE酶的分子对接的3D图；

图10-2是实施例2-1和实施例2-4与ACE酶的分子对接的2D图；

图11基于分子对接技术的各样品与IL-11对接效果图；

其中：图11-1是实施例2-1和实施例2-4与IL-11的分子对接的3D图；

图11-2是实施例2-1和实施例2-4与IL-11的分子对接的2D图；

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源

实施例中所述脉红螺购自山东济南海鲜市场，普通市售产品，如图1所示。

检测方法

活性组分分子量分布检测方法

使用TSK-gel G2000 SW_XL柱(7.8mm×250mm)(TOSOH，Yamaguchi，Japan)，采用凝胶渗透色谱法测定从脉红螺活性段的分子量(MW)分布(图2)。流动相由0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH 6.7)和0.1mol·L^-1Na₂SO₄组成，流速设定为0.2mL·min^-1。

用核糖核酸酶(13700Da)，盐酸抑肽酶(6511Da)，血管紧张素II(1046Da)，HHL(430Da)和L-丝氨酸(105Da)为对照品，绘制洗脱体积-分子量曲线为In Mw＝17.50～0.089T(R²＝0.9785,Mw为分子量，T为洗脱体积)。

活性组份氨基酸组成检测方法

将待检测的冻干活性肽溶解于6mol·L^-1HCl中(1mg肽/mL HCl)，在110℃干燥箱中水解24小时。将过滤后的水解样品在45℃下通过旋转蒸发器蒸发。将残余物溶于蒸馏水中并冷冻干燥。然后，将样品和混合物氨基酸标准品用AQC衍生化并通过RP-HPLC₁₈测定。从混合氨基酸的标准曲线中鉴定和定量样品馏分的氨基酸组成(表1)。所有样品一式三份测定。

nano-LC-LTQ-Orbitrap-MS/MS鉴定活性肽的序列

采用EASY-Nlc1000色谱系统(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)、LTQ OrbitrapVelos Pro质谱仪(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)对活性肽的氨基酸序列鉴定。纯化的肽用含有0.1％三氟乙酸的浓度为0.1mg·mL^-1的超纯水溶解。然后将2μL样品注入捕集柱(100μm×20mm，RP-C18，thermo Inc.)中进行预浓缩。随后预浓缩的样品自动进入分析柱(75μm×150mm，RP-C18，thermo Inc.)。以0.1％(v/v)甲酸在超纯水为洗脱剂，分析时长：60min，检测方式：正离子模式，喷雾电压：1.8kV，离子传输毛细管温度：250℃，使用前经标准校正液校正，母离子扫描范围：350-1800m/z，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(IDA，Information Dependent Analysis)，每次全扫描(full scan)后采集最强的10个碎片图谱(MS2 scan)，碎裂方式：碰撞诱导解离(CID，collision-induced dissociation)，正态化能量35％,q值0.25,活化时间：30ms，动态排除时间：30s。MS1在M/Z 400时分辨率为60,000，MS2在离子阱中为单位质量分辨。一级质谱采用profile模式采集，二级质谱采用centroid方式采集以降低数据文件大小。Mascot 2.3软件(Matrix Science，USA)用于数据分析。数据库为蛾螺科数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2。固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)、Oxidation(M)；MS容差为±30ppm，MSMS容差为±0.15Da。NCBInr数据库用于肽鉴定。仅考虑具有低于0.05的预期值的鉴定的肽。BIOPEP数据库用于寻找先前鉴定的具有抗氧化氨基酸序列。活性肽氨基酸序列MS/MS质谱结果见图3。

实施例1

提取具有抗氧化应激损伤功能的多肽的方法，步骤如下：

(1)将脉红螺去壳后，取全部软体组织部分，磨碎，采用多重消化道酶半仿生制备技术，即脉红螺组织加入5倍酸水溶液(pH值2.2)，按酶底物比为8％加入胃蛋白酶，37.6℃条件下振荡提取2h，随后调整反应体系pH值至7.8，按酶底物比为8％加入胰蛋白酶和糜蛋白酶，胰蛋白酶与糜蛋白酶的酶活比例为1：1，37.6℃条件下振荡提取2h，反应液离心后取上层清液，浓缩，冻干，干粉低温保存，制得脉红螺多肽提取物；

(2)将步骤(1)制得的多肽提取物用缓冲盐溶液复溶，用葡聚糖凝胶G25进行柱分离，pH值6.8磷酸盐缓冲液为洗脱剂，洗脱5个柱体积，收集第3～5柱体积馏分，冻干，干粉盐水溶解，以Sephadex LH-20进行分离，以盐水为洗脱剂，按照10mL/45min的速度收集样品，每45min收集一份，结合体外DPPH自由基清除活性，将第14～20份的活性段洗脱液合并(图4)，经浓缩，制得多肽活性段粗提物，采用GPC法，表征脉红螺活性肽段的分子量分布于＜3000Da的区域；

(3)将步骤(2)制得的多肽活性段粗提物用浓度10mM、pH5.8-6.2的乙酸铵缓冲液溶解，经4.5μm微孔膜过滤，然后经Welch HILIC Amide柱分离，二元流动相为乙腈(ACN)和浓度10mM、pH5.8-6.2的乙酸铵缓冲液，乙腈(ACN)与乙酸铵缓冲液的体积比为85:15，流速为0.8ml·min^-1，结合体外DPPH自由基清除活性，收集210nm处具有活性的吸收峰的洗脱液(图5)，冻干，制得具有抗氧化应激损伤功能的多肽，经LC-MS蛋白鉴定技术，确定其氨基酸组成。

经检测，具有抗氧化应激损伤功能的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6所示:

SEQ ID NO.1：Met-Val-Leu-Leu-Gly-Val-Leu-Met-Gly MVLLGLVLMG。

SEQ ID NO.2：Ala-Arg-Leu-Gly-Leu-Ala-Thr-Leu ARLGLATL

SEQ ID NO.3：Leu-Leu-Thr-Arg-Ala-Gly-Leu LLTRAGL

SEQ ID NO.4：Gly-Thr-Ser-Phe-Thr-Thr-Thr-Ala-Glu-Arg GYSFTTTAER

SEQ ID NO.5：Lys-Ser-Thr-Glu-Leu-Leu-Ile KSTELLI

SEQ ID NO.6：Phe-Gly-Ile-Asn-Leu-Ile-Gln FGINLIQ

实施例2-1

采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。

实施例2-2

采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。

实施例2-3

采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽。

实施例2-4

采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽。

实施例2-5

采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的多肽。

实施例2-6

采用刘振南等所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报，1999，5(2)：110-112)，人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的多肽。

对比例1-1

如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中所述的收集的洗脱液为第8～13份(A)浓缩，制得相应的多肽混合物样品。按步骤(3)中所述纯化方法，在相同保留时间条件下，未见相应色谱峰(图6)。表明所述活性多肽仅存于585～900min馏分段中。故以步骤(2)所制得样品为供试品，用于下一步活性评价实验。

对比例1-2

如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中所述的收集的洗脱液为第21～29份(B)浓缩，制得相应的多肽混合物样品。按步骤(3)中所述纯化方法，在相同保留时间条件下，未见相应色谱峰(图6)。表明所述活性多肽仅存于585～900min馏分段中。故以步骤(2)所制得样品为供试品，用于下一步活性评价实验。

对比例2

如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(1)中所述的实验原料为香螺全部软体组织。按步骤(3)中所述纯化方法，在相同保留时间条件下，未见相应色谱峰(图7)。表明香螺全部软体组织的提取物中不含有所述活性多肽。故以步骤(2)所制得样品为供试品，用于下一步活性评价实验。

实验例

DPPH自由基清除活性

根据Lee等人描述的方法检测样品多肽的DPPH自由基清除活性。

将200μl级分加入到含有200μl0.15mmol·L^-1DPPH乙醇溶液的管中，并将混合物涡旋几秒钟。然后，将混合物在黑暗中于37℃温育12小时。超纯水用作对照。在517nm处测量吸光度，并一式三份进行测定。肽级分的DPPH自由基清除活性计算如下式：

DPPH自由基清除活性(％)＝(1-As/Ac)×100

其中As是样品的吸光度，Ac是对照的吸光度。虽然活性肽的DPPH自由基清除活性用半抑制浓度(IC50)表示，IC₅₀定义为抑制50％自由基形成所需的肽浓度。实施例及对比例的DPPH自由基清除率IC₅₀见表2。

体内抗氧化活性的测定

通过使用转基因斑马鱼系Tg(krt4：NTR-hKikGR)cy17，进行多肽样品的体内抗氧化的检测。

将发育24hpf的转基因斑马鱼胚胎分配到24孔细胞培养板(10个胚胎/孔)中，并与2mL10mM甲硝唑(MTZ，溶于斑马鱼培养水)和多肽样品一起孵育，剂量为100μg·mL^-1，28℃条件下，药物处理24小时后。用没有甲硝唑和肽的鱼水处理的斑马鱼用作媒介物对照。用不含肽的甲硝唑处理的斑马鱼用作阴性对照。用Vitmin C代替肽作为阳性对照。每组至少进行三次平行重复。孵育后，用三卡因(0.16％，w/v)麻醉斑马鱼胚胎，然后观察斑马鱼胚胎的荧光并使用FSX100 Bio Imaging Navigator仪器成像。通过使用imagepro-plus软件评估荧光斑点的数量。多肽样品的体内抗氧化活性计算如下式：

抗氧化活性(％)＝(FS_s-FS_nc)/(FS_vc-FS_nc)×100

其中FS_s是样品的荧光点(多肽样品)，FS_nc是阴性对照的荧光点，FS_vc是荧光点(维生素C)。实施例1和2及对比例1和2的体内抗氧化评价结果见图8。

体内抗炎活性的测定

通过使用巨噬细胞荧光TG斑马鱼(zlyz：EGFP)，进行多肽样品的体内抗炎的检测。

将发育72h健康斑马鱼随机分配到24孔板中，每孔10条，每孔体积2ml，设置空白组、模型组、阳性对照组和给药组，空白组只加养鱼水处理，模型组为后加入硫酸铜处理，阳性对照组为依次加入浓度为100μg/ml布洛芬溶液及硫酸铜处理，给药组依次加入不同浓度的样品溶液及硫酸铜处理。模型组、阳性对照组及给药组处理方法为先用药物处理一定时间后，向各实验组加入适量硫酸铜溶液，使体系中硫酸铜溶液的终浓度达到20μg/ml，随后加盖封闭，置于28℃光照箱中孵育1h，随后用养鱼水洗去斑马鱼幼鱼表面的硫酸铜和药物残留，加入少量三卡因，麻醉幼鱼，于体式荧光体视显微镜下观察每条幼鱼的巨噬细胞变化情况，在4倍下对斑马鱼幼鱼进行拍照记录，采用Image pro-plus软件对图片进行处理分析，统计中性粒细胞向脊索中线迁移的数量。实施例1和2及对比例1和2的体内抗炎评价结果见图9。

基于分子对接技术的ACE抑制活性研究

采用ChemBioOffice2014中的ChemDraw模块和Chem3D pro模块，绘制出6个纯肽的3D结构，多肽作为配体。以ACE作为分子对接的降压活性靶点。ACE的三级结构分别来源于Protein Data Bank(PDB)数据库。对配体进行加电荷(add valence)、加电场(applyforcefoild)处理，对受体进行除水(remove water)、蛋白处理(clean protein)、加电荷(add valence)、加电场(apply forcefoild)处理后，设置活性位点及对接半径，采用Discovery Studio2016软件中的CDocker模块进行分子对接。根据CDocker energy以及CDocker interaction energy值，探讨6个多肽纯品的潜在的降压活性。

基于分子对接技术的IF-1α抑制活性研究

采用ChemBioOffice2014中的ChemDraw模块和Chem3D pro模块，绘制出6个纯肽的3D结构，多肽作为配体。以白介素细胞1(IL-11)作为分子对接的抗炎靶点。IL-11的三级结构分别来源于Protein Data Bank(PDB)数据库。对配体进行加电荷(add valence)、加电场(apply forcefoild)处理，对受体进行除水(remove water)、蛋白处理(clean protein)、加电荷(add valence)、加电场(apply forcefoild)处理后，设置活性位点及对接半径，采用Discovery Studio2016软件中的CDocker模块进行分子对接。根据CDocker energy以及CDocker interaction energy值，探讨6个多肽纯品的潜在的抗炎活性。

体外细胞氧化损伤修复活性的测定

采用H₂O₂诱导的巨噬细胞RAW264.7氧化损伤修复模型测定多肽样品的细胞氧化损伤修复活性。

将培养至对数期的RAW264.7细胞接种于96孔板中(细胞密度为2×104个/mL)，每孔接种190μL，设立样品组、阴性对照组和损伤对照组，除阴性对照组加DMSO处理外，其余组均加入10μL H₂O₂处理4h，随后样品组加入1μL待测样品，损伤对照组加入1μL DMSO，放入37℃，含5％CO₂培养箱中培养48h，测定实施例样品对损伤模型细胞活力、细胞内氧化水平以及抗氧化酶系的影响。实验结果见表3。

统计分析

所有测试重复三次，结果表示为平均值±标准偏差。SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)用于统计分析。所有数据均由Origin 9.0(Origin Lab，Northampton，MA，USA)制作。单因素方差分析(ANOVA)用于分析差异。P值小于0.05被认为是统计学上显着的。Pearson相关系数用于评估内容和活动之间的相关性。线性回归方程通过线性回归分析计算。

实验结果

从脉红螺活性肽复合物的氨基酸组成见表1，实施例和对比例的体外DPPH自由基清除实验活性评价结果见表2。实施例和对比例的体外细胞氧化损伤修复活性评价结果见表3。实施例和对比例的体内抗氧化活性评价结果见图8，实施例和对比例体内抗炎活性评价结果见图9，实施例和对比例的ACE抑制效果见图10，实施例和对比例的IF-1α抑制效果见图11。

由表1可知，脉红螺活性肽复合物的总氨基酸含量为925.93mg/g，共检出17种氨基酸，其中，丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)和苏氨酸(Thr)为香螺中含量最高的3种氨基酸，占其氨基酸总量的51.45％。

表1脉红螺活性段氨基酸组成鉴定

由表2可知，实施例各样品均具有较强的体外DPPH自由基清除实验活性，且对比例所得的样品不具备体外抗氧化活性。

表2实施例和对比例样品的体外抗氧化活性评价结果(IC₅₀值，n＝3，)

由表3可知，实施例中各样品均可改善细胞氧化损伤程度，与模型组相比呈现显著性差异，且对比例中各样品不能改善细胞氧化损伤。

表3实施例样品的体外细胞氧化损伤修复评价结果(IC₅₀值，n＝3，)

由图8可知，实施例中各样品均可以显著减少由甲硝唑导致的斑马鱼皮肤荧光细胞的凋亡，改善斑马鱼的氧化损伤，且与模型组相比，对比例各样品斑马鱼皮肤荧光细胞的数量未见显著性差异，实验结果进一步表明，由上述方法所制备的特征肽段序列的多肽具有显著的抗氧化活性。各样品的基于斑马鱼的抗炎活性评价结果如图9所示，实施例中各样品均可以显著减少由硫酸铜导致的斑马鱼巨噬细胞迁移，且与模型组相比，对比例各样品斑马鱼巨噬细胞的迁移率未见显著性差异，表明各多肽具有显著的抗炎活性。结合分子对接实验，进一步确认，本发明所述的特征肽对炎症相关受体IF-1α具有抑制效果(图11)，且同时能抑制血管紧张素转化酶的功能(图10)，具有潜在的降压活性。

综合上述实验结果可知，由上述方法所制备的特征肽段序列的多肽具有显著的体内、体外抗氧化活性和体内抗炎活性，同时能够抑制血管紧张素转化酶的生成，抑制细胞炎症因子IF-1α的生成，具有潜在的抗氧化应激损伤功能，可作为药效成分用于制备氧化应激损伤修复药物及抗氧化保健品。

序列表

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 具有抗氧化应激损伤的脉红螺多肽及其制备方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 脉红螺(Rapana venosa)

<400> 1

Met Val Leu Leu Gly Leu Val Leu Met Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 脉红螺(Rapana venosa)

<400> 2

Ala Arg Leu Gly Leu Ala Thr Leu

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 脉红螺(Rapana venosa)

<400> 3

Leu Leu Thr Arg Ala Gly Leu

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 脉红螺(Rapana venosa)

<400> 4

Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 脉红螺(Rapana venosa)

<400> 5

Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 脉红螺(Rapana venosa)

<400> 6

Phe Gly Ile Asn Leu Ile Gln

1 5