检测新型冠状病毒的多肽或其组合
阅读说明：本技术 检测新型冠状病毒的多肽或其组合 (Polypeptide or combination thereof for detecting novel coronavirus ) 是由 向志光 刘晓立 秦川 刘云波 鲍琳琳 高虹 佟巍 孔琪 郭智 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,特别涉及检测新型冠状病毒的多肽或其组合。经序列抗原预测分析合成12条多肽,12条多肽的混合物PM与新型冠状病毒重组蛋白RN和RS进行抗原性比较分析,PM与RN、RS的抗原性相当。无病原接触者亦存在阳性反应；将12条肽分别与无病原接触者样品进行测试,其中多肽P5和P8具有良好的抗原特异性；利用P5与P8的混合物P58进行多样本测试,在ELISA反应体系中其敏感性与重组抗原无明显差异,特异性达96%。本发明提供的新型冠状病毒的特异性多肽抗原具有较好的血清学诊断应用价值。(The invention relates to the field of biological medicine, in particular to polypeptide or a combination thereof for detecting novel coronavirus, wherein 12 polypeptides are synthesized through sequence antigen prediction analysis, the antigenicity of a mixture PM of the 12 polypeptides is equivalent to that of RN and RS through antigenicity comparison analysis, a positive reaction also exists for a patient without pathogen contact, the 12 peptides are respectively tested with a sample of the patient without pathogen contact, wherein the polypeptides P5 and P8 have good antigenic specificity, and the mixture P58 of P5 and P8 is used for multi-sample test, so that the sensitivity and the recombinant antigen have no obvious difference in an E L ISA reaction system, and the specificity reaches 96%.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及检测新型冠状病毒的多肽或其组合。
背景技术
新型冠状病毒感染的诊断需要经过病原学、影像学、临床症状等手段，而病毒感染引起人类的免疫应答，对患者血液的抗体检测可以作为辅助诊断的手段。冠状病毒是一类人类常见的病原体，如HKU1和OS43等β类冠状病毒亦可引起呼吸道感染，在人群中的感染率较高，新型冠状病毒同属β类冠状病毒，在蛋白序列上他们有一定的相似性。小鼠的MHV病毒也是该属的病毒，我们将上述4种病毒以及SARS-CoV的NP蛋白进行序列比较（图1），可见其蛋白序列具有相似性，但仍有一些差别。利用全病毒或是重组蛋白抗原进行检测时，存在交叉识别其他病毒抗体的可能。
而找到新型冠状病毒特异的多肽类抗原，能够避免与其他普通冠状病毒抗原的交叉，降低其他病毒感染对于此病毒感染抗体识别的干扰具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测新型冠状病毒的多肽或其组合。该新型冠状病毒特异性多肽，用于病患病毒抗体诊断。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了多肽或其组合，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽的组合中，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多肽与具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽的摩尔比为1：10~10：1；优选1:1。
更重要的是，本发明还提供了所述的多肽或其组合在制备新型冠状病毒的检测试剂或检测工具中的应用。
本发明还提供了检测新型冠状病毒的试剂，包括所述的多肽或其组合以及检测可接受的助剂。
本发明还提供了检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的多肽或其组合以及检测可接受的助剂或载体。
本发明对新型冠状病毒的蛋白序列进行分析，寻找与其他冠状病毒有差异且抗原性强的位点，合成多肽类抗原物质，利用酶联免疫吸附试验测定抗原物质与患者、无病原接触者以及感染实验动物的血清样品，评价多肽类抗原的抗原性和特异性。
经病毒抗原蛋白氨基酸序列预测分析筛选并合成12条多肽，12条多肽的混合物（Peptides mixture，PM）与新型冠状病毒重组蛋白NP（Recombinant NP，RN）和新型冠状病毒重组蛋白S（Recombinant S，RS）进行抗原性比较分析，PM与RN、RS的抗原性相当。无病原接触者与PM、RN、RS亦存在免疫反应性；将12条肽分别与数例无病原接触者血清样品进行测试，筛选出2条多肽P5和P8，与新型冠状病毒无接触者血清样品无免疫反应性，多肽P5和P8具有良好的抗原特异性；利用P5与P8的混合物P58进行多样本测试，在ELISA反应体系中其敏感性与重组抗原RN和RS无明显差异，且以P58为抗原的ELISA检测方法在健康人群小样本量的特异性达96%。本发明提供的新型冠状病毒的特异性多肽抗原P5和P8及其混合物P58具有较好的血清学诊断应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示β属5种冠状病毒NP蛋白序列比较结果；利用Laseegene magicAlign软件的ClustalW (Slow/Accurate, Gonnet) 方法对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、HKU1、OS43、SARS冠状病毒以及小鼠的MHV冠状病毒的NP蛋白序列进行比对分析；
图2示SARS-CoV-2感染小鼠与不同抗原物质的反应性；
图3示SARS-CoV-2感染小鼠与不同抗原物质的反应性的数据分析；
图4示SARS-CoV-2感染猴血清与不同抗原物质的反应性；
图5示SARS-CoV-2感染猴血清与不同抗原物质的反应性的数据分析；
图6示SARS-CoV-2患者血清与不同抗原物质的反应性；
图7示SARS-CoV-2患者血清与不同抗原物质的反应性的数据分析；
图8示无SARS-CoV-2接触健康人血清与不同多肽抗原的反应性；
图9示多肽P58混合抗原与人样品的反应性；
图10示多肽P58混合抗原与人样品的反应性的数据分析；
图11示猴感染SARS-CoV-2早期（5-7天）在以P58为抗原物种的IgM抗体检测体系中的反应；
图12示猴感染SARS-CoV-2早期（5-7天）在以P58为抗原物质的IgM抗体检测体系中的反应的数据分析；
图13示效果例5中随机选取10份无SARS-CoV-2感染接触健康人血清进行测试的结果；
图14示效果例5中扩大阴性样品比例进行测定的结果。
具体实施方式
本发明公开了检测新型冠状病毒的多肽或其组合，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的检测新型冠状病毒的多肽或其组合中所用原料及试剂均可由市场购得。
12条多肽由北京亚美多肽生物科技有限公司合成，多肽纯度为95%以上。利用碳酸盐包被系统继续多肽的包被，每孔抗原量为１μg，使用含１%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭。酶标板为Costar产品。使用Hrp标记的二抗、TMB单组份显色液来自索莱宝公司。对照抗原重组蛋白NP（RN）和重组蛋白S（RS）来自北京义翘神州公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测SARS-CoV-2血清抗体的标准操作程序
1. 目的
为规范酶联免疫吸附法（ELISA）检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 特异性抗体，保证其作为检测指标的准确性和可靠性，同时确保环境和人员安全制定本标准操作程序。
2. 原理
血清样品中的SARS-CoV-2抗体与固定ELISA板的SARS-CoV-2抗原物质结合，通过洗板除去非结合物，再加入酶标记的二抗。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中抗体的含量，并进行定性分析。
3. 试剂
SARS-CoV-2蛋白（重组S蛋白RS，重组NP蛋白RN），合成多肽P1-P12混合物（PM）或P5和P8的混合物P58（序列如SEQ ID No.1~12所示）
12条多肽序列见表1：
表1
SEQ ID No.
编号
多肽序列
3
P1
NQDVNLHSSRLS
4
P2
YKTFPPTEPKKD
5
P3
QALPQRQKKQQT
6
P4
TVTLLPAADLDDF
1
P5
QLPQGTTLPKGFYA
7
P6
GGSQASSRSSSR
8
P7
IRQGTDYKHWPQ
2
P8
SFYVYSRVKNLNSSRV
9
P9
KEITVATSRTLS
10
P10
AIPTNFTISVTTEI
11
P11
PIGAGICASYQT
12
P12
QYGSFCTQLNRA
HRP标记的抗猴IgG，IgM，抗人IgG，抗小鼠IgG
PBS（PH=7.4）
Tween-20
BSA组分5
TMB单组份显色液
4. 实验步骤（在BSL-2实验室进行）：
1)用SARS-CoV-2抗原物质包被酶标板，每孔100μL（0.1ug蛋白），4℃过夜。第二天用洗液洗涤3次，然后用1%BSA封闭1小时，每孔200μL。
2)待检血清1:100稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30分钟，用洗液充分洗涤5次，每次1-2分钟，在吸水纸上拍干孔内残液。
3)加入HRP二抗：酶结合物用酶结合物稀释液稀释至工作浓度，每孔100μL；置37℃孵育 30分钟；用洗涤液洗5次，每次1-2分钟，拍干。
4)每孔加入100μLTMB底物液显色，37℃孵育5分钟，至阳性对照OD600大于0.6。
5)最后加入终止液2M的H2SO4 50μL。在450nm波长下测定OD值。
5. 结果判定
Cut off 值=阴性对照扣除空白孔数据的平均值+0.15。
效果例1 12条多肽等摩尔混合物PM与重组抗原RN、RS的抗原性无差异
SARS-CoV-2感染小鼠与不同抗原物质的反应性：
小鼠样品共8份，其中无感染样品2份（C1，C2），感染样品6份（P1-P6）。
如图2、图3所示。小鼠感染（P1-P6）与非感染（C1、C2）血清1：100稀释，分别与重组SARS-CoV-2 NP蛋白（RN）、重组SARS-CoV-2 S蛋白（RS）、SARS-CoV-2 多表位多肽P1-P12的混合物PM的ELISA反应。空白对照（B1）。
数据分析：混合肽PM作为抗原物质测定小鼠阴性血清C1和C2分组为PM-C，混合肽PM作为抗原物质测定小鼠阳性性血清P1-P6分组为PM-P；重组抗原物质RN测定小鼠阴性血清C1和C2分组为RN-C，重组抗原物质RN测定小鼠阳性性血清P1-P6分组为RN-P，重组抗原物质RS测定小鼠阴性血清C1和C2分组为RS-C，重组抗原物质RS测定小鼠阳性性血清P1-P6分组为RS-P。三种抗原物质与阴性血清样品进行比较，光吸收无统计学差异（t-test，P＞0.05）；，三种抗原物质与阳性血清样品进行比较光吸收无统计学差异（t-test，P＞0.05）。各抗原物质与阳性样品和阴性样本的反应差异明显。
感染猴血清与不同抗原物质的反应性：
猴：无感染样品1份（C1），感染测定IgG样品2份（P1，P2）。
如图4、图5所示：猴感染（P1、P2）与非感染（C1）血清1：100稀释，分别与重组SARS-CoV-2 NP蛋白（RN）、重组SARS-CoV-2 S蛋白（RS）、SARS-CoV-2 多表位多肽P1-P12的混合物PM的ELISA反应。空白对照（B1）。
数据分析：混合肽PM作为抗原物质测定猴阴性血清C1分组为PM-C，混合肽PM作为抗原物质测定猴阳性性血清P1，P2分组为PM-P；重组抗原物质RN测定猴阴性血清C1分组为RN-C，重组抗原物质RN测定猴阳性性血清P1，P2分组为RN-P，重组抗原物质RS测定猴阴性血清C1分组为RS-C，重组抗原物质RS测定猴阳性性血清P1，P2分组为RS-P。混合肽PM作为抗原物质测定猴阴性血清（PM-C），和其他重组抗原相比，光吸收低；混合肽PM作为抗原物质测定猴阳性血清（PM-P），和其他重组抗原相比，光吸收无统计学差异（t-test，P＞0.05）。用混合肽PM做抗原进行血清抗体检测，其阳性样品判定临界值显著降低，表明多肽抗原的特异性较强。
患者血清与不同抗原物质的反应性：
如图6、图7所示：COVID-19患者（P1、P2）与非感染人（C1）血清1：100稀释，分别与重组SARS-CoV-2 NP蛋白（RN）、重组SARS-CoV-2 S蛋白（RS）、SARS-CoV-2 多表位多肽P1-P12的混合物的ELISA反应。空白对照（B1）。
数据分析：混合肽PM作为抗原物质测定人阴性血清C1分组为PM-C，混合肽PM作为抗原物质PM测定人阳性性血清P1，P2分组为PM-P；重组抗原物质RN测定人阴性血清C1分组为RN-C，重组抗原物质RN测定人阳性性血清P1，P2分组为RN-P，重组抗原物质RS测定人阴性血清C1分组为RS-C，重组抗原物质RS测定人阳性性血清P1，P2分组为RS-P。混合肽PM作为抗原物质测定人阴性血清（PM-C），人阳性血清（PM-P），和其他重组抗原相比，光吸收无统计学差异（t-test，P＞0.05）。表明人阴性血清可能有较高的交叉反应性，或背景性免疫反应。使用上述3种抗原进行检测结果不特异。
综合上述，结果分析如下：
（1）比较SARS-CoV-2 多表位多肽混合物PM与重组SARS-CoV-2 NP蛋白（RN）和重组SARS-CoV-2 S蛋白（RS）的抗原性，在人、猴、和小鼠的反应性上一致。
（2）人的一份阴性对照血清在三种抗原上均有较高反应值，提示其可能有非特异性反应，如存在其他冠状病毒感染。
（3）猴的一份阴性血清在多肽抗原PM上的反应值低于重组抗原，提示多肽抗原的特异性优于重组抗原。
效果例2 多肽P5和Ｐ8具有较好的特异性
进一步从12条多肽中筛选特异性较高的多肽。
无SARS-CoV-2感染人血清与不同多肽抗原的反应性：
如图8所示。5份无SARS-CoV-2感染人血清（H1-H5）血清1：100稀释，分别SARS-CoV-2 多表位多肽P1-P12的ELISA反应。空白对照（B1），COVID-19患者（P1），C0为SPF小鼠血清样品。
结果分析：
（1）所有多肽均有良好的抗原性
（2）P1，P4等多肽和人血清H1-H5有一定的反应性，特异性低
（3）P5，P8两个多肽和人血清H1-H5的反应性低，特异性高
P5和P8多肽抗原用于后续检测技术开发。
效果例3 多肽混合物P58（P5与P8的等摩尔混合多肽）抗原的反应性
如图9、10所示。测定3份COVID-19患者（P1、P2、P3）与非感染人（C1、C2、C3）血清的反应测定IgG，血清1：400稀释，二抗1：5000稀释。空白对照为B1，B2。
数据分析：多肽P5和P8的混合抗原P58肽作为抗原物质测定人阴性血清分组为P58-C，多肽P5和P8的混合抗原P58肽作为抗原物质测定人阳性血清分组为P58-P。2组样品的光吸收值有统计学差异（t-test，P＜0.05）。
多肽P5和P8的混合物抗原P58可以作为COVID-19患者的IgG抗体的检测试剂进行开发。
效果例4 基于猴早期感染样品IgM的分析
无感染猴血清样品7份（C1-C7），新冠病毒感染早期猴血清样品8份（P1-P8）。
如图11、12所示。猴感染SARS-CoV-2早期（5-7天）在以P58为抗原物质的血清IgM抗体检测体系中的反应。注：猴SARS-CoV-2感染5-7天血清8份P1-P8；无感染血清7份C1-C7，空白对照B1。
数据分析：多肽P5和P8的混合抗原P58肽作为抗原物质测定猴阴性血清分组为P58-C，与猴阳性血清测定的数据分组为P58-P。（2组的光吸收有统计学差异（t-test，P＜0.05）。
结果分析：多肽P5和P8的混合物抗原P58可以检测猴早期感染的IgM抗体，基于此可进行人类早期感染患者IgM的试剂开发。
效果例5 正常人群多样品的测试与判定方法的设定及检测方法敏感性特异性的初步评价
随机选取10份人阴性血清进行测试，如图13所示：
阴性样品（分组为P58-C）扣除反应背景（空白孔数值）后，平均数值为0.213，标准差为0.048；
用阴性均值+3SD确定阳性样品判定临界值，阳性样品判定临界值=0.213+3×0.048=0.359；
阳性样品（分组为P58-P）3个新冠感染者的血清样品的6份测试数据（复孔重复）均高于阳性样品判定临界值；
混合此10份阴性样品制备阴性对照样品用于检测值判定，采用阴性值测量均值+0.15（多次测试的经验值）作为抗体检测阳性样品判定临界值。
扩大阴性样品比例进行测定，结果如图14所示：
阳性样本分组为P58-P，30份健康人群样品分组为P58-N，阴性对照的3次测量值分组为P58-C。
阴性对照均值为0.117，阳性样品判定临界值为0.267。
阳性样品测定值均高于阳性样品判定临界值。在此次实验中测试患者样品3份（复孔重复），检测SARS-CoV-2抗体，皆为阳性，敏感性为3/3=100%。
测定健康人群样品30份，30份无新型冠状病毒接触史健康人血清测试，29份结果均在阳性样品判定临界值以下，判定为阴性，1份测定值为0.286，未作阴性判定。检测SARS-CoV-2抗体，皆为阴性，特异性为29/30=96.7%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所；盛世东唐江苏生物科技有限公司
<120> 检测新型冠状病毒的多肽或其组合
<130> MP2006091
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Gln Asp Val Asn Leu His Ser Ser Arg Leu Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala
1 5 10