阅读说明：本技术 一种从红豆杉干废料中提取红豆杉多糖的制备方法及应用 (Preparation method and application for extracting taxus chinensis polysaccharide from dry taxus chinensis waste ) 是由 李晓 于 2019-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有降肌酐、提高内生肌酐清除率作用的红豆杉多糖的制备方法及应用,具体的红豆杉多糖的制备方法包括以下步骤：A)预处理；B)水提醇沉；C)洗涤；D)去蛋白；E)透析；F)冷冻干燥。并且公开了使用该方法制备得到的红豆杉多糖在降肌酐和/或提高内生肌酐清除率方面的应用,以及公开了使用该方法制备得到的红豆杉多糖而制备得到的降肌酐和/或提高内生肌酐清除率的药剂。本发明提取红豆杉多糖成本低,提取率以及纯度高,得到的红豆杉多糖具有降肌酐、提高内生肌酐清除率的功效。(The invention discloses a preparation method and application of taxus chinensis polysaccharide with the effects of reducing creatinine and improving endogenous creatinine clearance rate, and the specific preparation method of the taxus chinensis polysaccharide comprises the following steps: A) pre-treating; B) water extraction and alcohol precipitation; C) washing; D) deproteinizing; E) dialyzing; F) and (5) freeze drying. The application of the taxus chinensis polysaccharide prepared by the method in reducing creatinine and/or improving the clearance rate of endogenous creatinine is also disclosed, and the medicament prepared by the taxus chinensis polysaccharide prepared by the method for reducing creatinine and/or improving the clearance rate of endogenous creatinine is also disclosed. The method for extracting the taxus chinensis polysaccharide has low cost and high extraction rate and purity, and the obtained taxus chinensis polysaccharide has the effects of reducing creatinine and improving the clearance rate of endogenous creatinine.)

一种从红豆杉干废料中提取红豆杉多糖的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种从红豆杉干废料中提取红豆杉多糖的制备方法及应用。

背景技术

慢性肾脏病(CKD)具有患病率高、预后差和医疗费用高的特点，现已成为危害人类健康的重要疾病。慢性肾功能衰竭(CRF)别称慢性肾功能不全，是CKD发展到后期的一种临床综合征，并发症多，严重影响患者的生活质量和寿命。

以往的西医经典的诊断标准按其发病阶段分为四期：肾功能不全代偿期(第1期)内生肌酐清除率:80～51ml/min,血肌酐133～177μmol/L。临床上无症状。肾功能不全失代偿期(第2期)肌酐清除率50～22ml/min,血肌酐186～442μmol/L。可有多尿、夜尿,并有轻度贫血,但无明显症状。肾衰竭期(第3期)内生肌酐清除率20～10ml/min,血肌451～707μmol/L。贫血明显,常有夜尿等张尿,水电解质紊乱,轻或中度代谢性酸中毒,水钠潴留,低钙高磷,一般无高钾,可有胃肠道、心血管和中枢神经症状。尿毒症期(第4期)内生肌酐清除率<10ml/min,血肌酐>707μmol/L。出现严重的各系统症状,尤其胃肠道、心血管和神经系统症状明显,水电解质严重失衡,有明显的代谢性酸中毒。

红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物，据《中国植物志》^[1]记载，我国红豆杉可分为4种1变种，分别为西藏红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉与南方红豆杉。南方红豆杉产于中国长江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下的地方，湖北省钟祥、恩施、十堰等地有大规模的人工繁育种植林。红豆杉又名紫杉，《中华本草》^[2]、《中药大辞典》^[3]中记载红豆杉“利水消肿，主治肾炎浮肿，小便不利”；《浙江省中药饮片炮制规范》^[4]对南方红豆杉的性味归经及功能主治进行了记载：“其微甘、苦、平，归肾、心经”，具有消肿散结、通经利尿的功效，临床上可用于癥瘕积聚，水肿，小便不利，风湿痹痛等。中药治疗慢性肾功能衰竭又以水煎为主，经研究发现红豆杉除可以提取抗癌药物紫杉醇外，其水煎剂的主要成分为红豆杉多糖，故本发明正好立足于这一点，有效利用在工业上已经提取完紫杉醇和10-DABⅢ后的红豆杉枝叶为原料，提取红豆杉多糖，并做纯化处理，不仅节约资源，而且进一步挖掘红豆杉多糖的药用价值，以期实现珍稀红豆杉植物资源的合理以及最大化的有效应用，为人类医药健康领域资源的开发提供更多可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种红豆杉多糖及其制备方法，实现其在制备治疗各种原因造成的血肌酐升高、内生肌酐清除率降低的药物，例如：治疗慢性肾病、慢性肾功能衰竭等的药物中的应用。

本发明提供的一种红豆杉多糖的制备方法，其包括以下步骤：

A)预处理

取已经提取完紫杉醇和10-DABⅢ之后的红豆杉干废料，粉碎，加乙醇，进行索氏提取，过滤收集药渣备用。

B)水提醇沉

步骤A)中所述药渣加入适量纯化水，搅拌至药渣被水浸透，索氏提取，滤过，减压浓缩；浓缩液加入乙醇，低温静置，滤过得到提取物。

C)洗涤

步骤B)中所得提取物依次缓慢滴加无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，干燥后得粗品。

D)去蛋白

步骤C)中所得粗品溶解于适量热水中，以Sevage法去蛋白，得到去除蛋白后的多糖溶液。

E)透析

步骤D)中所得多糖溶液，采用流水透析法去除溶液中小分子物质。

F)冷冻干燥

步骤E)中透析后的溶液减压浓缩，预冷冻后冷冻干燥，得到红豆杉粗多糖。

优选的，所述步骤A)中加入80％乙醇索氏提取的料液比为1:10。

本案在水提醇沉前先用80％乙醇预处理红豆杉粉末，目的是为了去除药材中残存的脂溶性化合物以及部分单糖，这样可以提高步骤B药材多糖提取效率，增加收得率并且提高红豆多糖的纯度。乙醇索氏提取的料液比会影响到除杂的程度，本发明经过多次尝试，优选80％乙醇索氏提取的料液比为1:10时具有好的除杂效率，并且成本最低。

步骤B)进行两次水提取，第一次加入纯化水料液比为1:10，第二次加入纯化水料液比为1:8，步骤B)中减压浓缩至生药浓度为1.0g/mL；浓缩液加入3-6倍体积乙醇，乙醇浓度95％，低温静置的温度为2-8℃，静置时间15-36h。

水提醇沉是目前药材多糖提取最常用的方法，方法大同小异，但是对提取工艺却存在较大差异，在保持提取率的情况下提高生产效率、降低成本，本发明进行两次水提取，第一次加入纯化水料液比为1:10，第二次加入纯化水料液比为1:8，通过两次水提，并通过递减的方法，提高物料占比，进而提高提取效率。

本发明进一步的通过减压浓缩至生药浓度为1.0g/mL，本案发现，在此浓度的情况下，能够有效的降低醇的用量，因此，在醇沉的情况下，仅仅只需要浓缩液加入3-6倍体积乙醇。

为了保证洗涤步骤能有效去除杂质减少洗涤时多糖损失，发明人通过观察洗涤过程洗涤液颜色变化以及洗涤液中多糖含量测试的方法，来考察最佳洗涤方法，确认洗涤工艺。

最终确定的洗涤方法为加入无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，并且保证的体积都是南方红豆杉投料质量的0.05-0.2倍，优选为0.1倍。

在步骤D)的去蛋白质中，具体步骤为：所得粗品溶解于适量热水中，以Sevage法加入1倍体积的正丁醇/氯仿，体积比为1:4，混合液，搅拌30分钟后离心。

步骤E)中透析法使用的透析袋截留分子量8000-14000。

本发明提供了一种红豆杉多糖制备得到用于降肌酐和/或提高内生肌酐清除率的药剂，制备药剂的辅料包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂和表面活性剂中的一种或多种。

药剂中红豆杉多糖的活性成分含量在1％-99.5％。

药剂的剂型为医学上可接受的各种剂型，药剂的剂型包括：灌肠剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、搽剂、霜剂、喷雾剂、粉雾剂、气雾剂、滴剂、锭剂、贴剂。

本发明具体提供了一种红豆杉多糖的制备方法得到的红豆杉多糖制备治疗慢性肾病、慢性肾功能衰竭的药物。

用于治疗慢性肾病、慢性肾功能衰竭的药物，药物的剂型为医学上可接受的各种制剂。优选药剂的剂型包括：灌肠剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、搽剂、霜剂、喷雾剂、粉雾剂、气雾剂、滴剂、锭剂、贴剂。

本发明利用已经提取完紫杉醇和10-DABⅢ之后的红豆杉干废料作为提取红豆杉多糖的原料，能够根据原料的不同，大幅度的降低成本，如减少使用了提取原料，同时增加了红豆杉的利用率，并且通过工艺的设置提高了红豆杉多糖的提取率以及纯度，同时验证了提取得到的红豆杉多糖无毒性。

本发明发现了红豆杉多糖有降肌酐，提高内生肌酐清除率的功效，并制备出了相应的制剂，并验证了用红豆杉多糖为活性成分制成的药物在慢性肾功能衰竭大鼠动物试验中，显示出红豆杉多糖优异的降肌酐及提高内生肌酐清除率的效果。

具体实施方式

为更好地了解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定。

实施例1南方红豆杉总多糖制备工艺预处理方法探索

发明人在水提醇沉前先用80％乙醇预处理红豆杉粉末，目的是为了去除药材中残存的脂溶性化合物以及部分单糖，这样可以提高步骤B药材多糖提取效率，增加收得率。发明人分别对比四种料液比1:5、1:10、1:15、1:20，发现料液比为1:5时，除杂不完全，而料液比为1:15和1:20虽然效果非常好，但是会提高生产成本，所以优选料液比为1:10。实施例2南方红豆杉总多糖制备工艺水提醇沉方法探索

水提醇沉是目前药材多糖提取最常用的方法，方法大同小异，但是对提取工艺却需要试验验证，在保持提取率的情况下提高生产效率、降低成本。发明人采用料液比1：5、1:8、1:10、1:15以及提取1、2、3次，以提取物提取率为参考标准，对提取工艺进行探索，确认最佳提取工艺：提取两次，第一次料液比为1:10，第二次为1:8。

实施例3南方红豆杉总多糖制备工艺洗涤方法探索

为了保证洗涤步骤能有效去除杂质减少洗涤时多糖损失，发明人通过观察洗涤过程洗涤液颜色变化以及洗涤液中多糖含量测试的方法，来考察最佳洗涤方法，确认了洗涤工艺：加入无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯的体积都是南方红豆杉投料量的0.1倍(质量/体积)。

实施例4南方红豆杉总多糖制备工艺透析袋的选择

透析袋孔径决定了多糖分子量，多糖分子量决定了其药效。发明人在查阅大量文献，并通过不同分子量红豆杉多糖的动物试验，发现透析袋截留分子量为8000-14000时，其药效和提取率最合适。

实施例5南方红豆杉多糖制备

取南方红豆杉粉末1kg，加80％乙醇10L，浸泡1h后，80℃索氏提取2小时，过滤收集药渣。药渣先加入10L纯化水，搅拌至药渣被水浸透，80℃索氏提取2h，滤过，残渣再加8L水重复提取一次，合并两次提取液，过滤，减压浓缩至生药浓度为1g/mL；浓缩液加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置24小时，滤过得到提取物。所得提取物依次缓慢依次滴加100mL无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，干燥后得红豆杉多糖粗品。所得粗品溶解于适量热水中，以Sevage法加入1倍体积的正丁醇/氯仿，体积比为1:4，混合液，搅拌30分钟后离心，取上层水液；重复上述操作3次，得到去除蛋白后的多糖溶液。所得多糖溶液装入截留分子量为8000-14000的透析带中，采用流水透析法72小时去除溶液中小分子物质。透析后的溶液减压浓缩至生药浓度3.0g/mL，预冷冻后冷冻干燥，得到红豆杉粗多糖。

对比例1南方红豆杉多糖制备

取南方红豆杉粉末1kg，加80％乙醇10L，浸泡1h后，80℃索氏提取2小时，过滤收集药渣。药渣先加入10L纯化水，搅拌至药渣被水浸透，80℃索氏提取2h，滤过，残渣再加8L水重复提取一次，合并两次提取液，过滤，减压浓缩至生药浓度为1g/mL；浓缩液加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置24小时，滤过得到提取物。所得提取物依次缓慢依次滴加100mL无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，干燥后得红豆杉多糖粗品。。所得粗品溶解于适量热水中，加入1倍体积的正丁醇/石油醚，体积比为1:4，混合液，搅拌30分钟后离心，取上层水液；重复上述操作3次，得到去除蛋白后的多糖溶液。所得多糖溶液装入截留分子量为8000-14000的透析带中，采用流水透析法72小时去除溶液中小分子物质。透析后的溶液减压浓缩至生药浓度3.0g/mL，预冷冻后冷冻干燥，得到红豆杉粗多糖。

在后续的测试过程中，本发明的测试结果与对比例1得到的红豆杉多糖的效果类似，并且具有更高的提取率，得到的多糖具有良好的降肌酐及提高内生肌酐清除率的效果，有利于恢复肾功能。本发明在制备过程中，根据原料已经经过提纯处理，从而相应的减少Sevage的操作，从工艺上能够节约原料成本，并且提取得到的产品的性能与有该操作的性能效果类似。