一种金钗石斛多糖、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种金钗石斛多糖、其制备方法及应用 (Dendrobium nobile polysaccharide, preparation method and application thereof ) 是由 宋宝安 李洙锐 石晶 陈泠竹 何方成 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种金钗石斛多糖、其制备方法及应用,其平均分子量范围为2.56×10<Sup>3</Sup>--1.39×10<Sup>7 </Sup>Da,用100℃沸水对干金钗石斛进行提取,然后将提取物进行微波干燥得粗糖；将粗糖溶解至水中,悬浮,萃取,向水层加入Saveg试剂,混合均匀,振荡；离心,收集上清液。向上清液中加入乙醇使其终体积浓度至90%,过夜沉淀,离心,收集沉淀,用水进行溶解,在蒸馏水中透析72 h；加入活性炭,将该多糖溶液加热至80℃,加热20 min后,冷却至60℃后,过滤除去活性炭残渣,向多糖溶液中加入无水乙醇使乙醇的终体积浓度为90%,过夜沉淀,离心,冷冻干燥得金钗石斛多糖。本发明能防治烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病和马铃薯Y病毒病,且制备方法简单。(The invention discloses dendrobium nobile polysaccharide, a preparation method and application thereof, wherein the average molecular weight range of the dendrobium nobile polysaccharide is 2.56 × 10 3 ‑‑1.39×10 7 Da, extracting the dried dendrobium nobile with boiling water at 100 ℃, and then drying the extract by microwave to obtain crude sugar; dissolving the crude sugar in water, suspending, extracting, adding a Saveg reagent into a water layer, uniformly mixing, and oscillating; centrifuging and collecting supernatant. Adding ethanol into the supernatant to make the final volume concentration reach 90%, precipitating overnight, centrifuging, collecting precipitate, dissolving with water, and dialyzing in distilled water for 72 hr; adding activated carbon, heating the polysaccharide solution to 80 deg.C, heating for 20min, cooling to 60 deg.C, filtering to remove activated carbon residue, adding anhydrous ethanol into polysaccharide solution to make ethanol final volume concentration of 90%, precipitating overnight, centrifuging, and freeze drying to obtain the final productDendron polysaccharide. The invention can prevent and treat tobacco mosaic virus disease, cucumber mosaic virus disease and potato virus Y disease, and the preparation method is simple.)
技术领域
本发明涉及农药技术领域，具体来说涉及一种金钗石斛多糖，同时还涉及该金钗石斛多糖的制备方法，以及该金钗石斛多糖在防治烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病和马铃薯Y病毒病中的应用。
背景技术
植物病毒病是对植物危害最严重的病害，其中烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和黄瓜花叶病毒(CMV)是几种危害最严重的病毒。它们的寄主非常广泛，例如马铃薯、黄瓜、烟草、辣椒等其他经济作物。这三种病害的泛滥给农业造成了严重的损失。目前，合成农药依然是防控植物病害的主要方法，而高毒、高污染和高残留的农药的使用给环境和人类的健康带来了极大的危害，如盐酸吗啉胍对心肌细胞有一定的毒性，并且使有丝分裂指数降低，微核率和染色体畸变率升高。因此从自然界中寻找高效、低毒、环境友好具有抗病毒活性的物质已成为我国植物保护领域一个亟待解决的问题。
多糖是一种重要的大分子物质，具有广泛的生物活性，例如增强免疫、降血压、抗氧化性、抗病毒、抗癌和抗衰老等。因此多糖在医药和农药领域具有广阔的发展前景，是目前研究的一个热点。金钗石斛是一种兰科属植物，是珍贵的中药材，很早就被《中国药典》收录。在中国金钗石斛主要分布在贵州、四川、广西和云南，其中贵州赤水的金钗石斛因其优良的品质最为著名。近几十年，贵州赤水金钗石斛种植规模已近4467公顷，占国内种植面积90％，每年都有大量的金钗石斛及其产品被源源不断的销售到世界各地。目前，已经有文献对金钗石斛多糖进行报道，主要集中在其医药领域的活性，包括增强免疫、抗肿瘤和抗氧化等活性。然而，对其农药领域的活性却未见报道。
发明内容
本发明目的在于克服上述缺点而提供的一种能防治烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病和马铃薯Y病毒病，且制备方法简单的金钗石斛多糖。
本发明的另一目的在于提供该金钗石斛多糖的制备方法。
本发明的再一目的是提供该金钗石斛多糖在防治烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病和马铃薯Y病毒病中的应用。
本发明的一种金钗石斛多糖，其平均分子量范围为2.56×103--1.39×107Da。
本发明的一种金钗石斛多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将新鲜金钗石斛的水分烘干，用100℃沸水对干燥的金钗石斛进行提取，按水/金钗石斛＝10/1(V/W)的比例提取3h，重复提取三次，然后将提取物进行微波干燥，获得金钗石斛粗糖；
(2)将400g金钗石斛粗糖溶解至水中，用1000mL蒸馏水悬浮，然后用 4L乙酸乙酯萃取三次；再用3L正丁醇萃取三次，收集水层，向水层以1/5(V/V) 的比例加入Saveg试剂(氯仿：正丁醇＝4：1，v/v)，混合均匀，2500rpm，振荡30min，以6000rpm离心15min，收集上清液。向上清液中加入乙醇，使其终浓度达至90％(V/V)，在4℃下过夜沉淀，离心，收集沉淀，用100--400mL 的水进行溶解，然后装入到3500Da透析袋中，在蒸馏水中透析72h；
(3)加入0.1％(m/V)活性炭，将该多糖溶液加热至80℃，加热20min 后，冷却至60℃后，过滤除去活性炭残渣，向多糖溶液中加入无水乙醇，使乙醇的终体积浓度为90％，在4℃下过夜沉淀，用6000rpm离心15min，将沉淀的多糖冷冻干燥，获得金钗石斛多糖。
本发明的一种金钗石斛多糖在防治烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病和马铃薯Y病毒病中的应用。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明的金钗石斛多糖组合物，原料易得，制备方法简单。通过试验证明具有明显的抗烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的组合物活性，且无毒无残留、环境友好。
通过以下
具体实施方式
进一步说明本发明的有益效果。
具体实施方式
实施例1：
一种金钗石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
将新鲜金钗石斛的水分烘干，用100℃沸水对干燥的金钗石斛进行提取，按水/金钗石斛＝10/1(V/W)的比例提取3h，重复提取三次。然后将提取物进行微波干燥，获得金钗石斛粗糖。将400g金钗石斛粗糖溶解至水中，用1000mL 蒸馏水悬浮，然后用4L乙酸乙酯萃取三次；再用3L正丁醇萃取三次，收集水层，向水层以1/5(V/V)的比例加入Saveg试剂(氯仿：正丁醇＝4：1，v/v)，混合均匀，2500rpm，振荡30min，以6000rpm离心15min，收集上清液。向上清液中加入乙醇，使其终浓度达至90％(V/V)，在4℃下过夜沉淀，离心，收集沉淀，用一定量的水进行溶解，然后装入到3500Da透析袋中，在蒸馏水中透析72h。加入0.1％(m/V)活性炭，接着将多糖溶液加热至80℃，加热20min 后，冷却至60℃后，过滤除去活性炭残渣。向多糖溶液中加入无水乙醇，使乙醇的终体积浓度为90％，在4℃下过夜沉淀，用6000rpm离心15min，将沉淀的多糖冷冻干燥，获得金钗石斛精制粗多糖。
实施例2：
一种金钗石斛多糖E1的制备方法：
将66.69g金钗石多糖溶于蒸馏水中，过0.45μm滤膜，用阴离子交换柱(二乙氨基乙基纤维素)(7cm×23cm)对金钗石斛多糖分离，洗脱液为H2O，获得E1。
实施例3：
一种金钗石斛多糖E2的制备方法：
按实施例2中操作完成后，将洗脱液改为0.05M NaCl，浓缩，用3500Da 透析袋进行透析，冷冻干燥，获得E2。
实施例4：
一种金钗石斛多糖E3的制备方法：
按实施例3中操作完成后，将洗脱液改为0.1M NaCl，浓缩，用3500Da 透析袋进行透析，冷冻干燥，获得E3。
实施例5：
一种金钗石斛多糖E4的制备方法：
按实施例4中操作完成后，将洗脱液改为0.2M NaCl，浓缩，用3500Da 透析袋进行透析，冷冻干燥，获得E4。
实施例6：
一种金钗石斛多糖E5的制备方法：
按实施例5中操作完成后，将洗脱液改为0.3M NaCl，浓缩，用3500Da 透析袋进行透析，冷冻干燥，获得E5。
实施例7：
一种金钗石斛多糖E6的制备方法：
按实施例6中操作完成后，将洗脱液改为0.5M NaCl，浓缩，用3500Da 透析袋进行透析，冷冻干燥，获得E6。
实施例8：
一种金钗石斛多糖DNPE4(1)的制备方法：
将E4溶于蒸馏水中，过0.45μm滤膜，依次用Sephacryl S-200柱(1.7cm×150 cm)和Sephadex G-100(2.0cm×80cm)进行分离纯化。所用凝胶过滤色谱分离过程均有示差检测器和苯酚–—硫酸法进行监测，获得DNPE4(1)。
实施例9：
一种金钗石斛多糖DNPE4(2)的制备方法：
同实施例8的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE4(2)。
实施例10：
一种金钗石斛多糖DNPE4(3)的制备方法：
同实施例8的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE4(3)。
实施例11：
一种金钗石斛多糖DNPE4(4)的制备方法：
同实施例8的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE4(4)。
实施例12：
一种金钗石斛多糖DNPE4(5)的制备方法：
同实施例8的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE4(5)。
实施例13：
一种金钗石斛多糖DNPE4(7)的制备方法：
同实施例8的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE4(7)。
实施例14：
一种金钗石斛多糖DNPE4(9)的制备方法：
同实施例8的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE4(9)。
实施例15：
一种金钗石斛多糖DNPE6(1)的制备方法：
将E6溶于蒸馏水中，过0.45μm滤膜，依次用Sephacryl S-200柱(1.7cm×150 cm)和Sephadex G-100(2.0cm×80cm)进行分离纯化。所用凝胶过滤色谱分离过程均有示差检测器和苯酚–—硫酸法进行监测，获得DNPE6(1)。
实施例16：
一种金钗石斛多糖DNPE6(2)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(2)。
实施例17：
一种金钗石斛多糖DNPE6(3)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(3)。
实施例18：
一种金钗石斛多糖DNPE6(4)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(4)。
实施例19：
一种金钗石斛多糖DNPE6(5)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(5)。
实施例20：
一种金钗石斛多糖DNPE6(6)的制备方法：
实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(6)。
实施例21：
一种金钗石斛多糖DNPE6(7)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(7)。
实施例22：
一种金钗石斛多糖DNPE6(8)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(8)。
实施例23：
一种金钗石斛多糖DNPE6(9)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(9)。
实施例24：
一种金钗石斛多糖DNPE6(11)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(11)。
实施例25：
一种金钗石斛多糖DNPE6(12)的制备方法：
同实施例15的操作，根据苯酚——硫酸法绘制的色谱图，收集不同信号峰的流分，获得DNPE6(12)。
试验例1：金钗石斛多糖定性测定：
1、金钗石斛多糖分子量测定
精密称取实施例1-25制得的金钗石斛多糖1mg，用0.1M NaNO3溶液溶解至终浓度为1mg/mL，经0.45μm的微孔滤膜过滤后备用。
将不同分子量的葡聚糖标准品(Mw＝70，130，175，300，256，580kDa) 分别配制成5mg/ml溶液，经0.45μm的微孔滤膜过滤后备用。
分别将标准品和金钗石斛多糖样品用超高效液相进行检测，色谱柱为Ultrahydrogel 250柱子(7.8×300mm)，柱温为30℃，流动相为0.1M NaNO3，流速为0.6mL/min，进样量为20μL，葡聚糖标准样品按由小分子到大分子依次进样，记录各标准品相应的保留时间，以保留时间为横坐标，以分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线计算出金钗石斛多糖的分子量范围。结果如表1所示。
表1金钗石斛多糖的分子量范围
2、金钗石斛活性多糖单糖组成分析
(1)实验步骤：在100℃条件下，用2M三氟乙酸对多糖水解6h。移除过量的三氟乙酸后，用0.3mL TriSil试剂(吡啶:六甲基二硅胺烷:三甲基氯硅烷＝10：2：1(V:V:V))对多糖水解产物进行硅醚化，反应条件是80℃水浴加热1h，反应完成后用氮气将多余的试剂吹干，用1mL正己烷定容，最后用GC-MS/MS检测。
(2)实验结果如表2所示：
表2多糖的单糖组成
3、均一性金钗石斛多糖单糖连接分析
(1)实验步骤：取3mg多糖样品，向其中加入1.5mL干燥的DMSO，充入Ar保护，50℃条件下膨胀8h。然后向反应体系中加入>10mg的NaOH粉末 (在红外灯下快速研磨)，Ar保护下超声90min。冰浴条件下，向反应体体系中缓慢加入0.5mL碘化钾，避光超声反应30min，重复操作3次。然后向反应体系中加入2mL水猝灭反应，用CH2Cl2萃取三次，收集CH2Cl2层，再用10％的Na2S2O3洗涤三次，45℃下减压蒸干，完成糖的全甲基化反应。接着在2mL 90％甲酸70℃下反应3h，对甲基化的多糖进行解旋。再用2mL 2M的TFA对甲基化多糖进行水解，温度为100℃，反应时间为3h，反复加入甲醇进行减压蒸馏除去多余的TFA。在水反应体系中，加入40mg NaBH4室温反应2h，用冰醋酸除去多余的NaBH4，减压蒸干，在100℃将样品烘烤10min至干。用3mL 吡啶：乙酸酐(V/V＝1:1)对不完全甲基化的糖醇进行乙酰化，100℃反应1h 制备相应的部分甲基化的糖醇乙酸酯，反应完成后加入3mL水，用CH2Cl2萃取反应产物，收集CH2Cl2层，减压蒸馏至干，用1mL CH2Cl2定容，用GC-MS 检测。
(2)实验结果：
表3 DNPE4(2)的甲基化数据
表4 DNPE4(4)的甲基化数据
表5 DNPE4(7)的甲基化数据
表6 DNPE6(4)的甲基化数据
表7 DNPE6(5)的甲基化数据
表8 DNPE6(6)的甲基化数据
表9 DNPE6(7)的甲基化数据
表10 DNPE6(8)的甲基化数据
表11 DNPE6(9)的甲基化数据
表12 DNPE6(11)的甲基化数据
所述均一性金钗石斛多糖中单糖的连接方式见表3--12。
4、金钗石斛多糖高碘酸氧化——Smith降解
(1)NaIO4标准曲线的制备
取6支干燥的试管，按下表操作：
横坐标为NaIO4的浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。
(2)样品制备
称取5mg多糖样品，用少量水溶解，加入30mM NaIO4溶液，定容至5mL，置于暗处，室温下进行反应，于0，6，12，24，36，48…小时间隔取样0.02mL，用蒸馏水稀释至5mL后，用754紫外分光光度剂在223处测定吸光度。至吸光度达一稳定值时，由此吸光度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。加0.2mL 乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。取2mL上述反应溶液，用酚酞作为显示剂，0.01M NaOH滴定甲酸的生成量。剩余进行Smith降解。
(3)Smith降解
在高碘酸氧化的基础上进行smith降解。在smith降解反应完成后，加入过量的NaBH4还原24h，然后用冰醋酸除去多余的NaBH4，减压蒸干。用1M TFA 对NaBH4还原物进行酸水解，反应时间为2h。向反应体系中不断加入甲醇减压蒸馏，以除去过量的TFA。然后加入一定量的水溶解样品，用NaOH将体系调至中性或碱性，减压蒸馏除去水，最后冷冻干燥的糖。
(4)按照试验例1中3中步骤对Smith降解的产物进行甲基化分析。
(5)实验结果：
表13 DNPE4和DNPE6的高碘酸氧化的数据
金钗石斛多糖高碘酸氧化——Smith降解的结果见表13，该结果中不同糖苷的连接方式所占比例与甲基化分析数据吻合。
5、金钗石斛多糖的红外表征
(1)实验步骤：取少量的多糖与KBr粉末进行研磨，然后压制成片。用傅里叶变换红外光谱仪对这些多糖进行表征，扫描范围为4000--500cm-1。
(2)实验结果：E1、E2、E3、E4、E5、E6、DNPE4(1)--DNPE4(5)、DNPE4(7)、 DNPE4(9)、DNPE6(1)--DNPE6(7)、DNPE6(9)和DNPE6(12)在3400cm-1和2900 cm-1附近均存在糖的特征峰，且在1720cm-1附近都没有糖醛酸的特征峰，说明这些多糖均为中性多糖。
6、金钗石斛多糖的紫外表征
(1)实验步骤：用蒸馏水将E1、E2、E3、E4、E5、E6、DNPE4(1)--DNPE4(5)、 DNPE4(7)、DNPE4(9)、DNPE6(1)--DNPE6(7)、DNPE6(9)和DNPE6(12)配制成一定浓度的溶液，用紫外可见分光光谱仪TU-1900对多糖进行检测，扫描范围为：200--700nm。
(2)实验结果：DNPE4(1)、DNPE4(2)、DNPE4(3)、DNPE4(8)、DNPE4(9)、 DNPE6(6)、DNPE6(7)、DNPE6(8)和DNPE6(11)在260nm附近有吸收峰，说明这九个多糖中含有核酸残基，在280nm没有吸收峰，说明它们结构中没有蛋白质残基。另外，DNPE4(4)、DNPE4(5)、DNPE4(7)、DNPE6(1)、DNPE6(2)、 DNPE6(3)、DNPE6(4)、DNPE6(5)、DNPE6(9)、DNPE6(11)和DNPE6(12)在260 nm和280nm附近都没有吸收峰，说明十一个多糖结构中既不存在核酸残基，也不存在蛋白质残基。
7、金钗石斛多糖的部分酸水解
(1)实验步骤：称取实施例1-25制得多糖mg，向其中加入2mL 0.1M TFA， 100℃条件下水解1h。然后用透析袋对水解产物进行透析，分别收集透析袋中残留物和透析液，并且分别进行浓缩、冷冻干燥。最后按照实施例2对透析袋中残留物和透析液的干燥粉末进行单糖组成分析。
(2)实验结果：
表14均一性金钗石斛多糖部分酸水解结果
a多糖的主链。b多糖的支链。
如表14所示，是所述均一性金钗石斛多糖的部分酸水解的结果，由该结果可知均一性金钗石斛多糖的主链及侧链中的单糖组成及其摩尔比。
试验例2：金钗石斛多糖抗病毒活性测试
1、金钗石斛多糖抗烟草花叶病毒活性
(1)实验步骤：
a.保护活性测试：取生长均匀的心叶烟(叶龄为8--10片叶)，去除顶端，摘去底部较小的叶子，每株约留4--5片叶。称取2mg待测试金钗石斛多糖，分别溶于4mL 1％的tween-80水溶液中。用毛笔将配制好的各溶液刷到心叶烟的右半边，待24h后，在心叶烟的整片叶子上接种TMV，每个化合物的活性测试做三个平行。
b.治疗活性测试：生长均匀的心叶烟(叶龄为8--10片叶)，去除顶端，摘去底部较小的叶子，每株约留4--5片叶子。称取2mg待测试的金钗石斛多糖，分别溶于4mL 1％的tween-80水溶液中。在心叶烟的整片叶子接种上TMV，半小时后，用毛笔在心叶烟的右边涂上待测物溶液，每个化合物的活性测试做三个平行。
c.钝化活性测试：取生长均匀的心叶烟(叶龄为8--10片叶)，去除顶端，摘去底部较小的叶子，每株约留4--5片叶子。称取2mg待测试金钗石斛多糖，分别溶于2mL 1％的tween-80水溶液中。另外。然后取TMV病毒液与待测试金钗石斛多糖溶液分别进行等体积混合，另取TMV病毒液与1％的tween-80水溶液等体积混匀。半小时后，在心叶烟的左半片叶子上接种上TMV，右半片叶子上涂上待测糖和病毒的混合液，每个化合物的活性测试做三个平行。
d.抑制率计算公式
抑制率(ω)＝(x1-x2)/x1×100％
——x1，对照叶片上的斑点个数；
——x2，实验叶片上的斑点个数。
(2)实验结果：
表16金钗石斛寡糖和多糖抗TMV活性测试结果(500μg/mL)
由表16可知，在500μg/mL的浓度下，E1--E6对TMV在保护、治疗和钝化方面均有一定的抑制活性，其中粗多糖E2对TMV的保护活性64.3％，优于对照药剂宁南霉素(60.5％)；粗多糖E1对TMV的钝化活性为93.0％，优于对照药剂宁南霉素(90.0％)。
表17 DNPE4和DNPE6系列多糖抗TMV活性测试结果(测试浓度为125μg/mL)
如表17所示，测试浓度为125μg/mL时，均一性金钗石斛多糖抗TMV活性测试结果。表中所述金钗石斛多糖对TMV在保护和治疗方面均有一定的抑制活性，其中DNPE4(7)、DNPE6(4)、DNPE6(5)、DNPE6(6)和DNPE6(9)抗TMV 保护活性分别为59.3％、69.9％、65.2％、57.0％和66.0％，优于宁南霉素(54.9％)、氨基寡糖(39.1％)和香菇多糖(52.3％)。另外，结果显示DNPE4(2)、DNPE4(4)、 DNPE4(7)和DNPE6(8)抗TMV治疗活性分别为50.7％、51.4％、52.3％和52.3％，优于宁南霉素(33.6％)、氨基寡糖(17.2％)和香菇多糖(48.8％)。
2、金钗石斛多糖抗黄瓜花叶病毒活性
(1)实验方法：按照试验例2中的1实验方法进行抗黄瓜花叶病毒，所选的测试植物为苋色藜。
(2)实验结果：
表18粗多糖E1--E6抗CMV活性测试结果(500μg/mL)
由表18可知，在500μg/mL的浓度下，粗多糖E6抗CMV保护活性为43.9％，与氨基寡糖(45.1％)和香菇多糖(43.0％)相当。粗多糖E3、E4和E6抗CMV 治疗活性分别为40.2％、50.2％和37.5％，均优于氨基寡糖(37.3％)和香菇多糖 (37.8％)，粗多糖E2、E3和E6抗CMV的钝化活性为49.7％、49.9％和54.5％，均优于对照药剂氨基寡糖(34.1％)和香菇多糖(46.7％)。
表19 DNPE4和DNPE6系列多糖抗CMV活性测试结果(500μg/mL)
由表19可知，在500μg/mL的浓度下，粗多糖DNPE4(3)和均一性多糖 DNPE6(1)对CMV的治疗活性分别为42.2％和39.3％，优于对照药剂氨基寡糖 (37.3％)和香菇多糖(37.8％)，均一性多糖NPPE6(11)对CMV的治疗活性为 55.1％，优于氨基寡糖(37.3％)和香菇多糖(37.8％)。粗多糖DNPE4(5)和 DNPE6(3)，以及均一性多糖DNPE6(8)对CMV钝化活性分别为35.6％、35.4％和38.0％，与氨基寡糖(34.1％)相当；均一性多糖DNPE4(7)和DNPE6(6)，以及粗多糖DNPE4(3)对CMV钝化活性分别为43.1％、45.7％和46.8％，优于氨基寡糖(34.1％)，与香菇多糖相当(46.7％)；粗多糖DNPE4(1)和均一性多糖 DNPE6(11)对CMV钝化活性分别为60.6％和58.2％，均优于氨基寡糖(34.1％) 和香菇多糖(46.7％)。
3、金钗石斛多糖抗马铃薯Y病毒活性
(1)实验方法：按照试验例2中的1实验步骤进行抗马铃薯Y病毒活性测试，所选的测试植物为苋色藜。
(2)实验结果：
表20 E1--E6系列多糖抗PVY活性测试结果
由表20可知，在500μg/mL的浓度下，E1–E6对PVY在保护、治疗和钝化方面均有一定的抑制活性，其中粗多糖E6对PVY的保护、治疗和钝化活性分别为47.7％、50.8％和54.8％，与对照药剂宁南霉素相当。
表21 DNPE6系列多糖抗PVY活性测试结果
由表21可知，在500μg/mL的浓度下，粗多糖DNPE6(3)对PVY的保护活性为42.9％，与对照药剂宁南霉素(43.6％)相当。均一性多糖DNPE6(11)对PVY 的治疗活性为51.5％，与对照药剂宁南霉素(50.3％)相当。非均一性多糖 DNPE6(2)和DNPE6(3)，以及均一性多糖DNPE6(11)对PVY钝化活性分别为： 62.4％和63.6％，与对照药剂宁南霉素相当(60.7％)。
试验例3：发明金钗石斛多糖抗病毒作用机制的试验
1、金钗石斛多糖与黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)之间的相互作用
(1)实验方法：采用荧光滴定和微量热泳动仪法(MST)测试金钗石斛多糖与CMV CP之间的相互作用力。
(2)实验结果：
表22 DNPE6(1)、DNPE6(11)、氨基寡糖和香菇多糖的Kd和Ka
如表22所示，是多糖DNPE6(1)、DNPE6(11)、氨基寡糖和香菇多糖的Kd、 Ka和抗CMV钝化活性的EC50。多糖DNPE6(11)、DNPE6(1)、氨基寡糖和香菇多糖与CMV CP的解离常数的Kd值存在以下关系：DNPE6(11)<香菇多糖<氨基寡糖<DNPE6(1)，说明结合力由强到弱的关系为DNPE6(11)>香菇多糖>氨基寡糖>DNPE6(1)。
多糖与CMV CP的电离常数(Ka)通过荧光滴定进行了测试。多糖 DNPE6(11)、DNPE6(1)、氨基寡糖和香菇多糖与CMV CP的解离常数的Ka值存在以下关系DNPE6(11)>香菇多糖>氨基寡糖>DNPE6(1)。结合力由强到弱的关系为DNPE6(11)>香菇多糖>氨基寡糖>DNPE6(1)。
综上所述，MST和荧光滴定的结果都与钝化活性的结果相符。该结果表明多糖DNPE6(11)与CMV CP有很强的结合力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。