阅读说明：本技术 一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐、制备方法及应用 (Oligosaccharide compound and pharmaceutically acceptable salt thereof, preparation method and application ) 是由 赵金华 尹荣华 高娜 周路坦 刘吉开 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本申请涉及药物领域,具体而言,涉及一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐、制备方法及应用。寡糖化合物是由D-α-硫酸化半乳糖、L-α-硫酸化岩藻糖、L-α-Δ<Sup>4,5</Sup>葡萄糖醛酸和/或D-β-葡萄糖醛酸或其糖醇、D-β-2-脱氧-2-乙酰氨基-硫酸化半乳糖以及任选含有2,5-脱水塔罗糖组成。本申请提供的寡糖化合物及其药物组合物具有强效因子X酶抑制活性及血栓形成抑制活性,可用于制备抗血栓药物。(The application relates to the field of medicines, in particular to an oligosaccharide compound and pharmaceutically acceptable salts, a preparation method and application thereof, wherein the oligosaccharide compound is prepared from D- α -sulfated galactose, L- α -sulfated fucose, L- α -delta 4,5 The oligosaccharide compound and the pharmaceutical composition thereof have strong factor X enzyme inhibiting activity and thrombosis inhibiting activity and can be used for preparing antithrombotic medicaments.)

一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐、制备方法及应用

技术领域

本申请涉及药物领域，具体而言，涉及一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐、制备方法及应用。

背景技术

来源于棘皮动物海参纲的岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated glycosaminoglycan，FG)具有强效的抗凝活性，且其抗凝活性主要与强效抑制内源性因子X酶(intrinsictenase，iXase)的活性相关。

FG寡糖抑制iXase及其抗凝抗血栓活性的构-效关系研究显示，在侧链为岩藻单糖的系列FG脱氨基解聚产物中，九糖(nonasaccharide)是具有强效抑制iXase活性的最小结构片段；而在β-消除解聚来源的系列解聚产物中，八糖(octasaccharide)具有与前述九糖近似强度的iXase抑制活性，这是迄今为止所见最小结构的可强效抑制iXase的FG寡糖。

发明内容

本申请实施例的目的在于提供一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐、制备方法及应用，其旨在提供一种具有强效抑制iXase以及显著抗凝和抗血栓活性且具有低出血倾向特点的寡糖(七糖)化合物及其药学上可接受的盐。

本申请第一方面提供一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐，所述寡糖化合物的化学结构如式(I)所示：

式(I)中：

糖基A为D-α-4,6-二硫酸化半乳糖基；

糖基B为L-α-3-硫酸化岩藻糖基；

糖基C为D-β-葡萄糖醛酸基或者L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基；

糖基D为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸化半乳糖基；

糖基E为D-β-葡萄糖醛酸基；

糖基F为L-α-2,4-二硫酸化岩藻糖基；

其中，当C为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基时，R₁为R₂为-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂中的任一个；其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基、取代或未取代的C7-C12芳基

当C为D-β-葡萄糖醛酸基时，R₁为R₂为-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂中的任一个；其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基、取代或未取代的C7-C12芳基。

式(I)所示寡糖化合物及其药学上可接受的盐可以抑制内源性因子X酶的活性，并具有显著的低出血倾向的抗血栓活性，是迄今所知能够强效抑制iXase的聚合度最小的糖胺聚糖来源的寡糖化合物。七糖作为结构更小、具有强效抑制iXase活性的寡糖，其低出血倾向的抗血栓活性特点使之具有重要的预防和/或治疗血栓性疾病的应用价值。

本申请第二方面提供一种式(II)所示寡糖化合物的制备方法，包括：

将梅花参(Thelenota ananas)体壁中提取制备得到的岩藻糖化糖胺聚糖进行季铵盐化及苄酯化，继而对苄酯化的羧酸酯进行β-消除反应，以断裂FG主链中连接D-GalNAc和D-GlcUA的β1,4糖苷键，获得非还原性末端为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基的解聚产物。

采用层析法分离纯化所述解聚产物得到纯化寡糖然后进行末端结构修饰；或者，对所述解聚产物进行末端结构修饰再采用层析法分离纯化。

其中，所述采用层析法分离纯化的步骤包括：

以标准品六糖和八糖的保留时间作对照，进行HPGPC分析，对低聚FG混合物采用GPC分离，继而对七糖组分采用离子型半制备柱或制备柱进行纯化，洗脱条件为：0-120min内洗脱液由H₂O梯度变化至2mol/l NaCl，缓冲液pH 3-4；所得寡糖经凝胶柱脱盐。

本申请第三方面提供一种式(Ⅲ)所示寡糖化合物的制备方法，包括：

从梅花参(Thelenota ananas)体壁中提取获得岩藻糖化糖胺聚糖，通过肼和/或硫酸肼处理脱除岩藻糖化糖胺聚糖中所含的部分乙酰基；然后采用亚硝酸处理以断裂FG主链中连接D-GalNH₂和D-GlcUA的β1,4糖苷键，获得还原性末端为2,5-脱水塔罗糖的脱氨基解聚产物；

采用层析法分离纯化所述脱氨基解聚产物得到纯化寡糖然后进行末端结构修饰；或者，对所述脱氨基解聚产物进行末端结构修饰然后采用层析法分离纯化。

采用层析法分离纯化的步骤包括：

以标准品六糖和八糖的保留时间作对照，进行HPGPC分析，对脱氨基解聚产物采用GPC分离，继而对七糖组分采用离子型半制备柱或制备柱进行纯化，洗脱条件为：0-120min内洗脱液由H₂O梯度变化至2mol/l NaCl，缓冲液pH 3-4；所得寡糖经凝胶柱脱盐。

本申请第四方面提供一种上述所示的寡糖化合物及其药学上可接受的盐在制备抑制内源性因子X酶的活性药物中的应用。

本申请第五方面提供一种上述的寡糖化合物及其药学上可接受的盐的应用，所述寡糖化合物及其药学上可接受的盐用于制备治疗和/或预防血栓性疾病的药物；可选地，所述血栓性疾病为静脉血栓形成、动脉血栓形成或者缺血性心脑血管疾病。

本申请第六方面提供一种抑制内源性因子X酶的活性的药物，所述药物包括辅料和上述的寡糖化合物及其药学上可接受的盐。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1示出了本申请实施例1制备得到的化合物的¹H NMR谱图。

图2示出了本申请实施例1制备得到的化合物的¹³C NMR谱图。

图3示出了本申请实施例1制备得到的化合物的¹H-¹³C HSQC谱图。

图4示出了本申请实施例1制备得到的化合物的Q-TOF MS谱图及归属。

图5示出了本申请实施例1制备得到的化合物的倍增APTT延长活性。

图6示出了本申请实施例1制备得到的化合物对内源性因子X酶的抑制活性。

图7示出了式(II)所示寡糖化合物的抗血栓活性。

图8示出了式(II)所示寡糖化合物的出血影响。

图5-图8中，“1”代表七糖化合物1的实验组，“LMWH”代表依诺肝素钠注射液的实验组。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请实施例的寡糖化合物及其药学上可接受的盐进行具体说明。

本申请提供一种寡糖化合物及其药学上可接受的盐，寡糖化合物的化学结构如式(I)所示，

式(I)中：

糖基A为D-α-4,6-二硫酸化半乳糖基；

糖基B为L-α-3-硫酸化岩藻糖基；

糖基C为D-β-葡萄糖醛酸基或者L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基；

糖基D为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸化半乳糖基；

糖基E为D-β-葡萄糖醛酸基；

糖基F为L-α-2,4-二硫酸化岩藻糖基；

其中，当C为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基时，R₁为R₂为-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂中的任一个；其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基、取代或未取代的C7-C12芳基

当C为D-β-葡萄糖醛酸基时，R₁为R₂为-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂中的任一个；其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基、取代或未取代的C7-C12芳基。

详细地，本申请主要提供两类寡糖化合物及其药学上可接受的盐。

第一类化学结构如式(II)所示：

式(II)中：

糖基A为D-α-4,6-二硫酸化半乳糖基；糖基B为L-α-3-硫酸化岩藻糖基；糖基C为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基；糖基D为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸化半乳糖基；糖基E为D-β-葡萄糖醛酸基；糖基F为L-α-2,4-二硫酸化岩藻糖基；糖基G为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸半乳糖或其糖醇或糖胺。

R₂选自-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂，其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基，取代或未取代的C7-C12芳基；且当R₂为-CH＝O时，此末端醛基与该糖环中的C5位羟基形成半缩醛的六元糖环结构；

作为示例性地，R₂可以为-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH或者-CH₂NH₂。

进一步地，R₂可以为-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂；其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基，取代或未取代的C7-C12芳基；例如，R’为取代或未取代的C6的直链或支链烷基；R’为取代或未取代的C2或者C3烷基；R’为取代或未取代的C4、C5或者C6的直链或支链烷基；R’为取代或未取代的C7-C12芳基，取代基可以为-CH＝O、-OH等。

当R₂为-CH＝O时，此末端醛基与该糖环中的C5位羟基形成半缩醛的六元糖环结构。

在本申请中，如式(II)所示寡糖化合物可以通过以下方法制备得到：

将梅花参(Thelenota ananas)体壁中提取制备得到的岩藻糖化糖胺聚糖经季铵盐化及苄酯化后，进一步地进行β-消除反应，以断裂季铵盐化岩藻糖化糖胺聚糖主链中连接D-GalNAc和D-GlcUA的β1,4糖苷键，获得非还原性末端为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基的解聚产物。非还原性末端为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基的解聚产物又称低聚FG混合物。

作为示例性地，季铵盐化岩藻糖化糖胺聚糖的羧酸酯可以通过以下方法制得：

季铵盐转化：以梅花参(Thelenota ananas)来源的岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan,FG)为反应起始物，向FG的碱金属或碱土金属盐的水溶液中加入过量的有机铵盐类化合物，由此形成水不溶性的FG季铵盐可容易地从所述水溶液中沉淀出来。或者，采用离子交换树脂将FG的碱金属盐或碱土金属盐交换成H型FG，继而采用碱性有机铵中和所述H型FG亦可获得FG季铵盐。

作为示例性地，季铵盐为苄索铵盐(N,N-二甲基-N-[2-[2-[4(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基]乙氧基]乙基]苯甲铵盐)。需要说明的是，季铵盐也可以为其他季铵盐形式。

羧基酯化：将上述得到的FG季铵盐中D-β-葡萄糖醛酸基上的羧基全部或部分转化为羧酸酯，作为示例性地，羧酸酯可以为苄酯，在本申请的其他实施例中，羧酸酯可以为其他。

例如，FG季铵盐羧基酯化反应可以在二甲基甲酰胺(DMF)或DMF与低级醇、酮和/或醚的混合溶剂中进行，使FG中的羧基与化学计量的卤代烃反应；卤代烃可以为C1-C6直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的脂族烃基；或取代或未取代的C7-C12芳族烃基等。

然后将季铵盐化岩藻糖化糖胺聚糖的羧酸酯进行β-消除反应。例如可以采用如下方法：

将季铵盐化岩藻糖化糖胺聚糖的羧酸酯在非水溶剂中，在碱性试剂存在下，通过羧酸酯基的β-消除反应，断裂季铵盐化岩藻糖化糖胺聚糖主链中连接D-GalNAc和D-GlcUA的β1,4糖苷键，获得非还原性末端为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基的解聚产物(低聚FG混合物)。非水溶剂例如可以为二甲基甲酰胺(DMF)或DMF与低级醇、酮和/或醚的混合溶剂，碱性试剂例如可以为NaOH、KOH、C1-C4的醇钠、乙二胺、三正丁胺、4-二甲氨基吡啶、二氮杂二环或者它们的混合物。

采用层析法分离纯化所述得到的解聚产物(低聚FG混合物)纯化寡糖然后进行末端结构修饰；或对所述解聚产物(低聚FG混合物)进行末端结构修饰再采用层析法分离纯化。分离纯化以及末端结构修饰可以根据目标化合物的情况调整次序。例如，制备糖醇形式的目标化合物时，可在解聚反应后随即进行还原反应，然后再进行寡糖纯化。

分离纯化的步骤包括：以标准品六糖和八糖的保留时间作对照，进行HPGPC分析，对低聚FG混合物采用GPC分离，继而采用离子型半制备柱或制备柱进行纯化，洗脱条件为：0-120min内洗脱液由H₂O梯度变化至2mol/l NaCl，缓冲液pH 3-4；所得寡糖经凝胶柱脱盐。

作为示例性地，上述分离纯化还可以任选联用超滤法、盐析法等技术方法以提高所述分离纯化的效率。

还原端糖基末端结构修饰的步骤包括：根据还原端糖基末端醛基的还原性以及目标产物，将醛基还原成醇羟基、通过还原烷基化反应将醛基还原成烷基衍生物或者通过还原胺基化反应将醛基还原成氨基衍生物等等。

例如：在碱性条件下与NaBH₄反应，可将还原端糖基还原成糖醇；碱性条件下与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)反应可生成寡糖-PMP或寡糖-2PMP衍生物；在有机胺存在下将还原端糖基的1位醛基反应生成希夫碱，继而在还原剂存在下被还原成次级胺，从而可将还原端糖基还原成糖胺或糖胺衍生物。

采用还原端糖基末端结构修饰可以得到R₂为-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂的式(II)所示寡糖化合物，其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基，取代或未取代的C7-C12芳基。

本申请还提供一种化学结构如式(III)所示的寡糖化合物。

式(III)中：

糖基A为D-α-4,6-二硫酸化半乳糖基；糖基B为L-α-3-硫酸化岩藻糖基；糖基C为D-β-葡萄糖醛酸基；糖基D为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸化半乳糖基；糖基E为D-β-葡萄糖醛酸基；糖基F为L-α-2,4-二硫酸化岩藻糖基；糖基G为2,5-脱水塔罗糖或其糖醇或糖胺。

R₂选自-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂，其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基，取代或未取代的C7-C12芳基。

作为示例性地，R₂可以为-CH＝O、-CH(OH)₂、-CH₂OH或者-CH₂NH₂。

进一步地，R₂可以为-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂；其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基，取代或未取代的C7-C12芳基；例如，R’为取代或未取代的C6的直链或支链烷基；R’为取代或未取代的C2或者C3烷基；R’为取代或未取代的C4、C5或者C6的直链或支链烷基；R’为取代或未取代的C7-C12芳基，取代基可以为-CH＝O、-OH等。

当R₂为-CH＝O时，此末端醛基与该糖环中的C5位羟基形成半缩醛的六元糖环结构。

在本申请中，式(III)所示寡糖化合物可以通过以下方法制备得到：

从梅花参(Thelenota ananas)体壁中提取获得岩藻糖化糖胺聚糖，通过肼和/或硫酸肼处理脱除岩藻糖化糖胺聚糖中所含的部分乙酰基；然后采用亚硝酸处理以断裂主链中连接D-GalNH₂和D-GlcUA的β1,4糖苷键，获得还原性末端为2,5-脱水塔罗糖的脱氨基解聚产物

作为示例性地，梅花参体壁中提取制备得到的岩藻糖化糖胺聚糖的亚硝酸解聚产物可以通过以下方法制备得到：

FG部分脱乙酰化：以梅花参(Thelenota ananas)来源的岩藻糖化糖胺聚糖(FG)为反应起始物，通过肼处理脱除FG中D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸化半乳糖基的部分乙酰基。作为示例性地，向FG中加入无水肼或水合肼溶液，搅拌中在75℃～125℃的温度下反应2～14h。在一些实施例中，上述反应可以在硫酸肼、盐酸肼等催化剂中催化反应。

FG脱氨基解聚：将上述得到的部分脱乙酰化的FG中间产物经亚硝酸处理发生脱氨基解聚，断裂主链中连接D-GalNH₂和D-GlcUA的β1,4糖苷键，获得还原性末端为2,5-脱水塔罗糖的解聚产物(低聚FG混合物)。作为示例性地，亚硝酸处理的条件包括：在冰浴或室温条件下，向经肼解处理获得的部分脱乙酰化产物加入4～6mol/L亚硝酸溶液(pH 1～5)，反应5～60min后，碱溶液调pH 8或以上终止反应。

采用层析法分离纯化所述解聚产物(低聚FG混合物)得到纯化寡糖然后进行末端结构修饰；或者，对所述解聚产物(低聚FG混合物)进行末端结构修饰再采用层析法分离纯化。

分离纯化以及末端结构修饰可以根据目标化合物的情况调整次序。例如，制备糖醇形式的目标化合物时，可在解聚反应后随即进行还原反应，然后在进行寡糖纯化。

其中，采用层析法分离纯化的步骤包括：

以标准品六糖和八糖的保留时间作对照，进行HPGPC分析，对低聚FG混合物采用GPC分离，继而采用离子型半制备柱或制备柱进行纯化，洗脱条件为：0-120min内洗脱液由H₂O梯度变化至2mol/l NaCl，缓冲液pH 3-4；所得寡糖经凝胶柱脱盐。

上述分离纯化还可以任选联用超滤法、盐析法等技术方法以提高所述分离纯化的效率。

还原端糖基末端结构修饰的步骤包括：根据还原端糖基末端醛基的还原性以及目标产物，将醛基还原成醇羟基、通过还原烷基化反应将醛基还原成烷基衍生物或者通过还原胺基化反应将醛基还原成氨基衍生物等等。

例如：在碱性条件下与NaBH₄反应，可将还原端糖基还原成糖醇；碱性条件下与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)反应可生成寡糖-PMP或寡糖-2PMP衍生物；在有机胺存在下将还原端糖基的1位醛基反应生成希夫碱，继而在还原剂存在下被还原成次级胺，从而可将还原端糖基还原成糖胺或糖胺衍生物。

采用还原端糖基末端结构修饰可以得到R₂为-CH₂OH、-CH₂NH₂、-CH₂NHR’或-CH₂N(R’)₂的式(Ⅲ)所示寡糖化合物，其中R’为取代或未取代的C1-C6直链或支链烷基，取代或未取代的C7-C12芳基。

综上可以看出，本申请通过不同的制备方法可以得到式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物。

相应地，寡糖化合物的药学上可接受的盐可采用以式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物为反应物采用相应的盐的制备方法制得。

作为示例性地，药学上可接受的盐是钠盐、钾盐、钙盐或有机铵盐。

式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物及其药学上可接受的盐，具有强效的内源性因子X酶的活性。其体外抑制人内源性因子X酶的IC₅₀值约在200～500nmol/L的范围内，而对凝血瀑布中的其它凝血因子、凝血辅因子以及抗凝血酶(AT-III)等无显著影响或影响较弱。

体外抗凝活性分析显示，式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物均可显著延长人质控血浆的活化部分凝血酶时间(APTT)值，其倍增人质控血浆APTT所需的药物浓度一般在60～120μg/mL的范围内，而对人质控血浆的凝血酶原时间(PT)以及凝血酶时间(TT)没有显著影响或影响较弱，说明式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物均可强效抑制内源性凝血途径，而对外源性凝血途径以及共同凝血途径无显著影响或影响较小。

在组织因子诱导的大鼠深静脉血栓形成的病理模型中，式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物均可以显著抑制深静脉血栓形成。以血栓重量计，皮下注射(sc.)4.7mg/kg～13.6mg/kg剂量的式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物对血管结扎合并凝血活酶诱导的大鼠深静脉血栓形成的抑制率可达83％～93％，且在等效抗血栓剂量下，式(II)或者式(Ⅲ)所示七糖化合物对出血量的影响可显著低于临床使用的低分子肝素类药物。

发明人在研究中发现，在式(II)或者式(Ⅲ)所示的化合物中，当糖基A连接于糖基F时，其七糖化合物并不能显示强效的iXase抑制活性；只有当七糖化合物中糖基A连接于糖基B(即式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物)才具有强效的iXase抑制活性。

此前研究报道梅花参(Thelenota ananas)FG含有Fuc_2S4S、Fuc_4S和Fuc_3S等类型的单糖侧链糖基，未能发现其含有二糖侧链，发明人猜测其可能的原因包括：其一，此前结构研究用样品均为原型多糖、部分酸水解产物以及氧化解聚产物等混合物形式的多糖或低聚糖组分，这些样品的波谱结构解析存在技术上的困难，而来自二糖侧链中D-α-GalS的几个易于辨认的波谱信号容易与来自L-α-FucS的信号混淆；其二，部分酸水解产物以及氧化解聚产物所含糖类组分的结构不够规则，很难从中分离纯化出纯品糖类化合物。实际上，由于动物体内的糖胺聚糖承担着诸多重要和基础的生理学功能，因此，即使在动物界的长期进化过程中，糖胺聚糖的基本结构高度保守，除FG含有大量的FucS侧链糖基外，常见GAG类成分多为简单线性结构；而迄今为止尚无经过确证的含二糖侧链的糖胺聚糖的报道，本申请所述的二糖侧链是首次发现存在于天然GAG的二糖侧链。

在本申请中，通过对解聚产物中分离纯化的寡糖结构解析得到式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物。式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物中含有特殊的“D-硫酸化半乳糖(GalS)-α1,2-L-FucS-α1-”二糖侧链。在非还原端存在D-GalS-α1,2-L-FucS-α1-侧链二糖的特殊结构的FG七糖化合物具有强效抑制iXase活性，并具有显著的低出血倾向的抗血栓活性，这是迄今所知能够强效抑制iXase的聚合度最小的糖胺聚糖来源的寡糖化合物。七糖作为结构更小、具有强效抑制iXase活性的寡糖，其低出血倾向的抗血栓活性特点使其具有重要的预防和/或治疗血栓性疾病的应用价值。

此外，对于聚合度大于或等于8的梅花参FG寡糖而言，二糖侧链的存在对其抑制iXase以及抗凝抗血栓活性并无显著影响。对于含本申请所述二糖侧链(D-GalS-α1,2-L-α-FucS-α1-)的八糖及以上的FG寡糖化合物而言，有无二糖侧链中的D-α-GalS的存在，化合物对iXase抑制活性并无显著差异。对于式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物中，连接于非还原端的D-α-GalS糖基对化合物的iXase抑制活性具有特殊的贡献和作用。

综上可以看出：式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物可以抑制iXase的活性，寡糖化合物及其药学上可接受的盐可以用于制备抑制iXase活性的药物。

进一步地，寡糖化合物及其药学上可接受的盐可用于制备治疗和/或预防血栓性疾病的药物；例如，所述血栓性疾病为静脉血栓形成、动脉血栓形成或者缺血性心脑血管疾病。

本申请还提供一种抑制内源性因子X酶的活性的药物，所述药物包括辅料和上述的寡糖化合物及其药学上可接受的盐。

进一步地，该药物单位制剂中可含有50mg～200mg的寡糖化合物或其药学上可接受的盐。

式(II)或者式(Ⅲ)所示寡糖化合物在胃肠道给药情况下的生物利用度非常有限，因此，药物的剂型为非经胃肠道给药剂型。例如静脉注射用剂型。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种寡糖化合物，通过以下方法制备得到：

材料

苄索氯铵、氯化苄、DMF、氢氧化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。

Sephadex G25，medium(50-100μm)，GE Healthcare；Bio-Gel P10,medium(90-180μm)，Bio-Rad；Dionex IonPac^TM AS11-HC Semi-Prep Column(9mm×250mm)，ThermoScientific；HPLC色谱仪，安捷伦1200/1260系列色谱仪。

制备方法

(1)TaFG的季铵盐转化：将25g苄索氯铵溶解于400mL H₂O中并缓慢滴加至10gTaFG(溶解于150mL H₂O)中，产生白色沉淀，静置过夜，4000rpm×15min条件下离心，沉淀用300mL H₂O反复洗涤三次以除去多余的苄索氯铵，所得沉淀在40℃、五氧化二磷做干燥剂的条件下干燥至恒重，得到FG-季铵盐25.306g。

(2)TaFG的羧基酯化：将步骤(1)所得的TaFG季铵盐溶解于127mL DMF中，加入12mL氯化苄，35℃下苄酯化24h，反应结束体系冷却至25℃。

(3)还原剂存在下的β-消除解聚：向步骤(2)所述反应液中加入46.3mL现配制的0.08M EtONa/EtOH溶液(含0.4M NaBH₄)至体系终浓度为0.02M EtONa/EtOH溶液(含0.1MNaBH₄)，搅拌反应30min。

(4)解聚产物的钠盐转换与羧酸酯水解：向步骤(3)所述反应液中加入215mL饱和NaCl溶液进行交换，加无水乙醇至80％醇沉，4000rpm×10min离心得沉淀，反复三次，所得沉淀用520mL H₂O溶解，加入4.37mL新配置的6M NaOH溶液(含12M NaBH₄)至其终浓度为0.05M(含0.1M NaBH₄)，于25℃条件下搅拌反应30min，反应结束后，反应体系用6M的HCl中和，中和液经Sephadex G-25脱盐冻干，得解聚产物dTaFG 6.8g，得率为68％。

(5)七糖的分离纯化：取6.8g dTaFG溶解于一定量的0.2M NaCl中，分批上样于Bio-Gel P10凝胶柱，以0.2M NaCl溶液洗脱，流速10mL/h，2.5mL/管收集洗脱流份。紫外分光光度法检测洗脱流份并绘制洗脱曲线，合并组分相同的洗脱流份，未纯化样品以Bio-GelP-10凝胶柱继续纯化，以标准品六糖和八糖的保留时间作对照，进行HPGPC分析(SuperdexPeptide 10/300 GL柱，0.4M NaCl溶液等度洗脱，示差折光检测器联用紫外检测器检测)，对疑似七糖组分进一步地采用Dionex IonPac^TM AS11-HC半制备柱进行纯化，洗脱条件为60min内洗脱液H₂O(pH 3.5)-2M NaCl(pH 3.5)的体积比由25％梯度升至85％，所得寡糖经Sephadex G25凝胶柱脱盐并冻干。

(6)波谱分析：¹H/¹³C-及2D-NMR检测采用Bruker DRX 800MHz核磁共振仪，谱宽16025.6Hz，采集时间2.0447s，脉冲宽度9.5s，弛豫时间1s，扫描32次。样品浓度为10g/L，检测前用重水反复干三次；ESI-Q-TOF MS采用micrOTOF-QII ESI-MS(Bruker,Germany)质谱仪分析。质谱条件为毛细管电压2500V，喷雾器电压0.6bar，干燥气流速4.0L/min，干燥气温度+180℃，m/z扫描范围50～3000。数据采用Bruker Compass Data-Analysis4.0(Bruker-Daltonics,Germany)软件进行分析。

结果

(1)按所述方法获得化合物1 50mg。

(2)化合物1结构解析：¹H NMR谱图及归属如附图1所示；¹³C NMR谱图及归属如附图2所示；¹H-¹³C HSQC谱图及归属如附图3所示；Q-TOF MS谱图及归属如附图4所示；¹H/¹³C NMR信号归属见表1。

(3)根据¹H-/¹³C-及2D-NMR及Q-TOF MS分析，化合物1的化学结构为：

D-Gal_4S6S-(α1,2)-L-Fuc_3S-(α1,3)-L-Δ^4,5GlcUA-(α1,3)-D-GalNAc_4S6S-(β1,4)-[L-Fuc_2S4S-(α1,3)-]-D-GlcUA-(β1,3)-D-GalNAc_4S6S-ol，其结构式为：

表1化合物1的¹H/¹³C NMR信号归属及耦合常数(ppm,Hz)

注：糖基A为D-α-4,6-二硫酸化半乳糖基(G)；糖基B为L-α-3-硫酸岩藻糖基(dF)；糖基C为L-α-4-脱氧-苏式-己-4-烯糖醛酸基(dU)；糖基D为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸化半乳糖基(A)；糖基E为D-β-葡萄糖醛酸基(U)；糖基F为L-α-2,4-二硫酸化岩藻糖基(F)；糖基G为D-α-2-脱氧-2-乙酰氨基-4,6-二硫酸半乳糖醇(rA)。()的标注同表1及附图1～3。

实施例2

本实施例提供了一种寡糖化合物，通过以下方法制备得到：

材料

TaFG，即梅花参Thelenota ananas来源的天然FG(钠盐)，同实施例1。

水合肼、硫酸肼、氯化钠、亚硝酸钠、浓硫酸和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。

寡糖分离所需材料及仪器同实施例1。

方法

(1)部分脱乙酰化TaFG的制备：将10g TaFG置于500mL圆底反应瓶中，加入硫酸肼2.5g，然后加入水合肼250mL，N₂保护，90℃下加热搅拌反应24h。反应结束后向反应液中加入无水乙醇至体系乙醇终浓度为80％(v/v)，沉淀，离心去上清。所得沉淀以250mL H₂O溶后，加入1000mL无水乙醇(所得溶液纯浓度为80％，v/v)，重复醇沉4次。沉淀加水复溶，经截留分子量为3500Da透析袋(美国联合碳化公司产品)透析，截留液冷冻干燥，得到脱乙酰话中间产物样品约8g，得率约80％。

(2)脱氨基解聚：将步骤(1)所得的TaFG部分脱乙酰化中间产物溶解于160mLH₂O中，室温条件下加入5.5M，pH为4的亚硝酸溶液320mL，搅拌反应20min后，加入1M的NaOH调溶液pH约9终止反应。所得反应溶液用截留分子量1000Da透析袋透析，收集截留液，冷冻干燥得解聚产物约6g，得率约75％。

(3)七糖的分离纯化及波谱解析：同实施例1。

结果

(1)按所述方法获得化合物2 30mg。

(2)化合物2的化学结构经NMR谱图及Q-TOF MS分析确定为：D-Gal_4S6S-(α1,2)-L-Fuc_3S-(α1,3)-D-GlcUA-(β1,3)-D-GalNAc_4S6S-(β1,4)-[L-Fuc_2S4S-(α1,3)-]-D-GlcUA-(β1,3)-D-anTal，2与化合物1谱图近似，而在约5.0～5.1ppm处出现的新的信号峰则来自于特征性的还原端2,5-脱水塔罗糖(an-Tal)的端基及4位氢。其结构式为：

式中，糖基C为D-β-葡萄糖醛酸基，糖基G为4,6-二硫酸-2,5-脱水塔罗糖，糖基A、B、D、E、F定义同实施例1。

实施例3

本实施例提供了一种寡糖化合物，通过以下方法制备得到：

3.2方法

实施例2所得化合物2 30mg溶解于1mL 0.2mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中，搅拌中加入过量的酪胺25mg和氰基硼氢化钠10mg，35℃恒温水浴中反应72h。反应结束后加入无水乙醇5mL，离心得沉淀；沉淀经无水乙醇反复洗涤两次后，复溶于H₂O中，离心除去不溶物，上清液经冷冻干燥后获得末端还原氨基化衍生物20mg。

3.3结果

以投料计产物得率约为66％；产物结构经NMR谱图判断，根据芳香质子氢信号(～7.0ppm)与L-Fuc端基氢(～5.3ppm)信号的积分比确定化合物2的还原性末端均被还原酪氨化。

实施例4

本实施例提供了一种寡糖化合物，通过以下方法制备得到：

4.1材料

化合物2，实施例2制备。1苯基-3-甲基-5吡唑啉酮(PMP)，生化试剂，纯度99％。

4.2方法

将实施例2所得寡糖30mg溶于H₂O中(50mg/mL)，加入1.5mL 0.5M PMP甲醇溶液和1mL 0.6M NaOH溶液，50℃下搅拌反应90min，反应结束后调pH至中性，反应液经Bio-Gel P2凝胶色谱柱脱盐处理，寡糖部分合并冻干得衍生化产物25mg。

4.3结果

衍生物结构经NMR谱图判断，根据PMP中芳香质子氢信号(～7.0ppm)与L-Fuc端基氢(～5.3ppm)信号的积分比确定化合物2的还原性末端均被还原烷基化。

实施例5

寡糖化合物的注射水溶液制备

材料

采用实施例1方法制备得到的寡糖化合物1

无菌注射水；2mL中硼硅玻璃管制注射用瓶；Millipore Pellicon 2超滤系统(Merk Millipore)

处方配料见表2所示。

表2寡糖化合物的注射水溶液配料比

原辅料名称	用量
		1	100g
注射用水	1000mL
		共制成	1000支

制备工艺

称取处方量的寡糖化合物1加注射用水至全量，搅拌溶解完全后，采用Millipore超滤装置以截留分子量为10kDa超滤膜包除去热原。无菌环境下，0.22μm膜过滤除菌后，将所得溶液灌装于容量2mL的西林瓶，每瓶1mL，灌装过程监测装量，检验合格，并包装得成品。

实施例6

寡糖化合物的冻干粉针剂制备

材料

采用实施例1方法制备得到的寡糖化合物1

无菌注射用水；2mL中硼硅玻璃管制注射用瓶；Millipore Pellicon 2超滤系统(Merk Millipore)，VirTis Ultra 35EL冷冻干燥机。

处方配料见表3所示。

表3寡糖化合物的冻干粉针剂配料比

原辅料名称	用量
		1	100g
注射用水	500mL
		共制成	1000支

制备工艺

称取处方量的寡糖化合物1加注射用水至全量，搅拌溶解完全后，采用Millipore超滤装置以截留分子量为10kDa超滤膜包除去热原。无菌环境下，0.22μm膜过滤除菌后，将所得溶液灌装于容量2mL的西林瓶，每瓶0.5mL，灌装过程监测装量，半压塞，置中试型冷冻干燥机(美国VirTis)的干燥箱内，按设定的冻干过程进行冻干，压塞，出箱，轧盖，检验。

冻干过程：预冷：将样品进箱，降隔板温至-25℃，保持1h，降温至-45℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至40Pa。升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持6h，真空保持40～30Pa。干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持30～20Pa；0.5h升温至10℃，保持3h，真空保持30～20Pa；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。

试验例1

本试验例主要包括实施例1提供的寡糖化合物(化合物1)抗凝及凝血因子抑制活性分析。

材料

样品：七糖化合物1

对照品：依诺肝素钠注射液(LMWH，Mw 3500～5500Da，赛诺菲-安万特产品)；

试剂：人凝血质控血浆、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)测定试剂盒，均为德国TECO GmbH公司产品；因子VIII检测试剂盒、AT依赖的抗因子IIa检测试剂盒、AT依赖的抗因子Xa检测试剂盒、凝血酶(因子IIa)、凝血酶底物CS-01(38)均为HYPHEN BioMed公司(法国)产品；因子VIII(FVIII)，Bayer Healthcare LLC公司(德国)产品。

仪器：MC-4000血凝仪，德国TECO GmbH公司产品；Microplate Reder ELx 808酶标仪，美国BioTek公司产品；VortexGenie涡旋振荡器，美国SCIENTIFIC INDUSTRIES公司产品；XS105电子天平，FE20 pH计，美国METTLER TOLEDO公司产品；HH-4恒温水浴锅，巩义市予华产品；VOR76X-6旋涡振荡器，海南其林贝尔产品；Spectrafuge-24D907386离心机，Labnet产品。

方法

(1)样品溶液配制：七糖化合物1及对照品均以Tris-HCl缓冲液溶解并稀释到所需的系列溶度。

(2)抗凝活性检测：45μL人质控血浆中加入5μL样品或对照品溶液混均后，按照APTT、PT和TT试剂盒说明书所述方法，以MC-4000血凝仪检测凝血时间(APTT、PT和TT)。

(3)凝血因子抑制活性分析：

Xase抑制活性分析：联用因子VIII及因子VIII检测试剂盒，参考试剂盒说明书和文献方法进行检测。具体地说，96孔板中分别加入系列浓度的30μL七糖化合物1或Tris-HCl缓冲液(阴性对照)后，加入30μL R2(Activation Reagent,60nM FIXa，含FIIa、PC/PS、Ca^{2 +})，30μL FVIII溶液(2IU/mL)置于酶标仪中，振板混匀并于37℃孵育2min；取出96孔板，加入30μL R1(50nM FX，含直接凝血酶抑制剂)，置于酶标仪中，振板混匀并于37℃精确孵育1min；取出96孔板，加入30μL R3(FXa生色底物SXa-11，约8.4mM)，置于酶标仪中，检测405nm处的吸光值(OD_405nm)，以30s为间隔连续检测5min。根据OD₄₀₅变化值计算Xase活性以及化合物1抑制Xase的IC₅₀值。

AT依赖的Xa抑制活性分析：采用肝素Anti-FXa试剂盒检测。具体的为，96孔板中分别加入系列浓度的30μL七糖化合物1或Tris-HCl缓冲液(阴性对照)后，加入30μL R1(1IU/mL AT)，置于酶标仪中振板混匀并于37℃孵育1min；加入30μL R2(8μg/mL FⅩa溶液)，置于酶标仪中振板混匀并于37℃精确孵育1min；最后加入30μL预热的R3(1.25mM FXa特异性生色底物SXa-11)，酶标仪检测405nm处的吸光值(OD_405nm)，以30s为间隔连续检测5min；并计算化合物1抑制Xa的IC₅₀值。

AT依赖的IIa抑制活性分析：采用肝素Anti-FIIa试剂盒检测。96孔板中各孔分别加入系列浓度的30μL七糖化合物1或Tris-HCl缓冲液(阴性对照)后，加入30μL R1(0.25IU/mL AT)，振板混匀并于37℃孵育1min；取出96孔板，加入30μL R2(24IU/mL FⅡa溶液)，振板混匀并于37℃精确孵育1min；最后加入30μL预热的R3(1.25mM FIIa特异性生色底物CS-01(38))，酶标仪检测405nm处的吸光值(OD_405nm)，以30s为间隔连续检测5min，并计算化合物1抑制IIa的IC₅₀值。

数据处理：取复孔检测的OD₄₀₅均值作为各浓度受试品和对照品的检测值，以检测值对时间值的线性拟合的斜率(吸光值的变化率OD₄₀₅/min)表示凝血因子的酶活性；以阴性对照孔的凝血因子活性为100％，计算受试样品存在下的凝血因子活性(百分比)；以受试样品存在下的凝血因子活性对受试样品浓度作图，并按下式进行拟合，计算IC₅₀值 ：B＝(IC₅₀)ⁿ/{(IC₅₀)ⁿ+[I]ⁿ}，式中，B为受试样品存在下的凝血因子活性(百分比)，[I]为受试样品浓度，IC₅₀为半数抑制浓度(抑制50％活性所需受试样品浓度)，n为Hill系数。

图5示出了倍增APTT延长活性结果。图6示出了本申请实施例1制备得到的化合物对内源性因子Xase的抑制活性。

结果

抗凝活性研究显示，本申请实施例1得到的七糖化合物1具有显著的APTT延长活性，其倍增APTT所需浓度为90.45μg/mL，而不影响PT、TT，说明其可具有显著的抑制内源性凝血途径的抗凝血活性，而对外源性凝血无显著影响。

对凝血因子抑制活性研究显示，化合物1对因子Xase有显著的抑制活性(IC₅₀，397.9±57.5nM)；在抗凝血酶(AT)存在下，对凝血因子IIa、Xa无显著影响。

采用与以上所述相同的检测方法，实施例3所制化合物对因子Xase同样显示出强效抑制活性，其IC₅₀值为420.5±60.3nM；在抗凝血酶(AT-III)存在下，对凝血因子IIa、Xa无显著影响。

试验例2

本试验例主要测试实施例1提供的寡糖化合物(化合物1)抗血栓活性及出血影响。

材料

样品：七糖化合物1

对照品：依诺肝素钠注射液(LMWH，Mw 3500～5500Da，赛诺菲-安万特产品)；

试剂：水合氯醛(水合三氯乙醛)，国药集团化学试剂有限公司；生理盐水，昆明南疆制药有限公司。

实验动物：SD大鼠，250～350g体重，雄性，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号SCXK(湘)2016-0002；昆明种小鼠，18～22g体重，雄性，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号SCXK(湘)2016-0002；新西兰兔由昆明医科大学提供，SCXK(滇)2011-0004，用于制作兔脑粉浸出液。

方法

抗静脉血栓形成实验

分组与给药：大鼠随机分为5组，每组5只。实验分组及各组动物的给药剂量为：(1)生理盐水(NS)对照组；(2)LMWH 3.6mg/kg组；(3)七糖化合物1 4.8mg/kg组；(4)七糖化合物1 8.0mg/kg组；(5)七糖化合物1 13.6mg/kg组。各组大鼠经背部皮下注射(sc.)给药，给药体积均为1mL/kg。给药1h后进行造模实验。

兔脑粉浸出液制备：新西兰兔处死后，立即取出兔脑，按文献方法(ThrombHaemost,2010,103(5):994-1004)制备兔脑粉浸出液，-20℃下储存备用。

兔脑粉浸出液诱导下腔静脉血栓形成：大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉(300mg/kg)，沿腹中线纵向剪开腹壁，移开内脏，分离下腔静脉及其分支，于下腔静脉的左肾静脉下缘穿过结扎线，结扎左肾静脉之下的下腔静脉分支。股静脉注射2％兔脑粉浸出液(1mL/kg)，20秒后，结扎左肾静脉下缘结扎线。术后将内脏放回腹腔，医用纱布(生理盐水浸润)覆盖，20min后，在结扎线下2cm处用止血钳夹闭血管，纵向剖开血管，取出血栓，测量血栓长度并称量血栓湿重，50℃干燥24h后称取干重。

数据处理与统计：应用SPSS软件整理、分析数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。不同组的数据正态性检验采用One-Sample K-S检验，方差齐性检验采用Levene检验，若数据符合正态分布，方差齐，则应用One-Way ANOVA判断其显著性，反之则采用Two-Independent-Samples Test判断其显著性。

出血倾向检测

分组与给药：小鼠随机分为3组，每组4只。实验分组及各组动物的给药剂量为：(1)生理盐水(NS)对照组；(2)LMWH 36mg/kg组；(3)七糖化合物1 80mg/kg组。各组小鼠经背部皮下注射(sc.)给药，给药体积均为10mL/kg。

试验方法：各实验组皮下给药60min后，将小鼠置于小鼠固定器中，剪尾法剪去尾尖5mm，将鼠尾浸入盛有40mL纯净水(37℃)的烧杯中，从剪断鼠尾流出第1滴血起开始计时，并不停搅拌，60min时，取下烧杯放置60min后，紫外分光光度计检测溶液吸光度(OD₅₄₀)。

另取健康小鼠全血，以不同体积小鼠全血加入40mL纯净水中，搅拌均匀后静置60min，同法检测溶液吸光度(OD₅₄₀)并绘制体积-吸光度曲线作为计算出血量的标准曲线。以标准曲线计算各实验组小鼠的出血量。

数据处理与统计：应用SPSS软件整理、分析数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。不同组的数据正态性检验采用One-Sample K-S检验，方差齐性检验采用Levene检验，若数据符合正态分布，方差齐，则应用One-Way ANOVA判断其显著性，反之则采用Two-Independent-Samples Test判断其显著性。

结果

(1)抗血栓活性：如附图7所示，结果表明，实验剂量下的化合物1均具有显著的抗血栓活性，在4.8mg/kg～13.6mg/kg下，其血栓形成抑制率均可达到80％以上。

(2)出血影响：如附图8所示，等效抗血栓剂量的等倍数高剂量给药下，寡糖化合物1的出血量显著低于LMWH给药组。

综上可以看出：本申请制备得到的化合物有强效抑制iXase活性,具有显著的低出血倾向的抗血栓活性。

以上所述仅为本申请的优选实施而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。