阅读说明：本技术 一种荷叶多糖的提取方法 (Method for extracting lotus leaf polysaccharide ) 是由 俞保彬 张治国 曾静 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及植物提取技术领域,具体公开了一种荷叶多糖的提取方法。本发明所述提取方法先对荷叶加水提取,然后将水提取液用纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶组成的复合酶进行酶提取,获得多糖提取液；多糖提取液醇沉、除蛋白、脱色后,获得荷叶多糖。本发明采用由纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶组成的复合酶辅助水提取法提取荷叶多糖,在保证荷叶多糖高收率的同时,提高荷叶多糖的含量,同时保证荷叶多糖还含有较高的多糖、总黄酮等活性物质,同时还表现出较高的免疫活性,研究出一条简洁、高效、合理的提取高活性荷叶多糖的工艺路线,可为其规模化生产、高值化利用奠定基础。(The invention relates to the technical field of plant extraction, and particularly discloses a method for extracting lotus leaf polysaccharide. The extraction method comprises the steps of firstly adding water into lotus leaves for extraction, and then carrying out enzyme extraction on a water extracting solution by using a complex enzyme consisting of cellulase, bromelain and pectinase to obtain a polysaccharide extracting solution; precipitating the polysaccharide extract with ethanol, removing protein, and decolorizing to obtain folium Nelumbinis polysaccharide. The invention adopts a complex enzyme-assisted water extraction method consisting of cellulase, bromelain and pectinase to extract the lotus leaf polysaccharide, improves the content of the lotus leaf polysaccharide while ensuring the high yield of the lotus leaf polysaccharide, ensures that the lotus leaf polysaccharide also contains higher active substances such as polysaccharide, total flavone and the like, and simultaneously shows higher immunocompetence, researches a simple, efficient and reasonable process route for extracting the high-activity lotus leaf polysaccharide, and can lay a foundation for large-scale production and high-valued utilization of the lotus leaf polysaccharide.)

一种荷叶多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，更具体的说是涉及一种荷叶多糖的提取方法。

背景技术

荷叶是睡莲科植物莲的叶片，属多年生草本植物，是我国传统的中药材之一。荷叶中含有多糖、黄酮、生物碱等多种生物活性成分。传统医学认为荷叶性味苦寒，具有清暑利湿、生发清阳、清心去热、止血利水的活性。据《本草纲目》记载：“荷叶服之，令人瘦劣”，“生发元气、裨助脾胃、涩精浊、散瘀血、消肿瘤、发痘疮”。现代药理研究表明荷叶具有抗氧化、抗衰老、降脂减肥、抑制脂肪肝、抑菌、抑制HIV增殖、抗病毒、抗炎、抗过敏等作用。

荷叶多糖是荷叶中重要的生物活性成分，但我国对荷叶多糖的开发相对落后，大部分产品只能达到保健品的要求，高纯度荷叶多糖的制备、应用仍处于研究阶段。热水浸提法是传统的荷叶多糖提取方法，该方法收率低、耗能高。因此，开发高活性荷叶多糖提取工艺具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荷叶多糖的提取方法，使得所述提取方法能够获得高收率的荷叶多糖；

本发明的另外一个目的在于提供一种荷叶多糖的提取方法，使得所述提取方法能够获得高含量的荷叶多糖；

本发明的另外一个目的在于提供一种荷叶多糖的提取方法，使得所述提取方法能够获得高免疫活性的荷叶多糖；

本发明的另外一个目的在于提供一种荷叶多糖的提取方法，使得所述提取方法能够获得有较高多肽含量的荷叶多糖；

本发明的另外一个目的在于提供一种荷叶多糖的提取方法，使得所述提取方法能够获得有较高总黄酮含量的荷叶多糖；

本发明的另外一个目的在于提供一种荷叶多糖的提取方法，使得所述提取方法能够同时获得具备以上各项有益效果的荷叶多糖；

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种荷叶多糖的提取方法，包括：

步骤1、荷叶加水提取，获得水提取液；

步骤2、将水提取液用纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶组成的复合酶进行酶提取，获得多糖提取液；

步骤3、多糖提取液醇沉、除蛋白、脱色后，获得荷叶多糖。

本发明采用酶辅助提取法提取荷叶多糖，在保证荷叶多糖活性的同时降低耗能、提高收率，针对我国荷叶经济价值高、利用率低的现状提出了一条新的开发思路，研究出一条简洁、高效、合理的提取高活性荷叶多糖的工艺路线，可为其规模化生产、高值化利用奠定基础。

其中，步骤1的水提步骤可参照当前的荷叶多糖的水提法，具体参数可视实际情形而有所不同；作为优选，本发明步骤1中水和荷叶的液固比为20:1～40:1(mL:g)，具体可选择为20:1、30:1或40:1的液固比；水提温度优选为60～100℃，在本发明

具体实施方式

中为75℃；水提时间可按照实际需求调整，一般为1.5～3小时。

作为优选，所述纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶的质量比为(1～5):(1～4):(1～4)；在该范围下，所述纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶的质量比为(1～3):(1～4):(1～4)或(3～5):(1～4):(1～4)；在本发明具体实施方式中，所述纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶的质量比为3:4:4、1:1:1:或5:1:1。

作为优选，所述复合酶总添加量为水提取液0.2～0.6％，在本发明具体实施方式中为0.2％、0.4％或0.6％。

本发明步骤2的酶提取通常选择复合酶的最适提取温度，一般为30～60℃，更优选为45-55℃；所述酶提取时间一般为1-4h或更长，优选为3-4h，在本发明具体实施方式中可提取3h、3.5h或4h。酶提取后一般都会进行高温灭酶，根据需要还可进行浓缩。

本发明步骤3中的醇沉通常为植物多糖提取领域中所理解的醇沉，一般采用乙醇对多糖提取液进行醇沉获得沉淀物质，在本发明中给出了示例性质的醇沉操作：多糖提取液加入3～5倍体积的浓度为92～96％的乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀。

步骤3中除蛋白优选采用sevag法除蛋白，具体操作如下：

醇沉所得沉淀加入一定量纯化水，复溶得多糖水溶液。按多糖水溶液1/5体积加入4:1的氯仿-正丁醇和适量蛋白质水解酶。混合物剧烈震荡20min～30min，分离脂溶性物质和溶剂层交界处的变性蛋白质。重复多次直至两相交界处无变性蛋白质完成样品脱蛋白。

步骤3中所述脱色优选采用活性炭脱色，在本发明中给出了示例性质的醇沉操作：取溶液体积20～30％的活性炭倒入提取液中，搅拌均匀后，放于80～82℃恒温水浴锅中保温30～45分钟，趁热抽滤后将滤液冷却至室温。

经过醇沉、脱蛋白和脱色后的荷叶多糖为溶液状态，可以采用冻干的方法干燥成固体。

本发明提取工艺在保证其他提取步骤一致的前提下，对比了仅采用纤维素酶和采用由纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶组成的复合酶的提取工艺，结果显示，本发明提取方法所获得的荷叶多糖同时在收率、总多糖含量、多肽含量、总黄酮含量以及免疫活性上优于两个对照工艺。

此外，本发明提取方法所获得的荷叶多糖经过抗氧化能力的测定，证明其对羟基自由基和DPPH的均有较好的清除能力，具备较强的抗氧化性。

由以上技术方案可知，本发明采用由纤维素酶、菠萝蛋白酶和果胶酶组成的复合酶辅助水提取法提取荷叶多糖，在保证荷叶多糖高收率的同时，提高荷叶多糖的含量，同时保证荷叶多糖还含有较高的多糖、总黄酮等活性物质，同时还表现出较高的免疫活性，研究出一条简洁、高效、合理的提取高活性荷叶多糖的工艺路线，可为其规模化生产、高值化利用奠定基础。

具体实施方式

本发明公开了一种荷叶多糖的提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述提取方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述提取方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，所提供的对比试验各处理组所采用的原料均相同，且各组除去应有的区别外其他试验条件保持一致。

本发明所涉及原料、试剂和酶，如无特殊说明均可通过市售途径获得。

本发明关于收率、总多糖含量、多肽含量、总黄酮含量以及免疫活性的分析方法参照如下：

1、T细胞活性测定法—脱E受体法测试免疫活性

试剂(1)Hank's液：取0.3％磷酸二氢钾溶液，0.76％磷酸氢二钠溶液，2％氯化钾溶液及20％氯化钠溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖1g，溶解混匀，用水稀释至1000ml，并用4％碳酸氢钠溶液调节PH值至7.2～7.3(临用时配制)。

(2)阿氏液：取氯化钠0.420g，枸缘酸0.055g，枸缘酸钠0.766g葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100ml，灭菌。

(3)分离液：为淋巴细胞分离液。

(4)羊血：取绵羊静脉血5ml,加入5ml阿氏液中，冰箱保存。

(5)固定液：取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氢钠溶液及)Hank's液依次按1:1:38比例混合。(6)姬姆萨染色液原液：取姬姆萨染料0.5g，加甘油33ml。55～60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温,加入33ml甲醇，室温放置24小时后，用滤纸过滤，滤液即为原液。密封室温保存。

(7)染色液：取姬姆萨染色液原液2ml，加Hank's液6ml，摇匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液待用。

操作法(1)脱E受体胸腺T细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank's液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，加入少量Hank's液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank's洗涤液，摇匀，以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank's液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)。以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，再加入适量Hank's液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，用Hank's液洗涤3次，(操作同前)，最后用Hank's液适当稀释并计数，使最终浓度为每ml中(3×10⁶)～(5×10⁵)个细胞。

(2)绵羊红血球悬液的制备：取适量羊血，用适量Hank's液洗3次(同前)。弃去上清液，加适量Hank's液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的8～10倍。

(3)供试品溶液的制备：取供试品，用Hank's液配制成每1ml中含1mg的溶液。

(4)测定方法：取小试管6支，其中3支各加Hank's液0.1ml作对照管，另3支各加供试品溶液0.1ml作测试管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2ml。37℃保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)。求得结花百分率，取平均值。即为供试品管或对照管的平均值。

样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率-对照管E玫瑰花结百分率

2、苯酚-硫酸法测总多糖

苯酚溶液：将苯酚溶剂在45℃水浴中溶解，准确称取6g置于100ml容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。

对照品溶液的配制：取葡萄糖对照品适量，加水制成1.0mg/ml的溶液，取10ml上述溶液置100ml容量瓶中，制成0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。

标准曲线的制备：精密量取标准品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，至20ml玻璃比色管中，用蒸馏水补至1.0ml，然后加入1ml苯酚溶液，快速加入5ml硫酸，静置10min，然后将比色管置于30℃水浴中反应20min。

供试品溶液制备：取样品适量稀释，吸光度控制在0.3-0.7之间，置适宜容量瓶中，加水超声溶解并定容至刻度,混匀过滤后备用，同标准溶液法处理。

测定：以水作为随行空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在490nm处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算荷叶提取物中多糖的含量。

3、福林酚法测多肽含量

对照品溶液的配制：取牛血清白蛋白对照品20mg,精密称定，置于100ml容量瓶中，加水溶解并定容制成每1mL中含0.2mg的对照品溶液。

标准曲线的制备：精密量取标准品溶液0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具塞试管中，用蒸馏水补至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1ml，混合均匀，分别各加入福林酚试液4mL，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冰水浴反应10分钟，室温静置10min。

供试品溶液制备：取样品适量稀释，吸光度控制在0.3-0.7之间，同标准溶液法处理，备用。

测定：以水为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在650nm处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算荷叶提取物中多肽的含量。

4、对羟基自由基的清除率功能研究

(1)反应机理

采用Fenton反应模型检测清除·OH的能力。Fenton反应是根据·OH反应活性高、存活时问短的特点，以H₂O₂与Fe²⁺混合产生·OH，在体系中加入水杨酸，水杨酸可以有效捕捉·OH，并且产生有色物质，此物质在510hm处有最大吸收。当体系中存在具有清除·OH功效的物质时，其与水杨酸竞争·OH，从而导致有色物质的生成量减少，溶液的颜色随之变浅，因此可以通过检测样品吸光值计算该物质对·OH的清除能力。

(2)研究方法

依次向试管中加入1mL FeSO₄溶液1mL水杨酸一乙醇溶液和3mL不同浓度样液，最后加入lmL H₂O₂启动反应，37℃下反应30min，510nm处测吸光度。根据下式计算荷叶多糖对·OH清除率：

其中，A₀为空白对照液的吸光度，A_i为加入样品后的吸光度，A_j为样品溶液的本底吸光度。

5、对DPPH自由基的清除率功能研究

(1)反应机理

DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)是一种稳定的、以氮为中心的自由基，其稳定性主要来自于共振稳定作用的三个苯环的空间障碍，使位于中间的氮原子上不成对的电子不能发挥出应有的电子成对作用。由于苯环的空间障碍使中心氮原子带有单电子，此单电子在517nm左右有强吸收，可使溶液呈深紫色。当DPPH与具有抗氧化活性的物质相遇时，DPPH的单电子就会发生配对，配对后的单电子在517nm处的吸收减弱甚至消失，导致溶液颜色变浅，变浅的程度与DPPH自由基所配对的电子数成定量关系。因此，可以采用分光光度法对某物质清除DPPH自由基的清除率进行定量分析。

(2)研究方法

分别移取不同浓度的样液2mL，加入2mL DPPH溶液，混匀后，在黑暗中放置30min，517nm处测量溶液的吸光度。样品对DPPH自由基的清除率根据下式计算：

其中，A₀为蒸馏水加DPPH溶液的吸光度；A_s为样液加DPPH溶液的吸光度；A_b为样液加乙醇溶剂的吸光度。

6、收率(％)

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明荷叶多糖的提取方法

步骤1：荷叶原料预处理以及水提：

①将优质荷叶经电热恒温鼓风干燥箱中40℃烘干48h，经粉碎机粉碎，过200目筛备用；

②称取1公斤的荷叶粉末，按液固比20:1加入纯化水，75℃条件下提取1.5小时；

步骤2：酶提取

在步骤1所得水提溶液中加入复合酶，控制温度在45℃，边搅拌边反应3小时,然后升温至90～95℃灭酶15min，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩的多糖提取液；

步骤3：醇沉、脱蛋白和脱色

多糖提取液加入3倍体积的浓度为92～96％的乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀；

所得沉淀加入一定量纯化水，复溶得多糖水溶液。按多糖水溶液1/5体积加入4:1的氯仿-正丁醇和适量蛋白质水解酶。混合物剧烈震荡20min～30min，分离脂溶性物质和溶剂层交界处的变性蛋白质。重复多次直至两相交界处无变性蛋白质完成样品脱蛋白。

量取溶液体积20～30％的活性炭倒入提取液中，搅拌均匀后，放于80～82℃恒温水浴锅中保温30～45分钟，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；

步骤4：冷冻干燥

步骤3所得滤液倒入冷冻盘中，并放于冰箱中冷冻12～24小时，冷冻结实后置于冷冻干燥机中干燥即得荷叶多糖。

其中，步骤2中，加入的复合酶为纤维素酶、菠萝蛋白酶、果胶酶复合酶(添加质量比为3:4:4)，酶添加量为提取液0.2％。

实施例2：本发明荷叶多糖的提取方法

步骤1：荷叶原料预处理以及水提：

①将优质荷叶经电热恒温鼓风干燥箱中40℃烘干48h，经粉碎机粉碎，过200目筛备用；

②称取1公斤的荷叶粉末，按液固比30:1加入纯化水，75℃条件下提取2小时；

步骤2：酶提取

在步骤1所得水提溶液中加入复合酶，控制温度在50℃，边搅拌边反应3.5小时,然后升温至90～95℃灭酶15min，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩的多糖提取液；

步骤3：醇沉、脱蛋白和脱色

多糖提取液加入4倍体积的浓度为92～96％的乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀；

所得沉淀加入一定量纯化水，复溶得多糖水溶液。按多糖水溶液1/5体积加入4:1的氯仿-正丁醇和适量蛋白质水解酶。混合物剧烈震荡20min～30min，分离脂溶性物质和溶剂层交界处的变性蛋白质。重复多次直至两相交界处无变性蛋白质完成样品脱蛋白。

量取溶液体积20～30％的活性炭倒入提取液中，搅拌均匀后，放于80～82℃恒温水浴锅中保温30～45分钟，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；

步骤4：冷冻干燥

步骤3所得滤液倒入冷冻盘中，并放于冰箱中冷冻12～24小时，冷冻结实后置于冷冻干燥机中干燥即得荷叶多糖。

其中，步骤2中，加入的复合酶为纤维素酶、菠萝蛋白酶、果胶酶复合酶(添加质量比为1:1:1)，酶添加量为提取液0.4％。

实施例3：本发明荷叶多糖的提取方法

步骤1：荷叶原料预处理以及水提：

①将优质荷叶经电热恒温鼓风干燥箱中40℃烘干48h，经粉碎机粉碎，过200目筛备用；

②称取1公斤的荷叶粉末，按液固比40:1加入纯化水，75℃条件下提取3小时；

步骤2：酶提取

在步骤1所得水提溶液中加入复合酶，控制温度在55℃，边搅拌边反应4小时,然后升温至90～95℃灭酶15min，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩的多糖提取液；

步骤3：醇沉、脱蛋白和脱色

多糖提取液加入5倍体积的浓度为92～96％的乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀；

所得沉淀加入一定量纯化水，复溶得多糖水溶液。按多糖水溶液1/5体积加入4:1的氯仿-正丁醇和适量蛋白质水解酶。混合物剧烈震荡20min～30min，分离脂溶性物质和溶剂层交界处的变性蛋白质。重复多次直至两相交界处无变性蛋白质完成样品脱蛋白。

量取溶液体积20～30％的活性炭倒入提取液中，搅拌均匀后，放于80～82℃恒温水浴锅中保温30～45分钟，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；

步骤4：冷冻干燥

步骤3所得滤液倒入冷冻盘中，并放于冰箱中冷冻12～24小时，冷冻结实后置于冷冻干燥机中干燥即得荷叶多糖。

其中，步骤2中，加入的复合酶为纤维素酶、菠萝蛋白酶、果胶酶复合酶(添加质量比为5:1:1)，酶添加量为提取液0.6％。

对比例1：纤维素酶酶解提取荷叶多糖的提取方法

步骤1：荷叶原料预处理以及水提：

①将优质荷叶经电热恒温鼓风干燥箱中40℃烘干48h，经粉碎机粉碎，过200目筛备用；

②称取1公斤的荷叶粉末，按液固比20:1加入纯化水，75℃条件下提取1.5小时；

步骤2：酶提取

在步骤1所得水提溶液中加入纤维素酶，控制温度在45℃，边搅拌边反应3小时，然后升温至90～95℃灭酶15min，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩的多糖提取液；

步骤3：醇沉、脱蛋白和脱色

多糖提取液加入3倍体积的浓度为92～96％的乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀；

所得沉淀加入一定量纯化水，复溶得多糖水溶液。按多糖水溶液1/5体积加入4:1的氯仿-正丁醇和适量蛋白质水解酶。混合物剧烈震荡20min～30min，分离脂溶性物质和溶剂层交界处的变性蛋白质。重复多次直至两相交界处无变性蛋白质完成样品脱蛋白。

量取溶液体积20～30％的活性炭倒入提取液中，搅拌均匀后，放于80～82℃恒温水浴锅中保温30～45分钟，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；

步骤4：冷冻干燥

步骤3所得滤液倒入冷冻盘中，并放于冰箱中冷冻12～24小时，冷冻结实后置于冷冻干燥机中干燥即得荷叶多糖。

其中，步骤2中，纤维素酶同实施例1-3，添加量为提取液0.2％。

对比例2：纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶酶解提取荷叶多糖的提取方法

步骤1：荷叶原料预处理以及水提：

①将优质荷叶经电热恒温鼓风干燥箱中40℃烘干48h，经粉碎机粉碎，过200目筛备用；

②称取1公斤的荷叶粉末，按液固比20:1加入纯化水，75℃条件下提取1.5小时；

步骤2：酶提取

在步骤1所得水提溶液中加入复合酶，控制温度在45℃，边搅拌边反应3小时,然后升温至90～95℃灭酶15min，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩的多糖提取液；

步骤3：醇沉、脱蛋白和脱色

多糖提取液加入3倍体积的浓度为92～96％的乙醇，4℃放置12h，离心收集沉淀；

所得沉淀加入一定量纯化水，复溶得多糖水溶液。按多糖水溶液1/5体积加入4:1的氯仿-正丁醇和适量蛋白质水解酶。混合物剧烈震荡20min～30min，分离脂溶性物质和溶剂层交界处的变性蛋白质。重复多次直至两相交界处无变性蛋白质完成样品脱蛋白。

量取溶液体积20～30％的活性炭倒入提取液中，搅拌均匀后，放于80～82℃恒温水浴锅中保温30～45分钟，趁热抽滤后将滤液冷却至室温；

步骤4：冷冻干燥

步骤3所得滤液倒入冷冻盘中，并放于冰箱中冷冻12～24小时，冷冻结实后置于冷冻干燥机中干燥即得荷叶多糖。

其中，步骤2中，加入的复合酶为纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶复合酶(添加质量比为3:4:4)，酶添加量为提取液0.2％，纤维素酶和果胶酶同实施例1-3。

实施例4：各项指标的对比

将实施例1-3和对比例1-2所提取的荷叶多糖按照表1项目进行检测，结果见表1。

表1

由表1可以看出，相比较两个对比例，本发明提取方法获得荷叶多糖能够同时在收率、总多糖含量、多肽含量、总黄酮含量以及免疫活性上优于两个对照工艺。

实施例5：本发明提取方法获得的荷叶多糖的抗氧化研究

1、对羟基自由基的清除

表2

2、对DPPH自由基的清除

表3

由表2和表3的结果可以看出，本发明提取方法所获得的荷叶多糖对羟基自由基和DPPH的均有较好的清除能力，具备较强的抗氧化性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。