阅读说明：本技术 一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用 (Method for extracting chondroitin sulfate, chondroitin sulfate and application thereof ) 是由 赵元晖 王康宇 曾名湧 高瑞昌 白帆 汪金林 李钰金 薛长湖 毛相朝 薛勇 陈泽 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于硫酸软骨素提取技术领域,公开了一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用,将鱼头软骨粉碎至颗粒状并晾干除去多余的水分作为蒸汽爆破原料,将部分软骨放于冻干机中冻干作为优化酶解工艺的原料并得到最优酶解工艺；干基汽爆鱼骨按照1：60料液比加入蒸馏水后加入1.2％的复合中性蛋白酶在55℃酶解4.5h；将酶解液放于90℃水浴10min后5000r/min离心10min,取上清液抽滤过滤纸和0.45μm滤膜除去大分子杂质,使用10kDa超滤膜重复循环分离6次得到硫酸软骨素和胶原蛋白肽,将所得溶液旋转蒸发除去多余的水分,再冻干得到产品。本发明是绿色无污染工艺,完全没有引入酸碱盐和使用乙醇,降低了生产成本。(The invention belongs to the technical field of chondroitin sulfate extraction, and discloses a method for extracting chondroitin sulfate, chondroitin sulfate and application thereof, wherein fishhead cartilage powder is crushed into particles and dried to remove redundant moisture to be used as a steam explosion raw material, and part of cartilage is put in a freeze dryer to be freeze-dried to be used as a raw material for optimizing an enzymolysis process, so that an optimal enzymolysis process is obtained; the dry-based steam-exploded fishbone is prepared according to the following steps of 1: adding distilled water according to the ratio of 60 materials to liquid, adding 1.2% of compound neutral protease, and performing enzymolysis at 55 deg.C for 4.5 h; placing the enzymatic hydrolysate in a 90 ℃ water bath for 10min, centrifuging for 10min at a speed of 5000r/min, taking supernate, filtering filter paper and a 0.45 mu m filter membrane to remove macromolecular impurities, repeatedly and circularly separating for 6 times by using a 10kDa ultrafiltration membrane to obtain chondroitin sulfate and collagen peptide, performing rotary evaporation on the obtained solution to remove excessive moisture, and freeze-drying to obtain the product. The invention is a green pollution-free process, and acid, alkali and salt are not introduced and ethanol is not used at all, so that the production cost is reduced.)

一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用

技术领域

本发明属于硫酸软骨素提取技术领域，尤其涉及一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用。

背景技术

目前硫酸软骨素生产的方法主要有三种：盐解法、碱解法和酶解法，国内使用较多的方法是采用稀碱或浓碱与酶解相结合的方法来提取硫酸软骨素，传统工艺是：软骨蒸煮→碱提取→酶水解→双氧水脱色→酒精沉淀→精制→硫酸软骨素成品，采用这种碱法酶解生产工艺存在步骤繁琐、周期较长，一般需要3-5天，产品质量和收率不稳定，在高温蒸煮、碱提取、酶解和脱色过程中，硫酸软骨素受到严重破坏，产品收率偏低、溶液颜色加深、乙醇耗量大、破坏环境和生产成本高、产生大量的盐需要除盐，延长了生产时间造成了环境污染。因此我们需要改进传统工艺生产，避免环境污染、降低生产成本、减少资源浪费、提高生产效率，实现绿色环保经济便捷的生产。

根据以上对现有技术的分析，存在的问题及缺陷为：

(1)传统工艺提取硫酸软骨素的方法存在加入酸碱试剂造成环境污染。

(2)传统工艺提取硫酸软骨素的方法存在生产工艺中醇沉的工艺使用大量高纯度的乙醇增加生产成本资源浪费。

解决以上问题及缺陷的难度为：酶解的目的是将蛋白质变为多肽将硫酸软骨素暴露出来，但是由于硫酸软骨素是一种糖胺聚糖，多糖与蛋白通过O-糖苷键与蛋白相连而蛋白酶很难断裂这种糖苷键，因此加入稀碱有利于糖苷键的断裂，而不引入碱液对硫酸软骨素的纯度影响很大；利用硫酸软骨素不溶于乙醇的原理来纯化硫酸软骨素避免了引入小分子多肽，有利于提高硫酸软骨素纯度。

解决以上问题及缺陷的意义为：避免引入酸碱盐，有利于保护环境绿色生产；不采用醇沉工艺可以降低生产成本，减少生产时间提高生产效率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用。

本发明是这样实现的，一种提取硫酸软骨素的方法，所述提取硫酸软骨素的方法包括：

第一步，将鱼头软骨粉碎至颗粒状并晾干除去多余的水分作为蒸汽爆破原料，将部分软骨放于冻干机中冻干作为酶解的原料；

第二步，干基鱼骨按照1：60料液比加入蒸馏水后加入1.2％的复合中性蛋白酶在55℃酶解4.5h。；

第三步，将酶解液放于90℃水浴10min后5000r/min离心10min，取上清液抽滤过滤纸和0.45μm滤膜除去大分子杂质，使用10kDa超滤膜重复循环分离6次得到硫酸软骨素和胶原蛋白肽，将所得溶液旋转蒸发除去多余的水分，再冻干得到产品。

进一步，所述第一步取鲟鱼的加工下脚料-鱼头，放入到水中，沸水加热10min，用水将鱼头多余的部分洗去得到头骨，将鱼头软骨粉碎至颗粒状并晾干除去多余的水分作为蒸汽爆破原料，将部分软骨放于冻干机中冻干作为酶解参数优化的原料。

进一步，所述提取硫酸软骨素的酶解工艺：料液比：1：60；酶添加量：1.2％(干基鱼骨)；酶解温度：55℃；酶解时间：4.5h。通过优化酶解条件达到最大水解度可以尽可能降低多肽的分子量，一方面有利于硫酸软骨素与胶原蛋白肽的分离，另一方面有利于增加小分子胶原蛋白肽的产量提高多肽的品质。

进一步，所述提取硫酸软骨素的方法汽爆：1.3Mpa处理180s。通过蒸汽爆破技术的处理可以实现通过物理方法代替化学方法来断裂O-糖苷键的工艺，以达到不添加酸碱盐的目的有利于保护环境绿色生产。

进一步，所述提取硫酸软骨素的方法酶解后经5000r/min离心10min过滤纸后过0.45μm滤膜用10kDa超滤膜离。通过一系列的膜分离可以分离不溶物，达到一定的脱色目的并实现胶原蛋白肽和硫酸软骨素的联产，以此来替代醇沉步骤可以降低生产成本，减少生产时间提高生产效率。

本发明的另一目的在于提供一种由所述提取硫酸软骨素的方法提取的硫酸软骨素。

本发明的另一目的在于提供一种所述硫酸软骨素在治疗关节疾病的药品中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种所述硫酸软骨素在抗凝和抗血栓形成药品中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种所述硫酸软骨素在治疗冠心病中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种所述硫酸软骨素在食品中添加剂的用途。

本发明的另一目的在于提供一种所述硫酸软骨素在增强人体体质及抗病菌、美容、抗衰老保健品中的用途。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明是一种绿色无污染的工艺，其次使用鲟鱼生产废弃物—头骨作为生产原料降低了生产成本；完全没有引入酸碱盐和使用乙醇，不需要采用透析的方法除杂也不会造成环境的破坏同时也降低了生产成本；采用高效和简易的超滤方法进行纯化，实现了硫酸软骨素和胶原蛋白肽的联合生产模式。

附图说明

图1是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的方法的实现流程图。

图3是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的不同条件汽爆处理后鱼骨的扫描电镜和骨液化率示意图。

图4是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的红外图谱。

图5是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的分离多肽的分子量和红外图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的方法包括以下步骤：

S101：将鱼头软骨粉碎至颗粒状并晾干除去多余的水分作为蒸汽爆破原料，将部分软骨放于冻干机中冻干作为酶解的原料；

S102：干基鱼骨按照1：60料液比加入1.2％的复合中性蛋白酶在55℃酶解4.5h。

S103：将酶解液放于90℃水浴10min后5000r/min离心10min，取上清液抽滤过滤纸和0.45μm滤膜除去大分子杂质，使用10kDa超滤膜重复循环分离6次得到硫酸软骨素和胶原蛋白肽，将所得溶液旋转蒸发除去多余的水分，再将其冻干得到产品。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的方法具体包括以下步骤：

第一步，原料预处理：取鲟鱼的加工下脚料-鱼头，放入到一定体积的水中，沸水加热10min，用水将鱼头多余的部分洗去得到头骨，将鱼头软骨粉碎至颗粒状并晾干除去多余的水分作为蒸汽爆破原料，将部分软骨放于冻干机中冻干作为酶解参数优化的原料。

第二步，酶解参数优化：采用单因素的方法优化酶解参数，优化条件分别为料液比、酶添加量、酶解时间、酶解温度，方案如下：以料液比、酶添加量、酶解时间、酶解温度分别为1：20、0.8％、3h、50℃作为酶解条件的基础进行优化，首先改变料液比分别为1：20、1：40、1：60、1：80、1：100使用OPA法测定蛋白水解度确定最佳料液比；改变酶添加量分别为0.4％、0.8％、1.2％、1.6％使用OPA法测定蛋白水解度确定最佳酶添加量；改变酶解时间分别为3h、4.5h、6h使用OPA法测定蛋白水解度确定最佳酶解时间；改变酶解温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃使用OPA法测定蛋白水解度确定最佳酶解温度。经过测定得到最佳酶解条件为干基鱼骨按照1：60料液比加入1.2％的复合中性蛋白酶在55℃酶解4.5h。

第三步，蒸汽爆破参数优化：采用单因素的方法优化汽爆参数，取鱼骨颗粒放入鹤壁市正道生物能源公司生产的汽爆设备QBS-80SE中分别在1、1.3、1.45、1.6MPa的条件下处理120s、150s、180s、210s、240s，收集汽爆处理过的软骨溶液进行冻干处理在最有酶解参数下进行酶解，将酶解液放于90℃水浴10min后5000r/min离心10min，取上清液抽滤过滤纸和0.45μm滤膜除去大分子杂质，使用10kDa超滤膜重复循环分离6次得到硫酸软骨素(＞10kDa)和胶原蛋白肽(＜10kDa)，将所得溶液旋转蒸发除去多余的水分，再将其冻干得到产品，将硫酸软骨素的含量作为评判标准得到最优的汽爆参数。

在本发明的优选实施例中，杂交鲟“鲟龙1号”(品种登记号：GS-02-002-2016)，由中国水产科学研究院黑龙江水产研究所、杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司、中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心完成。

在本发明的优选实施例中，蒸汽爆破技术(Instant Catapult Steam Explosion，ICSE)(简称汽爆)是物理化学处理方法。蒸汽爆破技术可以提高原料利用效率，具有作用时间短、耗能低、高效无污染及适应工业化等优点。目前主要应用于农产品加工副产物提取生物活性物质，提高副产品的附加值，很少应用于动物加工副产物的处理。

在本发明的优选实施例中，软骨：采用‘鲟龙一号’生产废弃物--头骨。汽爆：1.3Mpa处理180s。酶解：酶添加量1.2％、酶解温度55℃、料液比1：60、酶解时间4.5h。超滤：酶解后经5000r/min离心10min过滤纸后过0.45μm滤膜用10kDa超滤膜离。

本发明的硫酸软骨素在医学上主要的应用途径是作为治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本改善关节问题。硫酸软骨素能够减少骨关节炎患者疼痛，改善关节功能、减少关节肿胀和积液防止膝关节和手关节部位的间隙狭窄。提供垫衬作用，缓和行动时的冲击和摩擦，能将水分吸入蛋白多糖分子内，使软骨变厚，并增加关节内的滑液量。软骨素的重要功能之一就是作为输送管道，把重要的氧供和营养素输送至关节，帮助清除关节内的废物，同时把二氧化碳和废物加以排除。由于关节软骨并无血液供应，因此所有的充氧、滋养及润滑作用皆来自滑液。

本发明的硫酸软骨素对角膜胶原纤维具有保护作用，能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除；其聚阴离子具有强的保水性，能改善眼角膜组织的水分代谢，对角膜有较强的亲和力，能在角膜表面形成一层透气保水膜，改善眼部干燥症状。通过促进基质的生成，为细胞的迁移提供构架，有利于角膜上皮细胞的迁移，从而促进角膜创伤的愈合，渗出液的吸收及炎症的消除。通过高科技深加工，可以治疗神经性头疼、三叉神经痛、冠心病、心绞痛、心肌缺氧、心脑血管疾病、关节痛、动脉粥样硬化及肝炎等症，其中CS还具有抗凝和抗血栓形成的作用，也可用于因链霉素引起的听觉障碍和肝脏功能受损的辅助治疗以及高血脂的辅助治疗。可以作为保健品、食品中的添加剂，具有增强人体体质及抗病菌、美容、抗衰老等作用。改善听力和肌肤干燥。在体内可抑制小肠对脂质和葡萄糖的吸收以达到减肥作用。CS广泛存在于人和动物软骨组织中。其药用制剂主要含有硫酸软骨素A和硫酸软骨素C两种异构体，不同品种、年龄等动物的软骨中硫酸软骨素的含量不同。其药理作用表现为：CS可以清除体内血液中的脂质和脂蛋白，清除心脏周围血管的胆固醇，防治动脉粥样硬化，并增加脂质和脂肪酸在细胞内的转换率。CS能有效地防治冠心病。对实验性动脉硬化模型具有抗动脉粥样硬化及抗致粥样斑块形成作用；增加动脉粥样硬化的冠状动脉分技或侧支循环，并能加速实验性冠状动脉硬化或栓塞所引起的心肌坏死或变性的愈合、再生和修复。

本发明的硫酸软骨素能增加细胞的信使核糖核酸(mRNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的生物合成以及具有促进细胞代谢的作用。抗凝血活性低。硫酸软骨素具有缓和的抗凝血作用，每l mg硫酸软骨素A相当于0.45U肝素的抗凝活性。这种抗凝活性并不依赖于抗凝血酶III而发挥作用，它可以通过纤维蛋白原系统而发挥抗凝血活性。硫酸软骨素还具有抗炎，加速伤口愈合和抗肿瘤等方面的作用。硫酸软骨素用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节痛、关节炎以及肩胛关节痛，腹腔手术后疼痛等。预防和治疗链霉素引起的听觉障碍以及各种噪音引起的听觉困难、耳鸣症等，效果显著。对慢性肾炎、慢性肝炎、角膜炎以及角膜溃疡等有辅助治疗作用。此外，硫酸软骨素还应用于化妆品以及外伤伤口的愈合剂等。硫酸软骨素为一种酸性粘多糖，是眼组织中的重要成份之一，具有促进角膜水分代谢和改善，适用于视疲劳，干眼症。

表1本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的产品参数

图3是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的不同条件汽爆处理后鱼骨的扫描电镜和骨液化率示意图(证明汽爆通过将鱼骨破碎提高鱼骨的液化率，有利于提高酶解效率，促进硫酸软骨素与蛋白的分离)。

图4是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的红外图谱(与标品红外图谱相比较证明所得硫酸软骨素产品结构变化不大)。

表2本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的分离多肽的氨基酸组成示意图(证明所得多肽为胶原蛋白肽)。

表2

汽爆鱼骨分离多肽的氨基酸组成

图5是本发明实施例提供的提取硫酸软骨素的分离多肽的分子量和红外图谱(证明所得多肽分子量主要在5kDa以下，属于优质的胶原蛋白肽)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。