阅读说明：本技术 一锅法生产莱鲍迪苷d的方法 (Method for producing rebaudioside D by one-pot method ) 是由 马媛媛 宋浩 洪解放 汪振洋 来庆英 张敏华 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一锅法生产莱鲍迪苷D的方法,包括如下步骤：构建能分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1,所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在pH3.5-7.8的培养基中培养重组菌1,得到培养液；在培养液中加入底物莱鲍迪苷A,加入尿苷二磷酸葡萄糖,硫酸镁或氯化镁,甲醇,反应,得到莱鲍迪苷D。本发明的一锅法生产莱鲍迪苷D在重组菌1发酵生成糖基转移酶UGT1的同时可催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷D,无需纯化UGT1和离心分离就能获得莱鲍迪苷D的。本发明的方法简单、高效、可以降低分离糖基转移酶UGT1的生产成本,可以商业化获得甜度高、口感好、高价值的莱鲍迪苷D。(The invention discloses a method for producing rebaudioside D by a one-pot method, which comprises the following steps: constructing a recombinant bacterium 1 capable of secreting and expressing glycosyltransferase UGT1, wherein the amino acid sequence of the glycosyltransferase UGT1 is shown as SEQ ID NO. 1; culturing the recombinant bacterium 1 in a culture medium with the pH value of 3.5-7.8 to obtain a culture solution; adding a substrate rebaudioside A into the culture solution, adding uridine diphosphate glucose, magnesium sulfate or magnesium chloride and methanol, and reacting to obtain rebaudioside D. The rebaudioside D produced by the one-pot method can catalyze rebaudioside A to produce rebaudioside D while the recombinant bacterium 1 is fermented to produce the glycosyltransferase UGT1, and rebaudioside D can be obtained without purifying UGT1 and performing centrifugal separation. The method is simple and efficient, can reduce the production cost of separating glycosyltransferase UGT1, and can commercially obtain rebaudioside D with high sweetness, good taste and high value.)

一锅法生产莱鲍迪苷D的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种一锅法生产莱鲍迪苷D的方法，包括构建能分泌UGT1表达的重组菌1、重组菌1的培养及无需分离纯化直接加入底物RA生成RD的方法。

背景技术

甜菊糖苷是一种从菊科草本植物甜菊叶中精提的新型天然低热量甜味剂甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，被美国食品药品监督管理局认证为安全，可应用于食品行业。莱鲍迪苷D(Rebaudioside M，RD)具有更好的口感特性，但甜菊中仅含约0.5％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的RD已引起了学者的关注。目前报道，来源甜菊的重组酶能催化RA生成RD，但产量较低、费用高。

以RA为底物、通过生物催化法可获得RD，但其生物催化过程中，目前主要有以下几种问题：(1)生物催化需要高效的糖基转移酶，在植物中糖基转移酶含量很低，远达不到实际应用的水平，而且难于分离纯化；(2)重组糖基转移酶能催化产物RD的生成、但胞内表达生产的重组酶需要离心收集菌体破胞等过程才能进行催化，步骤繁琐；(3)在反应过程中，由于热抑制作用，UGT酶的大部分活性会丧失。因此，高效生物催化获得RD需要能高效、简单、低成本的技术^[3]。

由于天然糖基转移酶产量很低，难于分离纯化。胞内表达生产糖基转移酶需要收集菌体及破胞等繁琐的过程。如果通过构建重组菌株，分泌生产糖基转移酶，采用培养重组菌培养过程中直接投料底物RA实现RD的生成，将会减少RD生成的工艺步骤、降低生产成本、是RD工业化规模生成的可行途径。

参考文献：

[1]费理文,王勇.甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成[J].食品与发酵工业,2018,44(4):1-7.

[2]杨玉凤,费理文,李建华,等.重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D[J].工业微生物,2017,47(5):1-7.

[3]王振宇，鱼红闪，金风燮.高温厌氧菌产纤维素内切酶和争葡萄糖苷酶的活性.大连轻工业学院学报，2005，24(2)，110～l14.

[4]关瑾.甜味剂的应用现状及发展前景[J].当代化工,2002,31(2):89-91.

郑建仙.功能性食品添加剂[M].北京:中国轻工业出版社,1997.

[5]唐志发.甜菊糖的崛起与发展战略[J].中国食品工业,1999,(2):52-52.

[6]胡国华.复合食品添加剂[M].北京:化学工业出版社,2006.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种一锅法生产莱鲍迪苷D的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一锅法生产莱鲍迪苷D的方法，包括如下步骤：

(1)构建能分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1，所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)在pH3.5-7.8的培养基中培养重组菌1,培养0.2-2天，得到培养液；

(3)在步骤(2)获得的培养液中加入底物莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，硫酸镁或氯化镁，甲醇，反应，得到莱鲍迪苷D。

重组菌1用下述步骤构建：将糖基转移酶UGT1基因连接至表达载体后转入宿主细胞，获得第一种重组菌1；或将糖基转移酶UGT1基因通过分子生物学技术整合至宿主细胞的基因组，获得第二种重组菌1；所述糖基转移酶UGT1基因的核苷序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤(3)优选为：在步骤(2)获得的培养液中加入终浓度为0.3-20g/L的底物莱鲍迪苷A，加入终浓度为0.2-1.5mM的尿苷二磷酸葡萄糖，加入终浓度为0.5-5mM的硫酸镁或氯化镁，每24小时加入终浓度为0.5％-1.5％的甲醇，反应，得到莱鲍迪苷D。

宿主细胞优选：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。

表达载体优选：pPICZalphaA/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33，YEplac195、pHT01、pHT08或pHT43载体。

重组菌1分泌表达糖基转移酶UGT1所用的信号肽为alpha因子、xyn2s，phoA、phoD、amyE、MFalpha或SED1的信号肽，所述信号肽对应的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。

本发明的优点

本发明的一锅法生产莱鲍迪苷D在重组菌1发酵生成糖基转移酶UGT1的同时可催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷D，无需纯化UGT1和离心分离就能获得莱鲍迪苷D的。本发明的方法简单、高效、可以降低分离糖基转移酶UGT1的生产成本，可以商业化获得甜度高、口感好、高价值的莱鲍迪苷D。

附图说明

图1为含有糖基转移酶的UGT1基因的重组载体构建策略图。

图2为糖基转移酶的UGT1基因的重组巴斯德毕赤酵母转化子PCR鉴定电泳图谱。泳道M为DNA标准分子量Marker；各泳道分别为各转化子和对照菌株X33，CK(以水为模板的)PCR产物电泳图谱。

图3各转化子培养物上清总蛋白浓度及电泳图。

图3a是各转化子培养物上清的总蛋白浓度，图3b是各转化子培养物上清的总蛋白电泳图。

图4发酵0-7天时培养物上清液中UGT1的SDS-PAGE图。发酵液上清浓缩5倍后上样10ul。

图5各种甲醇浓度下重组毕赤酵母表达UGT1。a为重组菌1在各种甲醇浓度培养时分泌的总蛋白浓度，图5b是重组菌1在各种甲醇浓度培养时分泌的UGT1电泳图。

图6纯化的UGT1的SDS-PAGE图。

具体实施方式

大肠杆菌TOP10F′(商品)。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

表达载体为pPICZalphaA/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33，YEplac195、pHT01、pHT08或pHT43载体为公知。

实施例1糖基转移酶UGT1基因的合成及表达载体的构建

金斯瑞公司合成糖基转移酶UGT1基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所示(SEQ ID NO.1是糖基转移酶UGT1的氨基酸序列)，将该基因通过分子生物学的方法连接至pPICZalphaA，获得序列表中SEQ ID NO.3所示的4954bp的pP-UGT1质粒。pP-UGT1质粒(图1)包含信号肽alpha因子的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)；该质粒转化大肠杆菌TOP10F′得到的转化子，并从转化子中提取15μg(也可以是10μg)的pPIC-UGT1质粒(天根公司中量试剂盒)。用PmeI酶切成线性的SEQ ID NO.3所示的4954bp片段，经酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀线性SEQ ID NO.3所示的线性DNA片段，干燥后溶于无菌水，制成DNA浓度为1μg/μL(也可以制成浓度为0.4μg/μL)的线形DNA溶液。

实施例2糖基转移酶UGT1基因整合至巴斯德毕赤酵母染色体：

参照精编分子生物学实验指南(第四版)(P512-513)中的电穿孔转化制备酵母感受态细胞方法制备巴斯德毕赤酵母宿主菌X-33和Gs115的感受态细胞，将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌的感受态细胞与10μL的1μg/μL的pP-UGT1质粒的线形DNA溶液混匀后，转移到4℃(也可以是0-4℃中的任意一值)预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1500V，用eppendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后立即加入1mL的4℃预冷的1M山梨醇水溶液到电极杯中，混匀，将混合液转移到15mL离心管中，29℃静置培养1h(可以是1-2h中的任意一值)，在含200μg/mL的Zeocin(Invitrogen公司出售)的YPD平板上涂100μL(也可以是在50μL-200μL中任一数值)培养后的混合液，29℃倒置培养直至第一种重组菌1出现。

YPD固体培养基为酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,琼脂18g/L。

实施例3含有糖基转移酶UGT1基因的巴斯德毕赤酵母转化子的PCR鉴定

通过菌落PCR方法对实验室前期的转化子进行鉴定。以甘油管保存的菌离心后弃上清，浓缩的菌体作为PCR扩增模板，采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。

分别取20μL上述甘油管中的菌，离心12000rpm/4℃/5min，弃上清，沉淀作为菌落PCR模板。在200μL PCR管内配制15μL反应体系2×Rapid Taq Master Mix 7.5μL，0.5μL的如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、下游引物，无菌水6.5μL，用pPIC-UGT1质粒为模板作为正对照；用野生型巴斯德毕赤酵母X33菌株的(商品)基因组DNA为模板作为阴性对照；用无菌水为模板作为负对照(CK)。PCR反应热循环程序为95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸3min。配置1％琼脂糖凝胶(1％琼脂，1.5‰EB，TAE缓冲液)。取PCR产物点样，170V电泳30min。扫描凝胶电泳图，PCR产物电泳，如图2所示。

PCR能扩增出1950bp的目标基因和2.2kb的宿主菌中AOX1基因的条带，说明这些转化子的UGT1基因已经成功整合到巴斯德毕赤酵母X-33菌株染色体上。用上述方法分批鉴定转化子，成功整合UGT1的转化子有XE-3、XE-4、XE-6、XE-8、XE-9、XE-12、XE-13、XE-14、XE-15、XE-16、XE-17、XE-18、XE-19、XE-20等。

实施例4甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的UGT1基因表达

①接种经实施例3鉴定的含有糖基转移酶基因UGT1的重组巴斯德毕赤酵母菌XE-3、XE-4、XE-6、XE-8、XE-9、XE-12、XE-13、XE-14、XE-15、XE-16、XE-17、XE-18、XE-19、XE-20，以及巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别转接至2ml，pH＝5.5的YPD培养基预培养，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

②按1:100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

③将步骤②培养的菌液分别转接至50ml pH＝5.5、甲醇的体积浓度为0.75％的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝1，在220转/分钟，29℃摇床中培养，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.75％，诱导重组菌分泌表达UGT1。为检测糖基转移酶基因UGT1能有效地表达且将目的蛋白分泌到重组巴斯德毕赤酵母菌的细胞外，从诱导后第1天至8天取重组菌生长的培养基进行粗酶液的活性测定、蛋白电泳及蛋白浓度测定。取样方式如下：取500μl培养基，离心后，取上清测定酶活。如图3所示，随着诱导时间的增加，UGT1酶的酶活越高，即目的蛋白UGT1分泌的越多，而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白UGT1的分泌(图3)，各个菌株分泌表达的UGT1也有所差异，其中重组菌XE3和XE4等菌株分泌的重组蛋白UGT1的量较大。XE-3菌株表达目标蛋白UGT1的表达水平最高，命名为重组菌1。重组菌1在培养1-7天时UGT1皆能表达(图4)，在第3天时表达水平就已经达到较高的水平。

步骤①和②中培养的转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是28℃-30℃中的任意一值；培养菌的浓度OD₆₀₀也可以是2-6中的任意一值。步骤③中BMMY培养基中甲醇的体积浓度为0.5％-1％中任意一值；菌体的浓度OD₆₀₀也可以是0.8-1.5范围中任意一值；转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是28℃-30℃中的任意一值，每24h补甲醇,甲醇的加入体积为培养基体积的0.5％-1％中的任意一值。

BMGY培养基为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾,4x 10^-4g/L生物素，10g/L甘油，余量为水。

BMMY培养基为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾,4x 10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。

MMH培养基为13.4g/L酵母氮基，4x 10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。

BMMH培养基为13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾,4x 10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。

重组菌1包含有UGT1基因的工程菌株，宿主细胞也可以是酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。

当宿主细胞为巴斯德毕赤酵母时，表达载体为pPIC9K、pPIC9或pPinkα-HC。

宿主细胞为酿酒酵母选用表达载体为pYES2、YCplac33，YEplac195、

宿主细胞为枯草芽孢杆菌时选用表达载体为pHT01、pHT08或pHT43。

为使目标蛋白有效分泌宿主菌株细胞外，选用的信号肽为alpha因子(SEQ IDNO.6)、xyn2s(SEQ ID NO.7)，phoA(SEQ ID NO.8)、phoD(SEQ ID NO.9)、amyE(SEQ IDNO.10)、MFalpha(SEQ ID NO.11)和SED1(SEQ ID NO.12)。

实施例5甲醇浓度对重组菌1产UGT1的影响

按照实施例4的方法分别在含甲醇浓度为0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.5％的BMMY中培养重组菌1，考察其在BMMY培养基中糖基转移酶的生长及表达趋势，考察诱导重组菌1分泌生产UGT1的最适甲醇浓度。SDS-PAGE和蛋白浓度测定的结果均表明重组菌1表达目的蛋白的最适宜的甲醇浓度为0.75％，其次是1.0％和1.25％，1.5％或0.5％时也有较高蛋白的分泌表达(图5)。

甲醇浓度对重组菌株XE-3的生长和表达均有影响,甲醇浓度过高，对巴斯德毕赤酵母的生长可能有毒害作用。过低浓度会使诱导碳源不足，生物量和表达量都下降，维持适当的甲醇浓度是保证高表达量的关键。本实验说明重组菌株XE-3分泌表达蛋白最适甲醇浓度为0.75％。

实施例6 UGT1的纯化及生物活性检测

采用Merk公司的Ni-NTA His.Bind树脂对XE-3第3天发酵液上清进行纯化。取20mL培养物13000g/4℃/30min离心，上清液用0.45μm滤膜抽滤，抽滤后的样品加入到Milipore公司10kD的超滤管，5000g/4℃/20min离心，在超滤管中加入1×Ni-NTA结合缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl)补足体积到13mL，按上述条件离心，浓缩至2mL。取2mL 50％Ni-NTA His·Bind树脂(Novagen，139311725)加入重力柱(Biorad，732-1010)中，加入2mL超滤浓缩后的蛋白液与6mL的1×Ni-NTA结合缓冲液，轻柔摇动混匀，结合(200rpm/4℃/1h)。收集流出液，加入1mL漂洗缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，2mmol/L咪唑)漂洗1次；4mL洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，150mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白。用3.5mL 10mmol/L磷酸缓冲液清洗平衡脱盐层析柱(GE，PD-10，Sephadex G-25填料)，上述洗脱后的4mL蛋白样品用10mmol/L磷酸缓冲液补体积至5mL，分别加入到平衡好的脱盐层析柱中2.5mL，弃去流出液，用3.5mL 10mmol/L磷酸缓冲液洗脱目的蛋白，得到去咪唑的纯化蛋白。纯化脱盐后的纯酶TT1有明显的56kD条带，比预计的50kD要高一些，分析可能是不同程度的糖基化的原因，(图6)。

纯化的UGT1用于催化实验：500μL反应体系中加入50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH7.2)，0.5g/L RD，3mmol/L MgCl2，1mmol/L UDPG，70μL的纯酶，30℃反应2天。反应完成后，加入500μL 60％(v/v)乙腈，振荡混匀后，室温下12000rpm离心10min，上清液过0.2μm有机膜。HPLC采用Luna C18反相键合硅胶分离柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相采用乙腈：磷酸钠缓冲溶液(pH 2.6)＝32:68，流速1mL/min，柱温40℃。采用紫外检测器VWD和示差折光检测器RID，VWD检测器波长210nm，RID检测器光学单元温度40℃，进样量20μL。每分钟酶催化底物RD分子生产1μmol产物RM所需的酶量为1个单位U。比活力指每毫克酶蛋白所具有的酶活，单位U/mg。纯化的蛋白浓度测为0.228mg/mL、UGT1重组酶的比活为0.011U/mg。说明能成功地从重组巴斯德毕赤酵母XE-3的培养物中纯化出有活性的重组酶UGT1，纯化的酶能催化RA生成RD。

实施例7一锅法催化莱鲍迪苷A(RebA)生成莱鲍迪苷D(RebD)

取重组巴斯德毕赤酵母菌菌株XE-3(重组菌1)甘油管培养物30μL接种于3mLYPD中预培养至OD₆₀₀在6。将上述培养物1％接种量(0.25mL)接种至pH＝3.5的25mLBMMY培养基，28℃、250rpm，使初始OD₆₀₀约为1.0。28℃、250rpm培养2day时进行补料，加入终浓度为0.3g/L的RebA、加入终浓度为0.2mM的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，加入终浓度为0.5mM的Mg²⁺(硫酸镁)，28℃、250rpm培养，每24小时补加终体积浓度为0.5％的甲醇，测定菌体的OD₆₀₀。HPLC方法分析样品的产物RebD的生成水平。

根据RebA浓度变化可计算其转化率，根据RebD的生成量可计算其收率。重组菌1培养4天时，底物RebA转化率为39.59％，产物RebD收率为38.85％。

实施例8一锅法催化莱鲍迪苷A(RebA)生成莱鲍迪苷D(RebD)

取重组巴斯德毕赤酵母菌菌株XE-3(重组菌1)甘油管培养物30μL接种于3mLYPD中预培养至OD₆₀₀在3。将上述培养物1％接种量(0.25mL)接种至pH＝6.5的25mLBMMY培养基，28℃、250rpm，使初始OD₆₀₀约为1.0。28℃、250rpm培养1day时进行补料，加入终浓度为1g/L的RebA的、加入终浓度为1mM的UDPG，加入终浓度为3mM的Mg²⁺(硫酸镁)，28℃、250rpm培养，每24小时补加终体积浓度为1％的甲醇，测定菌体的OD₆₀₀。HPLC方法分析样品的产物RebD的生成水平。

根据RebA浓度变化可计算其转化率，根据RebD的生成量可计算其收率。重组菌1培养4天时，底物RebA转化率为68.97％，产物RebD收率为57.75％。

实施例9一锅法催化莱鲍迪苷A(RebA)生成莱鲍迪苷D(RebD)

取重组巴斯德毕赤酵母菌菌株XE-3(重组菌1)甘油管培养物30μL接种于3mLYPD中预培养至OD₆₀₀在4。将上述培养物1％接种量(0.25mL)接种至pH＝7.8的25mLBMMY培养基，28℃、250rpm，使初始OD₆₀₀约为1.0。28℃、250rpm；培养0.2day时进行补料，加入终浓度为20g/L的RebA的、加入终浓度为1.5mM的UDPG，加入终浓度为5mM的Mg²⁺(氯化镁)，28℃、250rpm培养，每24小时补加终体积浓度为1.5％的甲醇，测定菌体的OD₆₀₀。HPLC方法分析样品的产物RebD的生成水平。

根据RebA浓度变化可计算其转化率，根据RebD的生成量可计算其收率。重组菌1培养4天时，底物RebA转化率为29.10％，产物RebD收率为28.08％。

序列表

<110> 天津大学

中化健康产业发展有限公司

<120> 一锅法生产莱鲍迪苷D的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Phe Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Met His Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro

20 25 30

Cys Leu Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser

35 40 45

Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro

50 55 60

Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val

65 70 75 80

Glu Gly Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp

85 90 95

Arg Pro Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala

100 105 110

Ala Pro Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile

115 120 125

Val Asp Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys

130 135 140

Val Pro Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser

145 150 155 160

Ile Ala Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala

165 170 175

Ala Gly Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg

180 185 190

Met Lys Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu

195 200 205

Arg Phe Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser

210 215 220

Cys Val Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg

225 230 235 240

Gly Lys Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly

245 250 255

Arg Arg Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Pro Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu

275 280 285

Gly Val Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly

290 295 300

Thr Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala

305 310 315 320

Asp Leu Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val

325 330 335

Val Ala Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala

340 345 350

Val Gly Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly

355 360 365

Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln

370 375 380

Gly Pro Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val

385 390 395 400

Ala Arg Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala

405 410 415

Ala Ile Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln

420 425 430

Ala Lys Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His

435 440 445

Glu Arg Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

Leu Val Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu

465 470 475 480

Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His

485 490 495

His

<210> 2

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcatggact ctggttactc ttcttcttac 300

gctgctgctg ctggtatgca cgttgttatc tgtccatggt tggctttcgg tcacttgttg 360

ccatgtttgg acttggctca aagattggct tctagaggtc acagagtttc tttcgtttct 420

actccaagaa acatctctag attgccacca gttagaccag ctttggctcc attggttgct 480

ttcgttgctt tgccattgcc aagagttgaa ggtttgccag acggtgctga atctactaac 540

gacgttccac acgacagacc agacatggtt gaattgcaca gaagagcttt cgacggtttg 600

gctgctccat tctctgaatt tttgggtact gcttgtgctg actgggttat cgttgacgtt 660

ttccaccact gggctgctgc tgctgctttg gaacacaagg ttccatgtgc tatgatgttg 720

ttgggttctg ctcacatgat cgcttctatc gctgacagaa gattggaaag agctgaaact 780

gaatctccag ctgctgctgg tcaaggtaga ccagctgctg ctccaacttt cgaagttgct 840

agaatgaagt tgatcagaac taagggttct tctggtatgt ctttggctga aagattctct 900

ttgactttgt ctagatcgtc tttggttgtt ggtagatcgt gtgttgaatt tgaaccagaa 960

actgttccat tgttgtctac tttgagaggt aagccaatca ctttcttggg tttgatgcca 1020

ccattgcacg aaggtagaag agaagacggt gaagacgcta ctgttagatg gttggacgct 1080

caaccagcta agtctgttgt ttacgttgct ttgggttctg aagttccatt gggtgttgaa 1140

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agaaagccaa ctggtgtttc tgacgctgac ttgttgccag ctggtttcga agaaagaact 1260

agaggtagag gtgttgttgc tactagatgg gttccacaaa tgtctatctt ggctcacgct 1320

gctgttggtg ctttcttgac tcactgtggt tggaactcta ctatcgaagg tttgatgttc 1380

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gaagctaaga acgctggttt gcaagttgct agaaacgacg gtgacggttc tttcgacaga 1500

gaaggtgttg ctgctgctat cagagctgtt gctgttgaag aagaatcttc taaggttttc 1560

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

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cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

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actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960

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