阅读说明：本技术 一种双酶发酵催化生产莱鲍迪苷a的方法 (Method for producing rebaudioside-A through double-enzyme fermentation catalysis ) 是由 孙多龙 祁飞 孙彩军 陆晓雨 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法,其特征在于：(1)糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连到pUC18质粒载体上,导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中,接入LB培养基,25～37℃、200～250 rpm培养10～18h；(2)按0.5%～15%接种量接到种子罐,150～400rpm,通气比0.1～1.5V/V.min,25～37℃培养5～16 h；(3)按1%～10%接种量接入发酵罐,100～1000 rpm,通气比0.2～2 V/V.min,pH 6.6～8.5,25～37℃培养20～40h；(4)OD<Sub>600</Sub>值达20～100时加诱导剂,浓度0.1～1.5 mmol/L；(5)发酵液压滤、重悬、破碎、压滤得粗酶液；(6)甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40-100：1-4：400-600：50-100混合,25-40℃反应24-48 h即可。本发明优点：一次发酵获得两种粗酶液,操作步骤少；酶活性高,生产成本低。(The invention relates to a method for producing rebaudioside A through double-bacterium fermentation catalysis, which is characterized by comprising the steps of (1) connecting a glycosyltransferase UGT76G1 gene and a sucrose synthase AtSUSY gene to a pUC18 plasmid vector, transferring the genes to a DH5 α escherichia coli competent cell, inoculating an LB culture medium, culturing for 10-18 h at 25-37 ℃ and 200-250 rpm, (2) inoculating the genes to a seeding tank according to 0.5-15% of inoculum size, culturing for 5-16 h at 25-37 ℃, inoculating the genes to a fermentation tank according to 1-10% of inoculum size, culturing for 100-1000 rpm and 0.2-2V/V.min at 25-37 ℃, and culturing for 20-40 h at pH 6.6-8.5 and 25-37 ℃, (4) inoculating OD (OD) 600 Adding an inducer when the value reaches 20-100, wherein the concentration is 0.1-1.5 mmol/L; (5) filter pressing, resuspending, crushing and filter pressing the fermentation liquor to obtain a crude enzyme solution; (6) stevioside, uridine diphosphate, phosphate buffer solution and crude enzyme solution by massThe ratio of 40-100: 1-4: 400-600: mixing 50-100 parts of the raw materials, and reacting at 25-40 ℃ for 24-48 h. The invention has the advantages that: two crude enzyme liquids are obtained by one-time fermentation, and the operation steps are few; high enzyme activity and low production cost.)

一种双酶发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵酶制剂技术领域，涉及一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法。

背景技术

甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的200～300倍，有一定程度的薄荷醇味，后苦味较为明显，整体的甜味口感不是很好。甜叶菊中的甜菊苷成分占糖苷总量的 60%～70%，是苦味的主要来源；莱鲍迪苷A约占糖苷总量的 15%～20%，口感优于甜菊苷，更接近于蔗糖，同时具有更高的稳定性和安全性。

目前甜菊糖微生物发酵法研究较少，植物提取分离甜菊苷和莱鲍迪苷A成本较高，甜菊糖产业发展较为缓慢。随着对甜味剂口感要求的提高，对莱鲍迪苷A等高端产品的需求越来越大。甜叶菊糖基转移酶能将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，现有的酶催化技术在催化底物过程中需添加尿苷二磷酸葡萄糖作为原料，尿苷二磷酸葡萄糖市场价格高昂，导致成本较高，工业化生产受到一定限制。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有莱鲍迪苷A生产成本高、酶活性低的问题，提供一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250 rpm下培养10～18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.5%～15%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为150～400rpm，通气比为0.1～1.5V/V.min，25～37℃温度下培养5～16 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～1000 rpm，通气比为0.2～2 V/V.min，25～37℃温度下，控制pH为6.6～8.5，培养20～40小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到20～100时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其浓度为0.1～1.5 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40-100 ：1-4：400-600 ：50-100 混合，随后在25-40℃下反应时间24-48 h即可得莱鲍迪苷A。

进一步，步骤（1）中LB培养基优选温度为30～36 ℃，转速220～235 rpm，培养时间为13～15 h。

进一步，步骤（2）中种子罐优选转速为220～350 rpm，通气比为0.5～1 V/V.min，在30～36 ℃温度下培养8～10 h。

进一步，步骤（3）中发酵罐优选转速为450～780 rpm，通气比为0.5～1.5 V/V.min，在30～36 ℃温度下，控制pH为7～8，培养25～35小时。

进一步，步骤（4）中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度优选为0.5～1 mmol/L。

进一步，所述步骤（3）中发酵培养基制备方法如下：按照磷酸二氢钾2～10 g、磷酸氢二铵1～10 g、柠檬酸0.5～9 g、酵母粉2～20 g、葡萄糖5～50 g、微量元素母液1～20 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6.6～8.5，用去离子水定容至1000 ml。

进一步，所述微量元素母液制备方法如下：按照EDTA-2Na 0.84g、六水氯化钴0.25g、四水氯化锰1.5 g、五水硫酸铜0.22 g、硼酸0.3 g、钼酸铵0.182 g、硫酸锌1.7 g、柠檬酸铁铵13.75 g 、浓硫酸5 滴的比例去配制，用去离子水定容至1000 ml。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明所述制备方法通过一次发酵获得两种粗酶液，从而减少了操作步骤；

2. 通过双菌发酵法得到粗酶液，酶的活性较高，可达32932.8～35178.2 U/ml，生产成本低，具有重要的市场价值和应用价值。

具体实施方式

一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，具体实施步骤如下：

实施例1

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，控制LB培养基温度为33℃，转速180rpm，培养时间18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照2%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为180 rpm，通气比（每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示，V/V.min）为0.5V/V.min，33℃温度下培养9 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照2%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为600 rpm，通气比为1.5 V/V.min，33℃温度下，控制pH为7.4，培养30小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到40时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其含量在0.6 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬15min得到菌体，菌体在0.2Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：1000 L反应体系，甜菊糖苷40 kg，尿苷二磷酸1.5 kg，磷酸缓冲液600kg，粗酶液70 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间30 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为33.5 g/L。

实施例2

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，控制LB培养基温度30℃，转速220rpm，培养时间16h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照3%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为220 rpm，通气比为0.6V/V.min，30℃温度下培养10 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照3%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为800 rpm，通气比为1.5 V/V.min，30℃温度下，控制pH为7.8，培养40小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到50时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其含量在0.8mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬20 min得到菌体，菌体在0.3 Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：1000 L反应体系，甜菊糖苷60 kg，尿苷二磷酸2.5 kg，磷酸缓冲液500kg，粗酶液90 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在33℃下反应时间36 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为52.1 g/L。

实施例3

（1）种子制备糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，控制LB培养基温度25℃，转速250rpm，培养时间18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照4%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为250 rpm，通气比为0.8V/V.min，25℃温度下培养12 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照4%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为1000 rpm，通气比为2 V/V.min，37℃温度下，控制pH为6.8，培养36小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到80时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其含量在1 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬18 min得到菌体，菌体在0.5 Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：1000 L反应体系，甜菊糖苷80 kg，尿苷二磷酸4 kg，磷酸缓冲液450 kg，粗酶液100 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间30 h即可得莱鲍迪苷A。

实验测得莱鲍迪苷A的浓度为67.5 g/L。

上述各实施例中所用LB培养基的配方为：5 g酵母粉、10 g氯化钠、10 g蛋白胨，用去离子水定容至1000 ml，pH自然，本发明所用到的各种培养基以及各种容器均经过高压蒸汽灭菌处理。

各实施例的检测结果表明，该双酶发酵生产粗酶液催化生产莱鲍迪苷A的生产方法，所产的两种粗酶液酶活水平较高，催化底物浓度高，最高可达80 g/L ，最高产物浓度达到67.5 g/L，大幅度降低成本的基础上，还有较高的产物浓度和转化率，对工业化生产有较大推动作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。