一种酶法制备罗汉果苷iv和苷v的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备罗汉果苷iv和苷v的方法 (Method for preparing mogroside IV and mogroside V by enzyme method ) 是由 杨峰 李文娟 张琚政 孙泽文 蔡美玲 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法制备罗汉果苷IV和苷V的方法,具体是利用酶法催化罗汉果苷IIE、III生成高甜度的罗汉果苷IV、V,所述酶来源自UDP葡萄糖基转移酶UGT032,核苷酸DNA序列如SEQ NO.1所示,氨基酸PRT序列如SEQ No.2所示。先制备粗酶液,再用粗酶液分别催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V。本发明方法可改善罗汉果苷的口感,对提高罗汉果苷产业发展具有重要意义。(The invention discloses a method for preparing mogroside IV and mogroside V by an enzyme method, in particular to a method for catalyzing mogroside IIE and mogroside III by the enzyme method to generate high-sweetness mogroside IV and mogroside V, wherein the enzyme is derived from UDP glucosyltransferase UGT032, the nucleotide DNA sequence is shown as SEQ NO.1, and the amino acid PRT sequence is shown as SEQ NO. 2. Preparing crude enzyme solution, and catalyzing the mogrosides IIE and III to generate mogroside IV and V respectively by using the crude enzyme solution. The method can improve the mouthfeel of the mogroside and has important significance for improving the development of the mogroside industry.)
技术领域
本发明涉及罗汉果苷的制备方法，具体是利用酶法催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V的方法。
背景技术
罗汉果苷为罗汉果中研究最多的活性成分，具有消炎、止咳、护肝、降糖、抗疲劳、增强免疫等显著功能。罗汉果苷也是重要的天然甜味剂，其中罗汉果苷V是其主要成分，在罗汉果中含量最为丰富，约占干果的0.57%，罗汉果苷IV的含量仅低于罗汉果苷V。罗汉果苷IV、V在水中浓度为万分之一的时，其甜度是5%蔗糖水的392倍、425倍。罗汉果苷IIE、III含有明显的苦味，将其去除或者转化为苷IV、苷V对提高罗汉果苷的口感、品质具有重要的意义。
目前，有利用酶法或化学法将罗汉果苷V合成苷IIIE，或利用酶法制备罗汉果苷1a和1b。暂无报道利用酶法催化罗汉果苷IIE、III生成高甜度的罗汉果苷IV、V，开发此工艺对罗汉果苷产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备罗汉果苷IV和苷V的方法，具体是利用酶法催化罗汉果苷IIE、III生成高甜度的罗汉果苷IV、V，该方法对提高罗汉果苷产业发展具有重要意义。
实现本发明目的的技术方案是：
本发明一种酶法制备罗汉果苷IV和苷V的方法，具体是利用酶催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V，所述酶来源自UDP葡萄糖基转移酶UGT032，核苷酸DNA序列如SEQ NO.1所示，氨基酸PRT序列如SEQ No.2所示。
本发明利用酶催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V的方法，首先制备粗酶液，再用粗酶液分别催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V。
所述粗酶液的制备方法具体是：将酶基因UGT032构建至pET22b上，重组质粒命名为pET22b-UGT032；
再将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中克隆质粒，摇瓶培养收集菌体，提质粒并在-80℃中保存；
将提取的质粒转化至大肠杆菌表达宿主BL21p中诱导、表达，收集菌体，按菌体重量的4倍加入破菌液，利用均质机破裂细胞制得粗酶液。
所述用粗酶液分别催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V的方法具体是，在三口瓶中分别加入底物罗汉果苷IIE或III，加入粗酶液，尿苷二磷酸，蔗糖合成酶，继续加入pH=7.5的磷酸缓冲溶液，搅拌， 35℃水浴； 水浴反应8-12h后，即可用HPLC检测苷IIE或III的转化率。
本发明方法的有益效果：
1. 本发明利用酶催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V，能够将具有苦味的罗汉果苷IIE、III生成高甜度的罗汉果苷IV、V，改善罗汉果苷的口感，对提高罗汉果苷产业发展具有重要意义；
2. 本发明所述酶来源自UDP葡萄糖基转移酶UGT032，该酶将UDP-葡萄糖（UDPG）分子上的葡萄糖分子转移到罗汉果苷IIE和苷III上生成高甜度的苷IV和苷V；
3. 本发明酶法制备罗汉果苷，反应温和，操作简单，副产物很少，适合规模化工业生产。
附图说明
图1为本发明方法重组质粒pET22b-UGT032质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例：
利用酶催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V的方法，所述酶来源自UDP葡萄糖基转移酶UGT032，核苷酸DNA序列如SEQ NO.1所示，氨基酸PRT序列如SEQ No.2所示。DNA序列是人工序列，根据氨基酸的序列做了密码子优化，非天然的DNA序列。
利用酶催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V的方法，首先制备粗酶液，再用粗酶液分别催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V。
粗酶液的制备方法具体是，将酶基因UGT032（序列如SEQ NO.1所示）构建至pET22b上，重组质粒命名为pET22b-UGT032；再将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中克隆质粒，摇瓶培养收集菌体，提质粒并在-80℃中保存；将提取的质粒转化至大肠杆菌表达宿主BL21p中诱导、表达，收集菌体，按菌体重量的4倍加入破菌液，利用均质机破裂细胞制得粗酶液。
用粗酶液催化罗汉果苷IIE生成罗汉果苷IV、V的方法具体是，在三口瓶中加入0.5g底物罗汉果苷IIE，加入粗酶液2mL，尿苷二磷酸（UDP）0.01g，蔗糖合成酶0.1g，继续加入pH=7.5的磷酸缓冲溶液8mL，搅拌， 35℃水浴；水浴反应8-12h后，HPLC检测苷IIE的转化率可达81.2%，其中43.8%转化为苷IV，32.5%转化为苷V。
用粗酶液催化罗汉果苷III生成罗汉果苷IV、V的方法具体是，在三口瓶中加入0.5g底物罗汉果苷III，加入粗酶液2mL，尿苷二磷酸（UDP）0.01g，蔗糖合成酶0.1g，继续加入pH=7.5的磷酸缓冲溶液8mL，搅拌，35℃水浴；水浴反应8-12h后，HPLC检测苷III的转化率可达85.5%，其中45.6%转化为苷IV，33.4%转化为苷V。
通过检测结果可看出，利用酶催化罗汉果苷IIE、III生成罗汉果苷IV、V，可去除罗汉果苷IIE、III中的苦味，对提高罗汉果苷的口感、品质具有重要的意义。
序列表
<110> 广西师范大学
<120> 一种酶法制备罗汉果苷IV和苷V的方法
<141> 2019-11-12
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> 马铃薯(Solanum berthaultii)
<400> 1
atgagcagca gcaaaaacag cgtgcatatt ctgatttttc cgtttccggc gcagggccat 60
attctggcgc tgctggatct gacccatcag ctgctgctgc atggctttaa aattaccatt 120
ctggtgaccc cgaaaaacgt gccgattctg gatccgctga ttagcaccaa cccgagcgtg 180
gaaaccctgg tgtttccgtt tccgggccat ccgagcctgc cggcgggcgt ggaaaacgtg 240
aaagatgtgg gcaacagcgg caacgcgccg attattgcgg gcctgagcaa actgcgcggc 300
ccgattctgg aatggtttaa agcgcagagc aacccgccgg tggcgattgt gtatgatttt 360
tttctgggct ggaccctgga tctggcgcag caggtgggcg tgccgggcat tgtgttttat 420
ggcgtgggcg cgctgctggt gagcattctg gtggatctgt ggaaaaacct gtgggcgtat 480
aaaggctgga ccctgctgag cctgatgggc tttctgaaag cgcagggcct gnnnatggaa 540
catctgccga gcgtgtttct gaaatttaaa gaagatgatc cgacctggga aattgtgcgc 600
aacggcttta ttgcgaacgg ccgcagcttt ggcagcattt ttaacacctt tgaagcgctg 660
gatagcgatt atctgggctt tctgaaaaaa gaaatgggcc atgaacgcgt gtatagcatt 720
ggcccgatta acctggtggg cggcccgggc cgcaccggca aatatgatga tggcgcgaac 780
gaaaaaattt ttacctggct gaacgaatgc ccgaacgaaa gcgtgctgta tgtggcgttt 840
ggcagccaga aactgctgac caaagcgcag atggaagcgc tgaccattgg cctggaaaaa 900
agcgaagtgc gctttattct ggtggcgaaa cagctgaccg cgcagcagga agaacagggc 960
tttggcagcg tgccgaaagg ctttgaagaa aaaattctgg gcctgcgccc gaacgataaa 1020
ggcctgggcc cgcaggtgga aattctgggc catcgcgcgg tgggcggctt tctgagccat 1080
tgcggctgga acagcgtgct ggaagcgatt gtggcgggcg tgctgattct gggctggccg 1140
atggaagcgg atcagtttat taacacctgg ctgctggtgg ataacatgaa aaccagcgtg 1200
cgcgtgtgcg aaggcagcaa cagcgtgccg gatccgattg aactgggccg caaaattaac 1260
gaagcgatga gcaacgatct gtttaaagaa cgcgcgaaaa aacgccgcgt ggaagcgctg 1320
gaagcggtga aaattggcgg cagcagcaaa aaagatctgg atagcattgt gaaagaactg 1380
ggccagctgc gcagc 1395
<210> 2
<211> 465
<212> PRT
<213> 马铃薯(Solanum berthaultii)
<400> 2
Met Ser Ser Ser Lys Asn Ser Val His Ile Leu Ile Phe Pro Phe Pro
1 5 10 15
Ala Gln Gly His Ile Leu Ala Leu Leu Asp Leu Thr His Gln Leu Leu
20 25 30
Leu His Gly Phe Lys Ile Thr Ile Leu Val Thr Pro Lys Asn Val Pro
35 40 45
Ile Leu Asp Pro Leu Ile Ser Thr Asn Pro Ser Val Glu Thr Leu Val
50 55 60
Phe Pro Phe Pro Gly His Pro Ser Leu Pro Ala Gly Val Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Asp Val Gly Asn Ser Gly Asn Ala Pro Ile Ile Ala Gly Leu Ser
85 90 95
Lys Leu Arg Gly Pro Ile Leu Glu Trp Phe Lys Ala Gln Ser Asn Pro
100 105 110
Pro Val Ala Ile Val Tyr Asp Phe Phe Leu Gly Trp Thr Leu Asp Leu
115 120 125
Ala Gln Gln Val Gly Val Pro Gly Ile Val Phe Tyr Gly Val Gly Ala
130 135 140
Leu Leu Val Ser Ile Leu Val Asp Leu Trp Lys Asn Leu Trp Ala Tyr
145 150 155 160
Lys Gly Trp Thr Leu Leu Ser Leu Met Gly Phe Leu Lys Ala Gln Gly
165 170 175
Leu Xaa Met Glu His Leu Pro Ser Val Phe Leu Lys Phe Lys Glu Asp
180 185 190
Asp Pro Thr Trp Glu Ile Val Arg Asn Gly Phe Ile Ala Asn Gly Arg
195 200 205
Ser Phe Gly Ser Ile Phe Asn Thr Phe Glu Ala Leu Asp Ser Asp Tyr
210 215 220
Leu Gly Phe Leu Lys Lys Glu Met Gly His Glu Arg Val Tyr Ser Ile
225 230 235 240
Gly Pro Ile Asn Leu Val Gly Gly Pro Gly Arg Thr Gly Lys Tyr Asp
245 250 255
Asp Gly Ala Asn Glu Lys Ile Phe Thr Trp Leu Asn Glu Cys Pro Asn
260 265 270
Glu Ser Val Leu Tyr Val Ala Phe Gly Ser Gln Lys Leu Leu Thr Lys
275 280 285
Ala Gln Met Glu Ala Leu Thr Ile Gly Leu Glu Lys Ser Glu Val Arg
290 295 300
Phe Ile Leu Val Ala Lys Gln Leu Thr Ala Gln Gln Glu Glu Gln Gly
305 310 315 320
Phe Gly Ser Val Pro Lys Gly Phe Glu Glu Lys Ile Leu Gly Leu Arg
325 330 335
Pro Asn Asp Lys Gly Leu Gly Pro Gln Val Glu Ile Leu Gly His Arg
340 345 350
Ala Val Gly Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu
355 360 365
Ala Ile Val Ala Gly Val Leu Ile Leu Gly Trp Pro Met Glu Ala Asp
370 375 380
Gln Phe Ile Asn Thr Trp Leu Leu Val Asp Asn Met Lys Thr Ser Val
385 390 395 400
Arg Val Cys Glu Gly Ser Asn Ser Val Pro Asp Pro Ile Glu Leu Gly
405 410 415
Arg Lys Ile Asn Glu Ala Met Ser Asn Asp Leu Phe Lys Glu Arg Ala
420 425 430
Lys Lys Arg Arg Val Glu Ala Leu Glu Ala Val Lys Ile Gly Gly Ser
435 440 445
Ser Lys Lys Asp Leu Asp Ser Ile Val Lys Glu Leu Gly Gln Leu Arg
450 455 460
Ser
465