阅读说明：本技术 在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法 (Method for producing steviol glycosides in recombinant hosts ) 是由 陈宇杰 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法,包括以下步骤：选材、提取、分离、纯化和混合五到工序进行在重组宿主中生产甜菊醇糖苷,使得甜菊醇糖苷安全性高,经国内外药理实验证明,甜菊糖甙为非致癌性物质,无毒无副作用,食用安全。甜叶菊原产地南美巴拉圭、巴西等地的居民食用甜叶菊已有四百多年历史,至今未发现有任何毒害,低热值,可应用于低热量食品、饮料和医药。长期食用甜菊糖甙不会使人发胖,且有降血糖、防龋齿、健胃、解除疲劳之功能,并对健美减肥和糖尿病、心脏病、高血压、动脉硬化等患者食用有辅助疗效,是制作保健食品、保健饮料、保健化妆品和医药制品等最佳天然甜味剂。(The invention discloses a method for producing steviol glycosides in a recombinant host, comprising the steps of: the steviol glycoside is produced in a recombinant host through five working procedures of material selection, extraction, separation, purification and mixing, so that the steviol glycoside has high safety, and pharmacological experiments at home and abroad prove that the steviol glycoside is a non-carcinogenic substance, has no toxic or side effect and is safe to eat. The stevia rebaudiana is eaten by residents in places such as the original places of the stevia rebaudiana, paraguay, brazil and the like for more than four hundred years, has no toxic hazard and low calorific value so far, and can be applied to low-calorie foods, beverages and medicines. The stevioside can not cause people to be fat after long-term eating, has the functions of reducing blood sugar, preventing decayed teeth, invigorating stomach and relieving fatigue, has auxiliary curative effects on body building and weight losing and eating by patients with diabetes, heart disease, hypertension, arteriosclerosis and the like, and is the best natural sweetening agent for preparing health-care food, health-care beverage, health-care cosmetics, medical products and the like.)

在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法

技术领域

本发明涉及甜菊醇糖苷技术领域，具体为一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法。

背景技术

甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的，甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用，甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物是可以从常青灌木甜叶菊中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及共混或单独地作为佐餐甜味剂,甜菊植物的提取物含有莱鲍迪苷和其他带来甜味的甜菊醇糖苷类，但不同产品批 次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A，和量少一些的其他糖苷，例如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质，例如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或应用选择可能会带来或多或少的问题，从而影响甜菊醇糖苷重组宿主中生产的速率，从而影响甜菊醇糖苷的甜度。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，具备甜度高等优点。

（二）技术方案

为实现上述甜度高的目的，本发明提供如下技术方案：一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，包括以下步骤：

S1、选材

筛选新鲜的菊科草本植物甜菊叶，将新鲜的菊科草本植物甜菊叶进行清洗，清洗后的菊科草本植物甜菊叶放置在烘干机中进行烘干或者晒干，得到菊科草本植物甜菊叶干，然后利用研磨机将得到的菊科草本植物甜菊叶干,研磨成粉末，最后利用筛子过筛，得到菊叶干粉末。

S2、提取

确定最佳提取方法是加酶浸提法，加酶法的最佳工艺条件是：采用纤维素酶，最佳浸提温度是45℃，最佳pH=5，酶用量为0.3%，浸提时间为100-120min。

S3、分离

往料液中加入絮凝剂，达到除杂的目的，确定采用新型高效复合PAMCaOFeCl3++有机高分子絮凝剂，最佳絮凝条件:最佳复合絮凝剂配比PAM:CaO:FeCl3=1：2.5：0.05，最佳絮凝pH=9，在70℃-90℃水浴中静置10-30min。

S4、纯化

采用树脂进行吸附脱色精制，采用CL型离子交换纤维脱色，采用大孔吸附树脂吸附后，用酸碱洗涤，用70%-90%的乙醇洗脱，大孔树脂吸附的动态吸附在pH为8-10，吸附流速为2BV/h时，甜叶菊糖苷的吸附量最大，同时，以70%乙醇为洗脱剂，流速为1BV/h，用2BV就可以完全解吸。其酸洗涤精制的最佳工艺条件为：酸(HCl)浓度为5%，洗涤流量为 1BV/h，酸用量2BV，其碱洗涤精制的最佳工艺条件为：碱(NaOH)浓度为 3%，流量为 1BV/h，碱液量 2BV。

S5、混合

利用重组宿主对生产甜菊醇糖苷进行重组微生物和方法。

优选的，所述菊科草本植物甜菊叶属于四环二萜的糖苷类，为白色粉末。含有20个碳原子的萜类化合物，其通式为（C5H8）4，甜叶菊中分离出至少8种不同甜度的甜菊苷，其中甜菊糖苷(stevioside)是主要成分,占60%~70%，其次是莱苞迪苷A(rebaudioside A),占15%~20% ，以及甜茶苷、甜菊醇、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F和杜尔可苷A。

优选的，所述甜菊苷主要分为三大类：

a、甜菊甙。无色晶体，甜度为蔗糖的270~280倍，是甜菊貳六品的主要組成部分，在混合昔中的比例为50%~70%。味貭良好，余味長而微苦；

b、莱包迪甙。送神式又可分为RA，RC, RD, RE等四狆，其中RA是无色結晶。甜度力蔗糖的450倍，甜味纯正，近似蔗糖，是甜菊武六品中甜味最伏貭部分，RC为无色結晶，甜度不到蔗糖的50倍并带苦味。RD为无色結晶,甜度为蔗糖的150倍。RE的甜度为蔗糖的100，150倍，RA在干叶中占息弍的15%.20%左右， RC占10%。15%左右，RD, RE占的比例较小；

c、杜尓可甙。该甙可分为DA和DB两种，其中DB和RC是同一种物质，DA在干叶中占息貳比例也比较小，且其甜度为蔗糖的150倍左右。

优选的，所述步骤S5中的搅拌设备混合时间为20-40min。

优选的，所述甜菊醇糖苷在所述条件下培养时，甜菊醇糖苷积累至可检测的浓度。

优选的，所述的方法生产的甜菊醇糖苷组合物，其中所述组合物相对于野生型甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物具有富含RebD或RebM的甜菊醇糖苷组合物。

优选的，所述重组宿主包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。

优选的，所述细菌细胞包括埃希氏菌属细菌细胞，乳杆菌属细菌细胞，乳球菌属细菌细胞，棒状杆菌属细菌细胞 ，醋杆菌属细菌细胞 ，不动杆菌属细菌细胞或假单胞菌属细菌细胞。

优选的，所述真菌细胞包括酵母细胞，酵母细胞就是酵母菌。

优选的，所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉、产朊假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁念珠菌，红发夫酵母或白色念珠菌物种的细胞。

5）利用重组宿主对生产甜菊醇糖苷进行重组微生物和方法。

（三）有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，具备以下有益效果：

该一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，通过选材、提取、分离、纯化和混合五到工序进行在重组宿主中生产甜菊醇糖苷，使得甜菊醇糖苷安全性高，经国内外药理实验证明，甜菊糖甙为非致癌性物质，无毒无副作用，食用安全。甜叶菊原产地南美巴拉圭、巴西等地的居民食用甜叶菊已有四百多年历史，至今未发现有任何毒害，低热值，可应用于低热量食品、饮料和医药。长期食用甜菊糖甙不会使人发胖，且有降血糖、防龋齿、健胃、解除疲劳之功能，并对健美减肥和糖尿病、心脏病、高血压、动脉硬化等患者食用有辅助疗效，是制作保健食品、保健饮料、保健化妆品和医药制品等最佳天然甜味剂，甜度高，甜菊糖甙替代蔗糖可降低成本60%以上，且减少运输量、运输费和仓库设备，同时，可长期储存，不变质，甜菊糖甙易进行重组微生物，不仅口味更佳，且甜度也可提高。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，包括以下步骤：

S1、选材

筛选新鲜的菊科草本植物甜菊叶，将新鲜的菊科草本植物甜菊叶进行清洗，清洗后的菊科草本植物甜菊叶放置在烘干机中进行烘干或者晒干，得到菊科草本植物甜菊叶干，然后利用研磨机将得到的菊科草本植物甜菊叶干,研磨成粉末，最后利用筛子过筛，得到菊叶干粉末。

S2、提取

确定最佳提取方法是加酶浸提法，加酶法的最佳工艺条件是：采用纤维素酶，最佳浸提温度是45℃，最佳pH=5，酶用量为0.3%，浸提时间为100min。

S3、分离

往料液中加入絮凝剂，达到除杂的目的，确定采用新型高效复合PAMCaOFeCl3++有机高分子絮凝剂，最佳絮凝条件:最佳复合絮凝剂配比PAM:CaO:FeCl3=1：2.5：0.05，最佳絮凝pH=9，在70℃水浴中静置30min。

S4、纯化

采用树脂进行吸附脱色精制，采用CL型离子交换纤维脱色，采用大孔吸附树脂吸附后，用酸碱洗涤，用70%的乙醇洗脱，大孔树脂吸附的动态吸附在pH为9-10，吸附流速为2BV/h时，甜叶菊糖苷的吸附量最大，同时，以70%乙醇为洗脱剂，流速为1BV/h，用2BV就可以完全解吸。其酸洗涤精制的最佳工艺条件为：酸(HCl)浓度为5%，洗涤流量为 1BV/h，酸用量2BV，其碱洗涤精制的最佳工艺条件为：碱(NaOH)浓度为 3%，流量为 1BV/h，碱液量 2BV。

S5、混合

利用重组宿主对生产甜菊醇糖苷进行重组微生物和方法。

实施例二：

一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，包括以下步骤：

S1、选材

筛选新鲜的菊科草本植物甜菊叶，将新鲜的菊科草本植物甜菊叶进行清洗，清洗后的菊科草本植物甜菊叶放置在烘干机中进行烘干或者晒干，得到菊科草本植物甜菊叶干，然后利用研磨机将得到的菊科草本植物甜菊叶干,研磨成粉末，最后利用筛子过筛，得到菊叶干粉末。

S2、提取

确定最佳提取方法是加酶浸提法，加酶法的最佳工艺条件是：采用纤维素酶，最佳浸提温度是45℃，最佳pH=5，酶用量为0.3%，浸提时间为110min。

S3、分离

往料液中加入絮凝剂，达到除杂的目的，确定采用新型高效复合PAMCaOFeCl3++有机高分子絮凝剂，最佳絮凝条件:最佳复合絮凝剂配比PAM:CaO:FeCl3=1：2.5：0.05，最佳絮凝pH=9，在70℃-90℃水浴中静置20min。

S4、纯化

采用树脂进行吸附脱色精制，采用CL型离子交换纤维脱色，采用大孔吸附树脂吸附后，用酸碱洗涤，用80%的乙醇洗脱，大孔树脂吸附的动态吸附在pH为9，吸附流速为2BV/h时，甜叶菊糖苷的吸附量最大，同时，以70%乙醇为洗脱剂，流速为1BV/h，用2BV就可以完全解吸。其酸洗涤精制的最佳工艺条件为：酸(HCl)浓度为5%，洗涤流量为 1BV/h，酸用量 2BV，其碱洗涤精制的最佳工艺条件为：碱(NaOH)浓度为 3%，流量为 1BV/h，碱液量 2BV。

S5、混合

利用重组宿主对生产甜菊醇糖苷进行重组微生物和方法。

实施例三：

一种在重组宿主中生产甜菊醇糖苷的方法，包括以下步骤：

S1、选材

筛选新鲜的菊科草本植物甜菊叶，将新鲜的菊科草本植物甜菊叶进行清洗，清洗后的菊科草本植物甜菊叶放置在烘干机中进行烘干或者晒干，得到菊科草本植物甜菊叶干，然后利用研磨机将得到的菊科草本植物甜菊叶干,研磨成粉末，最后利用筛子过筛，得到菊叶干粉末。

S2、提取

确定最佳提取方法是加酶浸提法，加酶法的最佳工艺条件是：采用纤维素酶，最佳浸提温度是45℃，最佳pH=5，酶用量为0.3%，浸提时间为120min。

S3、分离

往料液中加入絮凝剂，达到除杂的目的，确定采用新型高效复合PAMCaOFeCl3++有机高分子絮凝剂，最佳絮凝条件:最佳复合絮凝剂配比PAM:CaO:FeCl3=1：2.5：0.05，最佳絮凝pH=9，在70℃-90℃水浴中静置30min。

S4、纯化

采用树脂进行吸附脱色精制，采用CL型离子交换纤维脱色，采用大孔吸附树脂吸附后，用酸碱洗涤，用90%的乙醇洗脱，大孔树脂吸附的动态吸附在pH为10，吸附流速为2BV/h时，甜叶菊糖苷的吸附量最大，同时，以70%乙醇为洗脱剂，流速为1BV/h，用2BV就可以完全解吸。其酸洗涤精制的最佳工艺条件为：酸(HCl)浓度为5%，洗涤流量为 1BV/h，酸用量 2BV，其碱洗涤精制的最佳工艺条件为：碱(NaOH)浓度为 3%，流量为 1BV/h，碱液量 2BV。

S5、混合

利用重组宿主对生产甜菊醇糖苷进行重组微生物和方法。

本发明的有益效果是：安全性高，经国内外药理实验证明，甜菊糖甙为非致癌性物质，无毒无副作用，食用安全。甜叶菊原产地南美巴拉圭、巴西等地的居民食用甜叶菊已有四百多年历史，至今未发现有任何毒害，低热值，可应用于低热量食品、饮料和医药。长期食用甜菊糖甙不会使人发胖，且有降血糖、防龋齿、健胃、解除疲劳之功能，并对健美减肥和糖尿病、心脏病、高血压、动脉硬化等患者食用有辅助疗效，是制作保健食品、保健饮料、保健化妆品和医药制品等最佳天然甜味剂，甜度高，甜菊糖甙替代蔗糖可降低成本60%以上，且减少运输量、运输费和仓库设备，同时，可长期储存，不变质，甜菊糖甙易进行重组微生物，不仅口味更佳，且甜度也可提高。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。