阅读说明：本技术 一种高纯度酶改制甜菊糖苷及其制备方法 (High-purity enzyme-modified stevioside and preparation method thereof ) 是由 周爱琴 周爱兵 于茂兰 张璐璐 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于甜菊糖技术领域,提供了一种高纯度酶改制甜菊糖苷的制备方法,包括：将甜菊糖苷与糊精溶解在水中；添加反应酶,搅拌均匀；在60-70℃条件下反应24-48h；添加糊精继续反应5h,添加量为糊精量的10％-20％；升温至90-105℃将酶灭活；冷却后,活性炭过滤,除去颜色和杂质；将溶液配制成合适浓度,过大孔吸附树脂,至溶液吸附完全,再用2倍吸附柱体积的水冲洗吸附柱；用4倍吸附柱体积的40％-50％的乙醇溶液洗脱,将大孔吸附树脂树脂间的未反应的甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷混合物洗脱下来；流出液紫外吸光度大于0.1-0.3时进行收集1-1.5BV的流出液；将流出液浓缩后喷干,获得酶改制甜菊糖苷。(The invention belongs to the technical field of stevioside, and provides a preparation method of high-purity enzyme-modified stevioside, which comprises the following steps: dissolving stevioside and dextrin in water; adding reaction enzyme, and stirring uniformly; reacting for 24-48h at 60-70 ℃; adding dextrin to continue reacting for 5h, wherein the addition amount is 10% -20% of the paste amount; heating to 90-105 deg.C to inactivate enzyme; after cooling, filtering with activated carbon to remove color and impurities; preparing the solution into a proper concentration, passing through macroporous adsorption resin until the solution is completely adsorbed, and washing the adsorption column by using 2 times of the volume of the adsorption column; eluting with 40% -50% ethanol solution 4 times the volume of the adsorption column, and eluting unreacted stevioside and enzyme-modified stevioside mixture between macroporous adsorbent resin; collecting the effluent of 1-1.5BV when the ultraviolet absorbance of the effluent is more than 0.1-0.3; concentrating the effluent, and spray drying to obtain enzyme-modified stevioside.)

一种高纯度酶改制甜菊糖苷及其制备方法

技术领域

本发明涉及甜菊糖技术领域，具体涉及一种高纯度酶改制甜菊糖苷及其制备方法。

背景技术

甜菊糖苷(也称甜菊糖)是一种从天然菊科草本植物甜叶菊的叶片中提取出来的多组分甜糖甙的混合物，是甜叶菊中的主要呈味物质，生产中用作食品甜味剂。甜菊糖苷主要包括甜菊甙、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、杜克甙、甜菊双糖甙等八种糖甙。甜菊糖具有纯天然(来自纯天然植物甜叶菊)、高甜度(蔗糖的250～450倍)、低热量(仅为白糖的1/300)、使用经济(成本仅为蔗糖的三分之一)、稳定性好(耐热、耐酸、耐碱，不易出现分解现象)、安全性高(无毒副作用)等优点。

然而，天然甜菊糖的结构苷，无甜味且具有苦涩味，其中甜菊苷是甜菊糖苷中含量最高的成分之一，后苦味明显，破坏了甜菊糖的口感，也限制了其更为广泛的工业应用。通常是对甜菊糖苷进行酶改制，即利用环糊精葡萄糖转移酶在甜菊糖苷分子上随机加一分子或多分子葡萄糖。

目前现有的酶改制技术，操作复杂，最后获得的酶改制甜菊糖苷纯度不一，且含量较低，限制了酶改制甜菊糖苷的应用。

发明内容

本申请的目的在于克服上述问题或者至少部分地解决或缓减解决上述问题。

第一方面，本发明提供的高纯度酶改制甜菊糖苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1：将甜菊糖苷与糊精溶解在水中；

步骤S2：在步骤S1的溶液中添加反应酶，搅拌均匀；

步骤S3：将步骤S2的溶液在60-70℃条件下反应24-48h；

步骤S4：待步骤S3的反应完成后，添加糊精继续反应5h，添加量为步骤S1中的糊精量的10％-20％；

步骤S5：将步骤S4中的反应物升温至90-105℃，将酶灭活；

步骤S6：冷却后，将步骤S5的反应溶液用活性炭过滤，除去颜色和杂质；

步骤S7：将步骤S6中获得的溶液配制成质量浓度为1％-5％的溶液，过大孔吸附树脂，直至溶液吸附完全，流速为1BV/h，再用2倍吸附柱体积的水冲洗吸附柱，洗掉残留的糊精；

步骤S8：用4倍吸附柱体积的40％-50％的乙醇溶液洗脱，将大孔吸附树脂树脂间的未反应的甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷混合物洗脱下来，流速为0.5BV/h；流出液紫外吸光度大于0.1-0.3时收集1-1.5BV体积的流出液；

步骤S9：将流出液浓缩后喷干，获得酶改制甜菊糖苷。

本申请通过对流出液用紫外线分析仪检测吸光度，吸光度大于0.1-0.3时说明已经有酶改制甜菊糖苷和甜菊糖苷流出。

可选地，所述步骤S1中，甜菊糖苷与糊精的质量比为1：0.5-3，且甜菊糖苷的质量浓度为1％-20％。

可选地，所述步骤S2中，所述反应酶添加量为甜菊糖苷质量的1％-5％。

可选地，所述步骤S3中，在反应期间匀速搅拌反应溶液，转速为50-100rpm/min。

可选地，所述糊精选用环糊精或麦芽糊精，或替换为淀粉。

可选地，所述糊精的DE值为10-15。

可选地，所述甜菊糖苷的纯度至少为80％。

可选地，所述反应酶选用环糊精葡萄糖基转移酶，或环糊精葡萄糖基转移酶与α-淀粉酶按质量比1:1形成的联合酶。

可选地，所述步骤S9中，将流出液浓缩后喷干的步骤是先将流出液浓缩成质量浓度为40％-50％的料液，再进行喷雾干燥处理，在喷雾干燥机内真空度达到-95kpa时进料，进料速度为120kg/h，进风口温度为195℃，出风口温度为95℃。

第二方面，本发明提供的如所述的高纯度酶改制甜菊糖苷的制备方法所制备的酶改制甜菊糖苷，所述酶改制甜菊糖苷的纯度至少为80％。

本发明的有益效果：

1.本发明的高纯度酶改制甜菊糖苷的制备方法，在甜菊糖苷的结构上增加了葡萄糖基，可以制备出纯度比较高的酶改制甜菊糖苷，纯度至少为80％，最高可达98％，且未反应的糊精几乎为零，甜味自然纯正，带有天然的水果香味，完全没有甜菊糖苷令人不悦的后苦味，颜色纯白，并且溶解度大大的提高，进一步扩大了酶改制甜菊糖苷的应用范围。

2.本发明所制备的高纯度酶改制甜菊糖苷加入到甜菊糖苷母液糖中，母液糖口感大大改善，且甜度也有所上升。

3.本申请利用甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷结构不同的原理，利用特定浓度的乙醇洗脱，酶改制甜菊糖苷和其中一小部分未反应甜菊糖苷会优先流出，其他大部分未反应的甜菊糖苷和一小部分酶改制甜菊糖苷最后被洗脱下来。

3.本发明的制备方法操作简单，适合工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为甜菊糖苷的基本结构式；

图2示出了本发明实施例所提供的酶改制甜菊糖苷的制备方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

图1为甜菊糖苷的结构式。甜菊糖苷所有的成分均含有同一苷元(甜菊醇，Steviol)，因其在C19和C13位上连接不同数量的葡萄糖基或者鼠李糖基，使得其甜度和味质差异很大。通常认为在C13位上接各类糖基的产物可以具有更好的甜度和味质。酶改制甜菊糖苷其本质是在甜菊糖苷的主结构C19或者C13上增加葡萄糖基，改变甜菊糖苷的甜度和味质。

实施例1

步骤S1：将甜菊糖苷与环糊精按照质量比1:1.2溶解在水中，甜菊糖苷的质量浓度为10％；

步骤S2：在步骤S1的溶液中添加环糊精葡萄糖基转化酶，添加量为甜菊糖苷添加量的2％，搅拌均匀；

步骤S3：将步骤S2的溶液在65℃条件下反应28h；

步骤S4：待步骤S3的反应完成后，添加环糊精继续反应5h，添加量为步骤S1中的环糊精量的12％；

步骤S5：将步骤S4中的反应物升温至95℃，将酶灭活；

步骤S6：冷却后，将步骤S5的反应溶液用活性炭过滤，除去颜色和杂质；

步骤S7：将步骤S6中获得的溶液配制成质量浓度为3％的溶液，过大孔吸附树脂，直至溶液吸附完全，流速为1BV/h，再用2倍吸附柱体积的水冲洗吸附柱，洗掉残留的环糊精；

步骤S8：用4倍吸附柱体积的体积分数为45％的乙醇溶液洗脱，将大孔吸附树脂树脂间的未反应的甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷混合物洗脱下来，流速为0.5BV/h；流出液紫外吸光度大于0.15时进行收集1-1.5BV体积的流出液；

步骤S9：将流出液浓缩后喷干，获得酶改制甜菊糖苷。

实施例2

步骤S1：将甜菊糖苷与环糊精按照质量比1:1溶解在水中，甜菊糖苷的质量浓度为12％；

步骤S2：在步骤S1的溶液中添加环糊精葡萄糖基转化酶，添加量为甜菊糖苷添加量的2％，搅拌均匀；

步骤S3：将步骤S2的溶液在68℃条件下反应30h；

步骤S4：待步骤S3的反应完成后，添加环糊精继续反应5h，添加量为步骤S1中的环糊精量的12.5％；

步骤S5：将步骤S4中的反应物升温至95℃，将酶灭活；

步骤S6：冷却后，将步骤S5的反应溶液用活性炭过滤，除去颜色和杂质；

步骤S7：将步骤S6中获得的溶液配制成质量浓度为4％的溶液，过大孔吸附树脂，直至溶液吸附完全，流速为1BV/h，再用2倍吸附柱体积的水冲洗吸附柱，洗掉残留的环糊精；

步骤S8：用4倍吸附柱体积的体积分数为48％的乙醇溶液洗脱，将大孔吸附树脂树脂间的未反应的甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷混合物洗脱下来，流速为0.5BV/h；流出液紫外吸光度大于0.12时进行收集1-1.5BV体积的流出液；

步骤S9：将流出液浓缩后喷干，获得酶改制甜菊糖苷。

实施例3

步骤S1：将甜菊糖苷与麦芽糊精按照质量比1:0.5溶解在水中，甜菊糖苷的质量浓度为1％；

步骤S2：在步骤S1的溶液中添加环糊精葡萄糖基转移酶与α-淀粉酶按质量比1:1形成的联合酶，添加量为甜菊糖苷添加量的1％，搅拌均匀；

步骤S3：将步骤S2的溶液在60℃条件下反应48h；

步骤S4：待步骤S3的反应完成后，添加麦芽糊精继续反应5h，添加量为步骤S1中的麦芽糊精量的10％；

步骤S5：将步骤S4中的反应物升温至90℃，将酶灭活；

步骤S6：冷却后，将步骤S5的反应溶液用活性炭过滤，除去颜色和杂质；

步骤S7：将步骤S6中获得的溶液配制成质量浓度为1％的溶液，过大孔吸附树脂，直至溶液吸附完全，流速为1BV/h，再用2倍吸附柱体积的水冲洗吸附柱，洗掉残留的糊精；

步骤S8：用4倍吸附柱体积的体积分数为40％的乙醇溶液洗脱，将大孔吸附树脂树脂间的未反应的甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷混合物洗脱下来，流速为0.5BV/h；流出液紫外吸光度大于0.1时进行收集1-1.5BV体积的流出液；

步骤S9：将流出液浓缩后喷干，获得酶改制甜菊糖苷。

实施例4

步骤S1：将甜菊糖苷与淀粉按照质量比1:3溶解在水中，甜菊糖苷的质量浓度为20％；

步骤S2：在步骤S1的溶液中添加环糊精葡萄糖基转移酶与α-淀粉酶按质量比1:1形成的联合酶，添加量为甜菊糖苷添加量的5％，搅拌均匀；

步骤S3：将步骤S2的溶液在70℃条件下反应24h；

步骤S4：待步骤S3的反应完成后，添加淀粉继续反应5h，添加量为步骤S1中的淀粉量的20％；

步骤S5：将步骤S4中的反应物升温至105℃，将酶灭活；

步骤S6：冷却后，将步骤S5的反应溶液用活性炭过滤，除去颜色和杂质；

步骤S7：将步骤S6中获得的溶液配制成质量浓度为5％的溶液，过大孔吸附树脂，直至溶液吸附完全，流速为1BV/h，再用2倍吸附柱体积的水冲洗吸附柱，洗掉残留的糊精；

步骤S8：用4倍吸附柱体积的体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，将大孔吸附树脂树脂间的未反应的甜菊糖苷和酶改制甜菊糖苷混合物洗脱下来，流速为0.5BV/h；流出液紫外吸光度大于0.3时进行收集1-1.5BV体积的流出液；

步骤S9：将流出液浓缩后喷干，获得酶改制甜菊糖苷。

本申请对实施例1-4所得产物，根据国家标准的检测方法，利用HPLC(高效液相色谱)进行定量检测，结果见表1。

表1

实施例5

将实施例1-4制备的酶改制甜菊糖苷与市场购买的酶改制甜菊糖苷样品进行感官评价，评价结果见表2。

表2

从上表结果可知，实施例1与2的甜味品质口感评价为最优的。整体上，与市场上酶改制甜菊糖苷产品相比，本发明的酶改制甜菊糖苷纯度较高具有更好的口感特征。上述表2中甜度倍数是将以2％蔗糖溶液甜度为1作为基础，将各个酶改制甜菊糖苷样品与之进行对比所获得的。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。