阅读说明：本技术 一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法 (Deep processing extraction method for extracting active substances from honey ) 是由 肖维刚 于 2019-01-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法,包括活性生物酶与多糖的分离、活性生物酶提纯、多糖提纯和活性物质保存使用,活性生物酶与多糖的分离,通过盐溶液提取法进行分离提纯,在蜂蜜中添加缓冲液,充分混合搅拌,控制中性盐浓度和混合环境,混合后溶液使用盐析法提取活性酶混合物,在蜂蜜的混合溶液中继续添加中性盐,盐析的过程中将溶液的PH设定在各个活性酶的等电点。本发明使用碱性磷酸盐使得蜂蜜中的活性生物酶与中性盐结合,从而使得活性生物酶与多糖相互之间明显的分离开来,便于后期的对两者分别进行提纯,操作环境控制在低温,中性偏碱性环境中,能够有效的避免其中活性生物酶的失活,以及避免蛋白质的水解。(The invention discloses a deep processing extraction method for extracting active substances from honey, which comprises the steps of separating active biological enzyme from polysaccharide, purifying the active biological enzyme, purifying the polysaccharide and storing the active substances, separating the active biological enzyme from the polysaccharide, separating and purifying the polysaccharide by a salt solution extraction method, adding a buffer solution into the honey, fully mixing and stirring, controlling the concentration of neutral salt and the mixing environment, extracting an active enzyme mixture by using a salting-out method for the mixed solution, continuously adding the neutral salt into the mixed solution of the honey, and setting the pH of the solution at the isoelectric point of each active enzyme in the salting-out process. The invention combines the active biological enzyme and the neutral salt in the honey by using the alkaline phosphate, thereby obviously separating the active biological enzyme and the polysaccharide, facilitating the purification of the active biological enzyme and the polysaccharide respectively at the later stage, effectively avoiding the inactivation of the active biological enzyme and avoiding the hydrolysis of protein by controlling the operating environment at low temperature and in the neutral alkaline environment.)

一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法

技术领域

本发明涉及蜂蜜的加工技术领域，尤其涉及一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜或甘露、蜜露，加入自身消化道的分泌液后，在蜂巢内酿制并存储起来供日后食用的一种食品，蜂蜜中含有 180多种不同的物质，其主要的成分是糖类、包括单糖、二糖、低聚糖和多糖等，单糖中的葡糖糖和果糖占总糖的85％-95％，此外蜂蜜中还含有多种有机酸、氨基酸、蔗糖、维生素、矿物质、酵素、芳香物、色素、激素、酶类和生物活性物质等，营养十分丰富。

蜂蜜的营养价值很高，其含有大量人类需要的生物活性物质，一般可以采用直接食用的方法吸收其营养，蜂蜜内的生物活性物质对温度比较敏感，同时现代工艺中使用的蜂蜜大多为未酿制好的蜂蜜，经过多次的加工，内部的生物活性物质容易失活，造成损失，而蜂蜜里面最有价值也是这些生物活性物质。

蜂蜜中的活性生物酶作为一种天然的催化剂，可以将蜂蜜中的多糖进行分解，分解为人们能够直接吸收的单糖，该活性生物酶目前无法人工合成，活性生物酶的含量有利于蜂蜜的成熟，但是现有的大多数蜂蜜制备只是简单的减少原蜜中的含水量，而不能催化蜂蜜的成熟。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，如：现代工艺中使用的蜂蜜大多为未酿制好的蜂蜜，经过多次的加工，内部的生物活性物质容易失活，造成损失，活性生物酶的含量有利于蜂蜜的成熟，但是现有的大多数蜂蜜制备只是简单的减少原蜜中的含水量，而不能催化蜂蜜的成熟，而提出的一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法，所述从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法包括：活性生物酶与多糖的分离、活性生物酶提纯、多糖提纯和活性物质保存使用；

S1、活性生物酶与多糖的分离：通过盐溶液提取法进行分离提纯，在蜂蜜中添加缓冲液，充分混合搅拌，控制中性盐浓度和混合环境；

S2、混合后溶液使用盐析法提取活性酶混合物，在蜂蜜的混合溶液中继续添加中性盐，盐析的过程中将溶液的PH设定在各个活性酶的等电点；

S3、析出蛋白质沉淀物，固液过滤分离出固体沉淀物和蜂蜜剩余溶液；

S4、活性生物酶提纯：对固体沉淀物使用透析法，将析出的沉淀物与缓冲液再次混合成溶液，使用透析袋分离大分子活性生物酶和中性盐溶液，滞留在透析袋中物质为活性生物酶；

S5、多糖提纯：蜂蜜剩余溶液使用膜分离法去除杂质，使用纤维滤器和半透膜进行分离，输出的为中性盐以及小分子杂质的混合水溶液，留置在纤维滤器内半透膜上的为多糖混合物。

优选的，所述活性生物酶与多糖的分离中分离环境的控制，温度 0℃-5℃，无菌无尘操作箱，提取缓冲液为0.02-0.05M磷酸盐等渗盐溶液，提取过程中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜，环境PH值中性7.0以上，充分搅拌混合。

优选的，所述活性生物酶与多糖的分离中的中性盐采用磷酸铵 (NH4)₃PO₄，磷酸铵在20℃时的溶解度为28.3g/100ml，PH值控制在 6.0以上，盐析的过程中将溶液的PH设定在各个活性酶的等电点。

优选的，所述活性生物酶提纯中缓冲液为0.02-0.05M磷酸盐等渗盐溶液，所述活性生物酶提纯使用分离筒，将析出的沉淀物与缓冲液再次混合成溶液，分离筒内为水，所述分离筒内安装有内置透析袋，混合溶液灌装入内置透析袋内，对内置透析袋内溶液进行缓慢的变速搅拌，使用搅拌桨边搅拌边透析。

优选的，所述多糖提纯中半透膜安装在纤维滤器内，将蜂蜜剩余溶液逐渐输入到纤维滤器内，经过内部的半透膜进行过滤，留置在内部的多糖混合物从半透膜上刮取下来即可。

优选的，提取出来的活性生物酶需要保存，活性生物酶制备成冻干粉或者以晶体状态进行保存，-15℃低温冷冻环境保存，保存时间达到8年，多糖混合物可直接使用投入生产使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.使用碱性磷酸盐使得蜂蜜中的活性生物酶与中性盐结合，从而使得活性生物酶与多糖相互之间明显的分离开来，便于后期的对两者分别进行提纯，操作环境控制在低温，中性偏碱性环境中，能够有效的避免其中活性生物酶的失活，以及避免过于酸或者过于碱的环境中，蛋白质的水解。

2.使用盐析法，利用中性盐在水中溶解度的限制，不断的添加中性盐，将溶液中与中性盐结合的活性生物酶析出，再使用简单的固液过滤将析出的固定沉淀物与溶液进行分离，则活性生物酶从蜂蜜中分离出来了，通过转变为两种不同物理状态进行分离。

3.使用透析法，将析出的沉淀物与缓冲液再次混合成溶液，使用透析袋，滞留在透析袋中的物质为活性生物酶，而被渗透下来的物质为中性盐，活性生物酶的蛋白质分子远大于中性盐，利用分子的大小进行提纯。

4.含有多糖的溶液，使用膜过滤法进行提纯，使用纤维滤器，过滤掉溶液中的小分子杂质以及中性盐，留置下多糖混合物，多糖物质可以直接投入生产使用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

一种从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法，从蜂蜜中提取活性物质的深加工萃取方法包括：活性生物酶与多糖的分离、活性生物酶提纯、多糖提纯和活性物质保存使用；

S1、活性生物酶与多糖的分离：通过盐溶液提取法进行分离提纯，在蜂蜜中添加缓冲液，充分混合搅拌，控制中性盐浓度和混合环境，活性生物酶与多糖的分离中分离环境的控制，温度0℃-5℃，无菌无尘操作箱，提取缓冲液为0.02-0.05M磷酸盐等渗盐溶液，提取过程中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜，环境PH值中性7.0以上，充分搅拌混合；

S2、混合后溶液使用盐析法提取活性酶混合物，在蜂蜜的混合溶液中继续添加中性盐，盐析的过程中将溶液的PH设定在各个活性酶的等电点，活性生物酶与多糖的分离中的中性盐采用磷酸铵 (NH4)₃PO₄，磷酸铵在20℃时的溶解度为28.3g/100ml，PH值控制在6.0以上，盐析的过程中将溶液的PH设定在各个活性酶的等电点；

S3、析出蛋白质沉淀物，固液过滤分离出固体沉淀物和蜂蜜剩余溶液；

S4、活性生物酶提纯：对固体沉淀物使用透析法，将析出的沉淀物与缓冲液再次混合成溶液，使用透析袋分离大分子活性生物酶和中性盐溶液，滞留在透析袋中物质为活性生物酶，活性生物酶提纯中缓冲液为0.02-0.05M磷酸盐等渗盐溶液，活性生物酶提纯使用分离筒，将析出的沉淀物与缓冲液再次混合成溶液，分离筒内为水，分离筒内安装有内置透析袋，混合溶液灌装入内置透析袋内，对内置透析袋内溶液进行缓慢的变速搅拌，使用搅拌桨边搅拌边透析；

S5、多糖提纯：蜂蜜剩余溶液使用膜分离法去除杂质，使用纤维滤器和半透膜进行分离，输出的为中性盐以及小分子杂质的混合水溶液，留置在纤维滤器内半透膜上的为多糖混合物，多糖提纯中半透膜安装在纤维滤器内，将蜂蜜剩余溶液逐渐输入到纤维滤器内，经过内部的半透膜进行过滤，留置在内部的多糖混合物从半透膜上刮取下来即可。

提取出来的活性生物酶需要保存，活性生物酶制备成冻干粉或者以晶体状态进行保存，-15℃低温冷冻环境保存，保存时间达到8年，多糖混合物可直接使用投入生产使用。

蜂蜜中生物活性物质大多数为糖类及其其他生物活性物质，其中含有的酶类是一种特殊的蛋白质，具有极强的生物活性，蜂蜜中含有酶量的多少，即酶值的高低，是检验蜂蜜成熟度的一个重要的指标，蜂蜜中酶主要是蜜蜂在酿蜜的过程中添加进去的，来源与蜜蜂的唾液，主要指甘蔗酶，这种酶能够把花蜜中蔗糖转为葡萄糖和果糖，此外还有淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、还原酶、转化酶、磷酸酶、类蛋白酶等，对蜂蜜里面的这些生物酶进行提取萃取，则可以直接对这些生物酶进行利用，可用于增加蜂蜜的营养价值，提高蜂蜜内糖类的转化率。

首先对收集来的原蜜进行提纯萃取，提取出来的生物酶需要保证生物活性，需要环境控制，其提取的液体温度需要控制在0℃-5℃，液体PH值7.0，提取环境需要采用无菌无尘操作箱，因为蜂蜜为粘稠的液体，在操作的过程中避免环境中的灰尘细菌等杂质进入到蜂蜜中。

对蜂蜜中的酶类进行提取，采用盐溶液提取法，蛋白质、酶是具有等电点的两性电解质，由于酶在PH5.6环境下失活，故而使用偏碱性溶液进行提取，在提取的过程中保证活性酶的活性，同时环境保持在5℃之下以及0℃以上，避免酶失活的同时，也避免提取液结冰，提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜，缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐等渗盐溶液，使用稀盐溶液离子与活性酶即蛋白质的部分结合，这样蜂蜜中的活性酶一类的蛋白质将会与多糖明显区分开。

在提取液中中性盐与活性酶结合，中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，酶的溶解度也将增加，盐溶液即提取的浓度在增加的过程中，活性酶的溶解度不同程度的下降，将会先后析出，将大量的盐加入到活性酶溶液中，高浓度的盐粒子具有强水化力，可夺取活性酶中的水化层，继而活性酶凝结沉淀并析出，盐析的过程中将溶液的PH设定在各个活性酶的等电点，有利于活性酶的析出，中性盐采用磷酸铵(NH4)₃PO₄，在20℃时的溶解度为28.3g/100ml，PH值控制在6.0以上。

析出的沉淀物是活性酶类的蛋白质与中性盐的结合物，需要将其中的盐去除，采用透析法，将析出的沉淀物与缓冲液混合成溶液，装入透析袋中，边搅拌边透析，最终在透析袋中滞留下来的是大分子的活性生物酶，操作环境保持低温。

至此蜂蜜中的大分子活性酶被分离出来且萃取完成，剩下的即为多糖溶液，且剩下的溶液中含有其他的小分子杂质，需要去除，提取出高纯度的多糖可以直接投入食品生产中。

小分子的杂质的存在会影响多糖的生物活性，需要进一步的脱离，提高纯度，此时剩下的溶液中含有水，相应的蜂蜜本身的粘稠度大大降低，对水溶液中多糖的提纯，使用纤维滤器采用膜分离法，小分子物质可以透过，但是由于多糖为大分子物质，无法渗透过去，故而剩下得到为高纯度的多糖，整个提纯的生产周期短，方法简单直接。

至此蜂蜜中可以多次利用的活性生物酶被提取出来之后，制备成冻干粉或者以晶体状态进行保存，-15℃低温保存，被提取保存下来的活性生物酶可以在下一次采集的蜂蜜中使用，模仿蜜蜂酿造的过程，逐步的增加活性生物酶，继而在人工环境下将含水量较多，且分解不充分的原蜜制备成成熟的原蜜，成熟后的原蜜可以直接投入使用，也可以进行提纯分离出活性生物酶和多糖，而分离出来的多糖可以直接投入生产使用。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。