一种人肝细胞性肝癌细胞株及其应用
阅读说明：本技术 一种人肝细胞性肝癌细胞株及其应用 (Human hepatocyte hepatoma cell strain and application thereof ) 是由 蔡秀军 徐俊杰 岑栋 万喆 梁霄 梁岳龙 于 2020-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人肝细胞性肝癌细胞株及其构建方法和应用。肝癌细胞株命名为人肝细胞性肝癌细胞株HCC-DJ711,于2018年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO：C201889。本发明通过从临床肝癌标本提取分离得到细胞,该肝癌细胞株具有很好的动物成瘤特性,可作为研究肝癌发生发展机理的细胞模型。同时可用于肝癌药物筛选和评估,指导临床用药。(The invention discloses a human hepatocyte hepatoma cell strain and a construction method and application thereof. The hepatoma cell strain is named as a human hepatoma cell strain HCC-DJ711, is preserved in China center for type culture Collection in 2018, 4 months and 15 days, and has the preservation number of CCTCC NO: C201889. the cell is extracted and separated from a clinical liver cancer specimen, and the liver cancer cell strain has good animal tumorigenesis characteristics and can be used as a cell model for researching the liver cancer occurrence and development mechanism. Meanwhile, the kit can be used for screening and evaluating liver cancer drugs and guiding clinical medication.)
技术领域
本发明涉及生物学和肿瘤学领域，涉及一种人肝癌细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
肝癌是最为常见的肝脏肿瘤，全世界每年新发肝癌病例约100万人，在全世界范围内位列肿瘤发病率第六，是肿瘤相关性死亡的第三大原因。作为乙肝大国，原发性肝癌是我国最常见的肿瘤，肝癌发病率和死亡率均位居世界前列，每年新发病例和死亡病例占全国病例的50％以上。目前我国肝癌发病率高，死亡率高，治愈率低，往往进展很快，多数患者确诊时已进入中晚期，如已经发生肝内转移、血管侵犯或者远处转移，错过了手术治疗的时机，治疗上存在很大困难。对肝癌的控制、监测和治疗是一项需要耗费大量人力物力的艰巨任务。
肝癌起病隐匿，在早期缺乏特异性症状和较为可靠的相关监测分子。肝癌早期一般无症状，出现临床典型症状，如黄疸、腹水、肝区疼痛时，已经中晚期，治疗手段有限。手术仍然是肝癌病人最有效的治疗手段，但仅有10％-15％的病人有进行肝癌根治术的机会。近年来，肝动脉化疗栓塞术、消融、放疗等手段可在一定程度上改善患者预后，而总体效果与满意尚差之甚远。
人肝癌细胞株是进行肝癌研究中必不可少的实验手段。国内外已经相继建立了HepG2，Huh7，Hep3B，PCL/PRF/5等人肝癌细胞株，能够实现体外连续传代，并在实验动物体内形成肝癌，实现肝癌动物模型建立。这些肝癌细胞株能够模拟肝癌生物学行为，目前进行了广泛应用，为肝癌研究奠定了基础。
但原发性肝癌具有较大的异质性，不同肝癌细胞株具有不同的肿瘤生物学特性，随着对肝癌的研究深入，科研工作者对肝癌的发生发展机理及其他生物学行为的研究要求越来越高。而且目前仍然缺少肝癌药物筛选评估的符合临床肿瘤生物学特征的实验材料。因此，需要建立新的肝癌细胞株及其动物模型进行肝癌的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人肝细胞性肝癌细胞株及其构建方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种人肝细胞性肝癌细胞株，该细胞株命名为人肝细胞性肝癌细胞株HCC-DJ711，于2018年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201889。
本发明还提供如上所述的人肝癌细胞株的子代细胞。
本发明还提供如上所述的人肝癌细胞株的用途，用于制备研究肝癌发生、肝癌发展或肝癌转移的哺乳动物肝癌模型。所述的哺乳动物为裸小鼠。所述肝癌为肝细胞性肝癌。通过将一定数量的所述人肝癌细胞接种于裸小鼠的皮下，获得肝癌动物模型。
本发明还提供所述人肝细胞性肝癌细胞株的构建方法，包括以下步骤：
获得新鲜的人肝癌组织用PBS清洗，加入少量新鲜的胶原酶-4溶液后尽量剪碎。剪碎后转移至15ml离心管，并加入10ml新鲜胶原酶-4溶液，37℃、5％CO2下孵育60分钟。加入RPMI 1640培养液(含10ng/ml重组人表皮生长因子，10μg/ml重组人胰岛素，6.7ng/ml亚硒酸钠，5.5μg/ml转铁蛋白，10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B)终止消化后，利用70μm滤网过滤。过滤后的液体1000rpm，20℃下离心5分钟。弃上清，加入20ml上述RPMI 1640培养液，800rpm，20℃下离心5分钟。弃上清，加入20ml上述RPMI 1640培养液，600rpm，20℃下离心5分钟。取沉淀最上层部分，加入上述RPMI 1640培养液，转移至培养瓶培养。24小时后更换新鲜培养液。细胞传代至第5代后，将培养液更换为DMEM/F12(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B)。
本发明还提供一种筛选治疗肝癌候选药物的方法，包括以下步骤：
稳定生长的HCC-DJ711细胞接种于筛药模块的384孔板，候选药物来源于MCE的FDA认证化合物库。每个孔加入候选药物，在药物筛选平台中培养48小时进行细胞ATP assay检测，反应细胞活性，判断细胞对药物的敏感程度。每种药物测试设计3个复孔，多次检测，以避免误差。最后根据数据，分析药物敏感性。
本发明的有益效果是：本发明的人肝细胞性肝癌细胞株可多次传代，体外性状稳定，并且符合临床肿瘤生物学特性。所述人肝癌细胞具有成瘤性，可以成功制备肝癌动物模型。所述肝癌细胞株和肝癌动物模型，均能用于肝癌发生发展的机理研究。还可以利用所述肝癌细胞分析药物敏感性，进行肝癌药物筛选和评估，可用于指导临床用药，有利于发现新的抗肝癌药物。具有良好的科研价值和经济效益。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
图1为人肝细胞性肝癌细胞株显微镜下观察的细胞形态。
图2为人肝细胞性肝癌细胞株进行CD73荧光染色标记。
图3为人肝细胞性肝癌细胞株。
图4为化合物筛选肝癌细胞株存活率情况。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1HCC-DJ711细胞制备
原代细胞培养：将浙江大学医学院附属邵逸夫医院获得新鲜的临床肝癌切除标本(病人，男，59岁，右肝肝细胞性肝癌，中-低分化，肿瘤大小为4×3cm，肝组织内多灶性生长，伴脉管内癌栓形成，局灶累及肝包膜外脂肪组织，结节性肝硬化)立即分离新鲜肝癌标本。在生物安全柜中，用新鲜PBS漂洗后，加入新鲜2g/L胶原酶-4溶液(含500U/ml青霉素、500μg/ml硫酸链霉素、1.25μg/ml两性霉素B)少量，去除血用消毒灭菌的剪刀尽量切碎，剪碎后转移至15ml离心管，并加入10ml新鲜上述胶原酶-4溶液，充分混合，37℃、5％CO2下孵育60分钟。加入RPMI 1640培养液(含10ng/ml重组人表皮生长因子，10μg/ml重组人胰岛素，6.7ng/ml亚硒酸钠，5.5μg/ml转铁蛋白，10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B)终止消化后，用70μm滤网过滤。过滤后的液体1000rpm，20℃，离心5分钟。弃上清，加入20ml上述RPMI 1640培养液，800rpm，20℃，离心5分钟。弃上清，加入20ml上述RPMI 1640培养液，600rpm，20℃，离心5分钟。取沉淀最上层部分，加入上述RPMI1640培养液，转移至培养瓶培养。24小时后更换新鲜培养液，除去细胞碎片和血细胞。以后每48小时更换上述RPMI 1640培养液。
细胞传代培养：当培养瓶底部长满细胞后，进行细胞传代培养。具体步骤如下：弃去旧培养基，新鲜PBS溶液清洗细胞并弃去。瓶中加入1ml新鲜0.05％胰蛋白酶溶液，并使其均匀置于培养瓶底，37℃培养箱孵育，观察到细胞质回缩，细胞间隙增大后，加入2ml上述RPMI1640培养液，小心吹打下所有贴壁细胞，收集并离心(800rpm,20℃，5分钟)，弃去上清液，加入新鲜RPMI 1640培养基，接种于新的培养瓶。当细胞传代至第5代后，将培养液更换为DMEM/F12(10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B)。细胞稳定生长，形态均一，呈现上皮细胞样形态。传代20代以上。
本发明中，肝癌细胞呈上皮样形态，细胞形态均一，无接触抑制。细胞生长速度稳定。将细胞命名为人肝细胞性肝癌细胞株HCC-DJ711，于2018年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:C201889。
实施例2人肝癌细胞的生物学及应用
本发明采用含有胎牛血清的DMEM/F12培养液培养HCC-DJ711细胞，使其体外长期生长并稳定传代。显微镜下观察，HCC-DJ711细胞具有典型的上皮细胞样形态，失去接触生长抑制，恶性生长。一定量的HCC-DJ711细胞能在裸小鼠皮下形成肿瘤，说明细胞具有致瘤性能。该细胞能够用于肝癌发生发展机理研究。同时可用于抗肝癌药物筛选和评估，发现对肝癌敏感药物，用于指导临床用药，开拓肝癌治疗新思路。具体如下：
形态学观察
将培养有HCC-DJ711细胞的培养瓶置于倒置显微镜观察并拍照。如图1所示，细胞呈恶性生长，失去接触抑制。细胞呈现扁平状，部分重叠生长，呈上皮细胞的形态特点。
细胞成分分析
由于肝癌原代细胞提取过程中，成纤维细胞和肝癌细胞均会被提取出来，若成纤维细胞比例过多，影响肝癌原代细胞生长。CD73可以特异性标记在成纤维细胞的细胞膜上，而肝癌细胞几乎不标记。CD73荧光染色(图2)可以发现HCC-DJ711的CD73荧光强度微弱，证明细胞中无成纤维细胞。
细胞成瘤性
HCC-DJ711细胞稳定传代后，大规模扩增细胞并收集细胞。以每只动物接种5×106的细胞量进行裸小鼠腋下皮下接种。每隔3天观察小鼠体重和皮下肿瘤情况。发现2周后肿瘤形成并持续生长。2个月后安乐处死小鼠，观察肿瘤。可以发现肿瘤成鱼肉样，质地软，与周围组织边界清晰，与临床肝癌标本性状类似。
药物筛选和评估
将HCC-DJ711细胞接种于筛药模块的384孔板，候选药物来源于FDA认证化合物库。每个孔加入候选药物，在药物筛选平台中培养48小时后，进行细胞ATP assay检测，反应细胞活性，判断细胞对药物的敏感程度。每种药物测试设计3个复孔，多次检测，以避免误差。
以肝癌治疗一线药物索拉非尼作为阳性对照，以其细胞存活率(30％)为标准，筛选杀伤能力优于或接近阳性的化合物。
结果发现对已有的395个化合物进行筛选，共可筛选出42个化合物，如图4、表1所示。
表1为筛选出的42种药物或化合物及其潜在靶点或临床应用
以上实施例用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。