阅读说明：本技术 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 (Method for rapidly detecting retrovirus by cell ultrathin section electron microscope ) 是由 张宾 孙莉 王蕾 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法,步骤包括：1)样品的收集与固定；2)醋酸铀块染；3)脱水、渗透和聚合；4)切片、染色后透射电镜检测。本发明与传统方法相比,极大的提升了样本制备的效率,使传统的5-7天制样周期缩短至1天,并使一种快速检测病毒的超薄切片技术成为了可能。优化后的超薄切片电镜技术检测病毒,相比传统的病毒检测方法,大幅提高了病毒检测的特异性、准确性和检测效率。(The invention discloses a method for rapidly detecting retrovirus by a cell ultrathin section electron microscope, which comprises the following steps: 1) collecting and fixing a sample; 2) uranium acetate lump dyeing; 3) dehydration, infiltration and polymerization; 4) and (5) slicing, dyeing and detecting by using a transmission electron microscope. Compared with the traditional method, the invention greatly improves the efficiency of sample preparation, shortens the traditional sample preparation period of 5-7 days to 1 day, and makes an ultrathin section technology for rapidly detecting viruses possible. Compared with the traditional virus detection method, the optimized ultrathin section electron microscope technology for detecting the virus greatly improves the specificity, the accuracy and the detection efficiency of virus detection.)

一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物领域和医疗健康领域，特别是涉及生物制品安全性检测领域和未知病毒形态学快速检测和判断，具体涉及一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法。

背景技术

生物制品是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的产品。人用生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、体内及体外诊断制品，以及其他生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节及微生态制剂等。

在生物制品的生产和应用过程中会遇到一些诸如安全性的问题。如抗体药物，单克隆抗体中小鼠杂交瘤细胞的使用，容易使单抗制品出现内源性病毒污染的可能；而多克隆抗体主用采用动物血清制备，也同样存在动物血清来源的安全性问题。目前，很多基因制品涉及蛋白表达载体的构建，这种构建的细胞系容易出现病毒感染的隐患。如疱疫病毒(EBV)转染的人成淋巴细胞系与小鼠骨髓瘤细胞融合后，其分泌的单克隆抗体容易出现小鼠逆转录病毒的感染。再者，基因重组蛋白制品所使用的表达细胞系本身含有内源性病毒，如中国仓鼠卵巢细胞自身存在内源性逆转录病毒，这也使得其分泌的蛋白存在安全隐患。作为生物制品的来源，均存在被细菌、病毒等微生物污染的可能性，因此在药品安全性问题上，生物制品与传统药品最大的不同是：生物制品存在内源性病毒污染的可能。因此，WHO、美国FDA、中国CFDA以及欧洲相关部门已经出具相应法规并规定：存在内源性污染的生物制品，在生产工艺中必须具备去除/灭活内源性污染的工艺，而且，必须对此工艺及产品进行生物安全性检测以排除生物制品制备工艺及产品潜在的病毒污染。

另外，医疗健康领域也需要进行病毒检测。病毒性感染可由多种病毒引起，但临床表现均有畏寒、发热、全身倦怠无力、食欲减退等全身中毒症状及受侵组织器官炎症的表现。人体的病毒性感染分为隐性感染、显性感染、慢病毒感染。多数情况下的感染呈隐性感染。少数为显性感染。显性感染中多数病毒性感染表现为急性感染，发病急、病程短，多在1～2周内自愈，少数表现为潜伏性感染（如疱疹病毒感染等）和慢性感染（如乙型肝炎病毒感染等）。

电子显微镜在病毒学研究中发挥着重要作用，尤其是在病毒粒子的鉴定、形态学研究和病毒检测方面，超薄切片透射电镜技术是一种最为直接和有效的方式来检测病毒颗粒的存在。无论是从病毒形态学和病毒发生学上，都能通过超薄切片电镜技术获得清晰和准确的结果。但由于传统的超薄切片样本制备方法复杂，周期较长，需投入大量的人力和时间成本，无法实现超薄切片电镜技术的快速检测，这也使得超薄切片电镜技术无法在竞争剧烈的制药领域内得到更好的应用。因此，根据传统方法的原理进行优化和创新，是解决当前问题的根本所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法。与传统方法相比，极大的提升了样本制备的效率，使传统的5-7天制样周期缩短至1天，并使一种快速检测病毒的超薄切片技术成为了可能。优化后的超薄切片电镜技术检测病毒，相比传统的病毒检测方法，大幅提高了病毒检测的特异性、准确性和检测效率。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，该方法包括如下步骤：

I.样品采集，清洗后用戊二醛和锇酸双重固定；

II.醋酸铀块染；

III.丙酮脱水后环氧树脂梯度渗透，再将样品纯树脂聚合；

IV.超薄切片、染色后透射电镜检测。

作为本发明优选的技术方案，在步骤I中，所述样品采集为：收集1-2×107个细胞样本；

作为本发明优选的技术方案，在步骤I中，所述清洗具体方法为：用1×PBS清洗3-5遍；

作为本发明优选的技术方案，在步骤I中，所述双重固定具体方法为：5%戊二醛(体积百分比)固定8-12小时左右，再进行1%锇酸(质量体积百分比)固定0.5-1小时左右。

作为本发明优选的技术方案，在步骤II中，所述醋酸铀块染，在2-8℃冰箱放置2-3小时，减少样本的晃动；

作为本发明优选的技术方案，在步骤III中，所述丙酮脱水具体方法为：用70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各脱水5分钟，脱水时放置在摇床上震荡。

作为本发明优选的技术方案，在步骤III中，所述环氧树脂梯度渗透具体方法为：丙酮：环氧树脂=1:1渗透20分钟后纯树脂渗透2小时，渗透时放置在摇床上震荡。

作为本发明优选的技术方案，在步骤III中，所述纯树脂聚合具体方法为：样本在纯树脂60℃聚合处理，不少于10小时。

作为本发明优选的技术方案，在步骤IV中，所述超薄切片为70-100nm，铜网承载。

作为本发明优选的技术方案，在步骤IV中，所述染色具体方法为：柠檬酸铅片染，常温下染色10-15分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明为细胞库病毒检测提供一种更为直观、形象、快捷的检测方法；

2.本发明使用的样本处理方式，极大的缩短了样本制备的操作时间；传统方法样品制备需要7天，本发明优化的方法制备样品只需要1天，大幅度减少时间成本和人力成本，增加项目安排的灵活性，并增加单位人员产出，并减少干扰因素的影响；

3.本发明使用醋酸双氧铀块染，增加了切片衬度，也减少了染液污染；

4.本发明相对于传统方法，样品树脂块质地硬，便于切片；

5.本发明切片前染色，可消除污染；

6.本发明使用裸网，直接承载，相对于传统方法去除了承载膜的影响，减少了干扰因素；

7.本发明极大的提升细胞衬度，并对细胞亚显微结构提供了更清晰的展示，增加了细胞切片的丰富度，增强了细胞器和其它颗粒物的清晰度，消除了其他干扰物质对观察病毒的影响，增加了各结构的辨别度；

8.本发明对其他可能存在的颗粒内含物的观察，提供了更为有效的检测途径。

附图说明

图1是实施例1中采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法和本发明方法制备的样本图片对比示意图；图1中，A、B是采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法制备的样本图片；a、b是采用SP2/0-H-A3-细胞用本发明优化方法制备后的超薄切片的样本图片；白色箭头标示为高尔基体、黑色箭头标示为线粒体，白色粗箭头标示为内质网。

图2是实施例1中采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法和本发明方法制备的电镜图片下内源性病毒颗粒的对比示意图；图2中，C是采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法制备的电镜图片，c是采用SP2/0-H-A3-细胞用本发明优化方法制备后的电镜图片；白色箭头标示处内源性病毒颗粒。

图3是实施例1中采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法和本发明方法制备的电镜图片下分泌性病毒颗粒的对比示意图；图3中，D是采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法制备的电镜图片，d是采用SP2/0-H-A3-细胞用本发明优化方法制备后的电镜图片；白色箭头标示处是分泌性病毒颗粒。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。

实施例1：

一、实验步骤：

本发明提供了一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒技术，其包括如下步骤：

步骤1：收集1-2×10⁷个细胞样本，1×PBS清洗3遍后，5%戊二醛固定12小时，再进行1%锇酸固定30分钟；

步骤2：醋酸铀块染色，在2-8℃冰箱放置2-3小时，减少样本的晃动；

步骤3：丙酮脱水和过度处理，70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各脱水5分钟，脱水时应放置在摇床上进行；

步骤4：丙酮：环氧树脂=1:1渗透20分钟后纯树脂渗透2小时，此步骤需放置在摇床上进行；

步骤5：样本在纯树脂60℃聚合处理，至少10小时；

步骤6：超薄切片70-100nm，铜网承载；

步骤7：柠檬酸铅片染，常温下染色10-15分钟；

步骤8：透射电镜检测。

传统方法和本发明方法对比如下表1：

表1

二、实验结果：

1.图1中A、B为细胞传统方法制备的样本，经超薄切片在电镜下观察可见：除细胞核和部分线粒体能够被分辨出来外，其他亚显微结构比较模糊，分辨度不佳；而图1中a、b为优化后的超薄切片样本制备在电镜下观察，结构清晰，衬度明显，除细胞核和线粒体外，能够清晰分辨内质网、高尔基体和其它重要泡状结构。优化后的方案不仅能在细胞亚显微结构的清晰度上进行提升，而且还高衬度展示了传统方法无法达到的细胞基质内各细胞器丰度。

2.通过对比传统方法和优化方法电镜样本制备后的电镜图片可以发现（见图2中C和c），传统方案下的内源性病毒颗粒颜色较深，与细胞质背景反差较大，较容易区分病毒与其它干扰颗粒；优化方案下的内源性病毒颗粒，虽然也有较深的着色，但细胞质背景颜色也比较深，整体对比不如传统方案的明显反差。但制备效果没有差异，都能反映出病毒簇的集中分布。除此之外，优化后的方案能显示出病毒簇周围分布的大量内质网和线粒体，这与病毒在胞内组装引起宿主细胞器变化的报道相一致。除此之外，优化方案带来的更为清晰的细胞结构，为观察和发现更多除目标颗粒外的其它结构提供了有利的方法基础。

3.对比传统方法和优化方法下的分泌性病毒颗粒（见图3中D和d，白色箭头标示处），两种情况下的电镜结果差异较小，都能拍摄出胞外病毒颗粒的核壳结构。两者在病毒的辨认度上都有较好的表现，都可以实现分泌型胞外病毒颗粒的检测。

三、结果分析

1.从上述对比试验结果可知，本发明大幅度减少时间成本和人力成本，增加项目安排的灵活性，并增加单位人员产出，并减少干扰因素的影响。本发明方法与传统方法在时间成本和人力成本、以及干扰因素影响上的具体对比见下表2：

表2

2.极大提升图片衬度和细胞器的丰富度。

基于超薄切片电镜技术原理，对传统电镜制样方法进行了改良，可以发现本发明优化的方案能极大的提升细胞衬度，并对细胞亚显微结构提供了更清晰的展示，提升了胞内细胞器丰度，增加了各结构的辨别度，更清晰直观的反映出病毒在宿主细胞内外的整个生理过程。除此之外，从实验操作的角度上，优化的方案更为简洁，省去了大量的等待时间，使样品制备过程由原来的1周缩短至了1天，极大的减少了实验操作的时间成本。另外，从人员成本上，优化方案也为人员的灵活调配带来了很大的优势，优化方案使项目排产更为灵活，为以后的业务增长提前打好了坚实的基础。同时，与传统方案的项目开展相比，预测优化方案后将额外节省出一倍的时间用于项目切片和报告。因此，此次方法工艺的优化，将对工作的开展具有极其高效的推动作用。