阅读说明：本技术 一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺 (Process for improving kidney-tonifying and yang-strengthening effects of globefish skin ) 是由 付鹏磊 王文超 于文静 王冠丹 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺,属于海洋生物技术领域。本发明以河豚鱼皮为原料,集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术,研制开发出高补肾壮阳功效的河豚鱼皮多肽生物制品,其中混菌好氧发酵菌种主要包括黑曲霉和枯草芽孢杆菌。所得河豚鱼皮多肽提取液具有较强的补肾壮阳功效,可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理,满足在保健、食品、医药、化妆品等领域的高效利用。该工艺技术简单高效、所得产品补肾壮阳功效强；产品稳定性强,生产成本低,易于工业化规模生产。(The invention discloses a process for improving kidney-tonifying and yang-strengthening effects of globefish skin, and belongs to the technical field of marine organisms. The invention takes globefish skin as a raw material, integrates the modern bioseparation technology, the biological enzymolysis technology and the mixed bacteria microbial fermentation technology, and develops the globefish skin polypeptide biological product with the effects of tonifying kidney and strengthening yang, wherein the mixed bacteria aerobic fermentation strain mainly comprises aspergillus niger and bacillus subtilis. The obtained globefish skin polypeptide extract has strong kidney-tonifying and yang-strengthening effects, can be subjected to concentration, adsorption drying, alcohol precipitation or resin purification and other treatments according to application ways, and can be efficiently utilized in the fields of health care, food, medicine, cosmetics and the like. The process is simple and efficient, and the obtained product has strong kidney-tonifying and yang-strengthening effects; the product has strong stability and low production cost, and is easy for industrial mass production.)

一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺

技术领域

本发明涉及一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，尤其是一种利用微生物协同发酵联合酶解工艺制备具有显著补肾壮阳功效的河豚鱼皮多肽生物制品，属于海洋生物技术领域。

背景技术

据史料记载，我国食用河豚鱼已有四千多年的历史，但是古人对食用河豚鱼也是褒贬不一，既有“甘美远胜西子乳，吴王当年未曾知”对河豚鱼肉美味的赞美，又有“庖煎苟失所，入喉为镆铘”对食河豚的规劝。由于河豚含有河豚毒素，每年都有因食用河豚丧命者，因此我国禁食河豚鱼。2016年，国家对红鳍东方鲀和暗纹东方鲀实行解禁，禁止了26年之久的河豚鱼可以被端上消费者的餐桌，这无疑推动了河豚养殖业的发展，也使人们能够一饱口福。随着河豚市场的开放和人工养殖无毒河豚鱼产业的发展，国内的河豚鱼需求将会逐渐增加，研究河豚鱼的营养价值及其副产物的综合利用对未来河豚鱼养殖及加工产业的发展有着重要意义

河豚鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，胶原蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、促进伤口愈合以及美容等功效，已被广泛用于食品、化妆品、医药行业。目前，以猪、牛等哺乳动物为来源的胶原蛋白受到口蹄疫、疯牛病等多种感染性疾病的威胁，鱼皮、鱼鳞胶原蛋白是替代它们的较好来源。河豚鱼皮中胶原蛋白含量较高，提取率也较其他哺乳动物胶原蛋白的提取率高。任俊凤测定的红鳍东方鲀鱼皮中蛋白质含量约为鱼皮干重的97.30%，胶原蛋白含量占总蛋白含量的90%。从河豚鱼皮中提取胶原蛋白肽，通过测定其对自由基OH·、DPPH·、O₂ ^—·的清除能力发现河豚鱼皮胶原蛋白肽具有很强的抗氧化性。

目前，我国对河豚鱼的研究利用还处于初级阶段，随着国家对河豚鱼限制的逐渐解除，对河豚鱼的研究将会更加全面。现有技术中，关于河豚鱼皮多肽及其在食品中的应用研究较少，如专利201510951376.5公开了一种复合发酵型河豚鱼皮保健饮料的生产工艺，选用玛河豚鱼皮、海参、枸杞、山楂、山药、红景天、甜叶菊、何首乌、刺五加、人参、肉苁蓉、葛根、甘草为原料通过复合发酵生产工艺生产豚鱼皮保健饮料；但利用河豚鱼皮制备补肾壮阳功能性生物制品的研究报道较少。随着社会发展与进步，生活节奏也变得日趋紧张，很多人精力与体力透支，逐步进入亚健康状态，容易出现面白无力、四肢发冷、烦躁盗汗、阳痿早泄、未老先衰等表现。因此，利用河豚鱼皮开发补肾壮阳功能性生物制品对促进河豚鱼皮资源化利用具有重要作用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，满足河豚鱼皮多肽高效提取及高补肾壮阳功效应用，本申请提供一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外补肾壮阳功效的河豚鱼皮多肽生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对河豚鱼皮多肽的应用需求，该工艺简单高效、所得产品补肾壮阳功效强，生产成本低，易于工业化规模生产。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；

（2）酶解：向匀浆后的加入3000～5000U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3～5%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12～24h；

（4）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（5）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（6）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。

上述步骤（1）中最佳加水比例为河豚鱼皮：水=1:8。

优选的，在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮质量比10～20%的鲍鱼和2～3%的螺旋藻。

上述步骤（2）中所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的一种和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1。

最优的，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1。

上述步骤（3）中所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1。

上述步骤（3）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300r/min。

黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

本发明提供一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，所得河豚鱼皮多肽具有较强的补肾壮阳功效，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药、化妆品等领域的高效利用。

本发明提供一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：

（1）本申请以河豚鱼皮为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了河豚鱼皮补肾壮阳功效；尤为重要的是，本申请创造性的发现，在河豚鱼皮蛋白溶解液中加入一定比例的鲍鱼和螺旋藻后可以显著提高酶解发酵法制备的河豚鱼皮多肽的补肾壮阳功效；

（2）本申请利用好氧菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌）共同发酵河豚鱼皮提取河豚鱼皮多肽，充分利用微生物间的协同作用，提升河豚鱼皮多肽的提取率和体外补肾壮阳功效，其中：黑曲霉在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的多肽等功能活性物质从细胞壁中释放出来，有利于提升河豚鱼皮多肽的体外补肾壮阳功效；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；黑曲霉与枯草芽孢杆菌的协同作用显著提升了产品的补肾壮阳功效；

（3）本发明采用发酵没法提高河豚鱼皮多肽的补肾壮阳功效，在本申请工艺条件下直接以河豚鱼皮为原料，无需通过水洗提取胶原蛋白去除非胶原蛋白，节约生产用水；且本发明发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产。

具体实施方式

在本申请中，黑曲霉和枯草芽孢杆菌的活化方法如下：

（1）黑曲霉种子液制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL；

（2）上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

实施例1

一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，具体工艺步骤包括：

（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；

（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300r/min；

（4）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（5）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（6）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。

实施例2

一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，具体工艺步骤包括：

（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；

（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300r/min；

（4）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（5）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（6）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。

实施例3

一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，具体工艺步骤包括：

（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮蛋白质量比10%的鲍鱼、2%螺旋藻；

（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300r/min；

（4）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（5）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（6）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。

实施例4

一种提高河豚鱼皮补肾壮阳功效的工艺，具体工艺步骤包括：

（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮蛋白质量比20%的鲍鱼、3%螺旋藻；

（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300r/min；

（4）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（5）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（6）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。

实施例5

参照任俊凤《河豚鱼皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化性的研究》测定提取液中肽得率及对羟自由基（OH·）的清除作用；阳性对照组采用任俊凤采用的实验方法制备的河豚鱼皮提取液，对照1组仅采用酶解法，不含发酵工艺，其余同实施例3；对照2组仅采用发酵工艺，不含酶解工艺，其余同实施例3；实验结果如下：

实施例6

试验动物：雄性ICR小鼠，体质量（20±2）g；

分组与给药：110只ICR雄性小鼠，在实验条件下适应5天后，分为8个试验组，每组10只。其中实施例1-4试验组给予本发明补肾壮阳提取液，阳性对照组、对照1组和对组2组分别给予实施例5所述方法制备的提取液，空白对照组ig小鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃剂量均为2g.Kg^-1。30天后测定各项指标；

负重游泳实验：参照《保健食品检验与评价技术规范》要求对雄性小鼠进行负重游泳实验和常压耐缺氧实验。将小鼠末次灌胃给药30min后，在小鼠尾根部1/3～2/3处负荷体重的5%铅皮，在水深30cm水温（30±2）℃的水中游泳，同时准备多个60cm×40cm×50cm水槽，并用秒表记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，小鼠头部沉入水中7s不起为计时终止时间；

常压耐缺氧实验:参照《保健食品检验与评价技术规范》要求对雄性小鼠进行常压耐缺氧实验。将小鼠末次灌胃给药1h后，5g钠石灰用纱布包裹放入250mL的广口瓶中，将小鼠放入瓶中（每瓶1只），瓶口立即涂抹凡士林盖严，用秒表记录小鼠自放入瓶中开始至出现全身痉挛症状的时间，并迅速将小鼠取出；

血清NO和睾酮（T）值测定:将小鼠经常压耐缺氧实验后休息60min，摘眼球取血存于1.5mL离心管中，4000r/min离心5min后取上层血清，按照NO和睾酮试剂盒说明书操作处理样品并用酶标仪测定含量；

试验结果如下表所示：

上述实验结果表明本申请产品具有显著的补肾壮阳功效，以实施例3组补肾壮阳效果最优，为本发明最佳实施例。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。