阅读说明：本技术 一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法 (Test method for basophil activation and degranulation ) 是由 季江 焦晴晴 赵莹 魏钰倩 苏文星 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法,包括：稀释待测过敏原制成标准待测过敏原,设立阳性对照和阴性对照；所有待测样本为肝素化的患者外周血,需封口孵育；随后加入缓冲液,离心；加入荧光染色混合液,轻混至沉淀物再悬浮,避光孵育；加入红细胞裂解液,漩涡混匀,避光孵育；稀释,离心,再悬沉淀物；过滤后添加缓冲液,采用流式细胞仪检测,得到活化、脱颗粒比例。本发明提供的嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法,无需分离纯化嗜碱性粒细胞,选用新的特异性嗜碱性粒细胞标记物组合,所测样本用量小,重复性好,误差小,有效分辨嗜碱性粒细胞的活化、脱颗粒程度,更好地为相关疾病临床鉴别诊断和科研项目提供检测和技术支持。(The invention relates to a test method for basophil activation and degranulation, which comprises the following steps: diluting the allergen to be tested to prepare standard allergen to be tested, and establishing a positive control and a negative control; all samples to be detected are heparinized peripheral blood of patients, and need to be sealed for incubation; then adding a buffer solution, and centrifuging; adding the fluorescent staining mixed solution, gently mixing until the precipitate is suspended again, and incubating in a dark place; adding erythrocyte lysate, mixing uniformly by vortex, and incubating in dark place; diluting, centrifuging and suspending the precipitate; and (3) filtering, adding a buffer solution, and detecting by using a flow cytometer to obtain the proportion of activated particles to the particles. According to the basophil activation and degranulation testing method provided by the invention, separation and purification of basophils are not needed, a new specific basophil marker combination is selected, the dosage of a tested sample is small, the repeatability is good, the error is small, the activation and degranulation degrees of the basophils are effectively distinguished, and detection and technical support are better provided for clinical differential diagnosis and scientific research projects of related diseases.)

一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法

技术领域

本发明属于过敏性疾病诊断的技术领域，具体涉及一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法。

背景技术

随着全球日趋严重的环境污染、化学品滥用、电离辐射、转基因食品、以及各式各样的食品添加剂等以一系列问题的不断出现，“过敏”成为了人类健康的又一大“杀手”。据报告，全世界有30％-40％的人被过敏问题困扰，涉及多个器官和系统，例如皮肤过敏反应、呼吸道过敏反应、胃肠道过敏反应及过敏性休克等。2018年流行病学数据显示，全世界3亿人患有哮喘，4亿人有湿疹及特异性皮炎，超过5亿人患有变应性鼻炎。过敏性疾病的自然进程是过敏原的种类日益增多，例如新合成的食品添加剂、工业原料、化学试剂，甚至部分新型药物等；临床症状多变。过敏是一种复杂的免疫系统疾病，临床表现多样化，如过敏性鼻炎、哮喘、荨麻疹、过敏性皮炎和湿疹等，严重时导致过敏性休克、喉头水肿，哮喘突发或持续状态，有生命危险。过敏离我们并不遥远，轻者影响生活质量，严重者亦可有生命威胁，例如一代歌后邓丽君就是哮喘突发去世的，32岁的好莱坞女星Brittany Murphy则是因药物过敏抢救无效意外身亡。作为过敏性疾病的主要效应细胞，嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒释放组胺是其发挥生物学功能启动过敏进程的关键步骤。鉴于嗜碱性粒细胞在人外周血中较易获得的特性，因此，嗜碱性细胞激活实验(Basophil activation test，BAT)是迄今为止目前国际上相关实验室正在使用的相对有效的体外过敏原检测手段。遗憾的是，实践结果显示目前常用的生物标记物组合使得BAT检测在不同个体之间的准确度、灵敏性和特异性差异较大，再加上有些过敏患者本身外周血嗜碱性粒细胞水平就较低，因此，导致目前BAT还没有被纳入常规的临床检测手段，只是应用于部分临床研究。因此，寻找新的、更特异的嗜碱性粒细胞激活表面标记物以改进这一基于外周血嗜碱性粒细胞组胺释放的过敏原检测方法，有望可以有效的克服上述缺陷，达到高效、准确的检测到过敏原的目的。

发明内容

为解决现有临床和科研应用中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法。

为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用以下技术方案来实现：

一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法，包括以下步骤：

步骤(一)、样品和相关试剂准备

S1、对待测过敏原进行等比例稀释，按顺序编号后作为标准待测过敏原；

S2、制备阳性对照和阴性对照；

S3、用无菌双蒸水按1:10-12的比例稀释红细胞裂解液，备用；

步骤(二)、样品孵育和检测

S4、将步骤S1-S2制备的阳性对照、阴性对照和标准待测试过敏原样品分别转移至流式细胞上样管中，每管中分别添加100-120μL待测肝素化患者血液，封口孵育；

S5、向上述步骤中得到的所有样本中加入2-4mL PBS/EDTA，于4℃、340g离心力条件下离心10-15min，吸出上清液；

S6、向所有样本中分别加入50-60μL荧光染色混合液，轻混至沉淀物再悬浮，室温避光孵育；

S7、向所有样本中分别加入红细胞裂解液，漩涡10-15s，避光孵育；

S8、向所有样本中加入PBS缓冲液，离心，弃上清；

S9、重悬沉淀物，随后过滤，制成单细胞悬液；

S10、向所有样本中添加300-320μL MACS缓冲液，保存，等待检测；

将上述所得样本采用流式细胞仪进行检测，在门控模式下根据染色标记物的平均荧光强度来分析嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的比例。

进一步的，步骤S1中，使用RPMI 1640培养基作为稀释缓冲液，选择牛奶、花粉、尘螨、花生等易致敏物质的提取液作为待测过敏原，使用RPMI 1640培养基对待测过敏原进行1:7-9等比例稀释，依次稀释后按顺序编号，作为标准待测过敏原样品。

进一步的，步骤S2中，制备阳性对照的步骤为：

步骤S21、将人源性IgE抗体使用PBS稀释成1：10-12；

步骤S22、用90-100μL培养基稀释10-20μL步骤S21所得人源性IgE抗体，制成阳性对照。

进一步的，所述培养基为RPMI 1640培养基，其组分包括：10％FCS、100U青霉素、100μg/mL链霉素。

进一步的，步骤S3中，所述红细胞裂解液为：取8.29g NH₄Cl、1.00g KHCO₃、37.2mgNa₂EDTA，溶于1000mL蒸馏水中制配而成。

进一步的，步骤S4中，将步骤(一)中的步骤S1-S2所得阳性对照、阴性对照和标准待测试过敏原分别等量转移至带编号的流式细胞上样管中，每管的总体积均为100-120μL，随后向每管中添加100-120μL肝素化待测患者血液，用封口膜密封所有样本，轻轻摇动并放置在孵育箱中，于37.0-37.5℃、3-5％CO₂条件下孵育10-15min。

进一步的，步骤S6中，所有样本中分别加入50-60μL荧光染色混合液，轻轻混合，不涡旋，轻轻的重悬细胞，在室温、黑暗中孵育30-45min。

进一步的，向所有样本中分别加入50-60μL荧光染色混合液(CD3、CD63、CD203c以及CCR3)，轻轻混合，不涡旋，轻轻的重悬，在室温、黑暗中孵育样品30-45分钟，再分别加入红细胞裂解液，在漩涡振荡器上低速漩涡样本10-15秒，并在室温、暗处孵育5-10min。

进一步的，步骤S6中，所述荧光染色混合液为：取35-39μL FACS缓冲液，依次加入1-2μL丙种球蛋白、2-3μL VioBlue荧光标记的CD3、5-6μL FITC荧光标记的CD63、2-3μL PE荧光标记的CD203c和3-4μL APC荧光标记的CCR3制配而成。

进一步的，步骤S10中，向上述得到的所有样本中加入2-4mL PBS，将样品在4℃、340g离心力条件下离心10-15min，弃上清液，再次重悬，若肉眼仍可见红色，重复离心，经过多次离心、悬浮直至没有红色沉淀物出现为止；以30μm孔径的无菌细胞滤器过滤所有样品，制备成单细胞悬液，随后向所有样本中添加300-320μL MACS缓冲液，在4℃温度下保存，等待检测。

进一步的，步骤S10中，所述MACS缓冲液为溶解于PBS中的1％BSA和2mmol/L EDTA。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明公开了一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法，包括以下步骤：稀释待测过敏原作为标准待测过敏原，同时设立人源性IgE抗体为阳性对照，培养基为阴性对照；所有待测样本为肝素化的患者外周血，需封口孵育；随后加入PBS/EDTA，离心，吸出上清液；接着加入荧光染色混合液(CD3、CD63、CD203c以及CCR3)，轻混至沉淀物再悬浮，避光孵育；再次加入红细胞裂解液，漩涡混匀，避光孵育；稀释，离心，吸出上清液，再悬沉淀物；过滤后添加MACS缓冲液，采用流式细胞仪进行检测，在门控模式下根据染色标记物的平均荧光强度来分析嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的比例。本发明提供的嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法，无需分离纯化嗜碱性粒细胞，选用新的特异性嗜碱性粒细胞标记物组合，所测试样本用量小，重复性好，误差小，能有效分辨嗜碱性粒细胞的活化、脱颗粒程度，更好地为相关疾病临床鉴别诊断和科研项目提供检测和技术支持。

附图说明

图1本发明设置门为CD3阴性的示意图；

图2本发明设置门为CCR3阳性的示意图；

图3为本发明的阳性对照活化的嗜碱性粒细胞；

图4为本发明的阴性对照活化的嗜碱性粒细胞；

图5为本发明的阳性对照中所有CD203c阳性细胞表达CD203c的平均荧光强度；

图6为本发明的阳性对照的脱粒细胞和未脱粒细胞的点阵图；

图7为本发明的阴性对照的脱粒细胞和未脱粒细胞的点阵图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

如图1-7所示，一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法，包括以下步骤：

步骤(一)、样品和相关试剂准备

S1、对待测过敏原进行等比例稀释，按顺序编号后作为标准待测过敏原；

S2、制备阳性对照和阴性对照；

S3、用无菌双蒸水按1:10-12的比例稀释红细胞裂解液，备用；

步骤(二)、样品孵育和检测

S4、将步骤(一)所得的阳性对照、阴性对照和标准待测试过敏原样品分别转移至流式细胞上样管中，每管中分别添加100-120μL待测肝素化患者血液，封口孵育；

S5、向上述所有样本中分别加入PBS/EDTA缓冲液，离心，吸出上清液；

S6、向所有样本中分别加入50-60μL荧光染色混合液，轻混至沉淀物再悬浮，室温避光孵育；

S7、向所有样本中分别加入红细胞裂解液，漩涡10-15s，避光孵育；

S8、向所有样本中加入PBS缓冲液，离心，弃上清；

S9、重悬沉淀物，随后过滤，制成单细胞悬液；

S10、向所有样本中添加300-320μL MACS缓冲液，并采用流式细胞仪进行检测，在门控模式下根据染色标记物的平均荧光强度来分析嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的比例。

步骤S1中，使用RPMI 1640培养基作为稀释缓冲液，选择致敏物质的提取液作为待测过敏原，使用RPMI 1640培养基对待测过敏原进行1:7-9等比例稀释，依次稀释后按顺序编号，作为标准待测过敏原样品。

步骤S2中，制备阳性对照的步骤为：

步骤S21、将人源性IgE抗体使用PBS稀释成1：10-12；

步骤S22、用90-100μL培养基稀释10-20μL步骤S21所得人源性IgE抗体，制成阳性对照。

培养基为RPMI 1640培养基，其组分包括：10％FCS、100U青霉素、100μg/mL链霉素。

步骤S3中，所述红细胞裂解液为：取8.29g NH₄Cl、1.00g KHCO₃、37.2mg Na₂EDTA，溶于1000mL蒸馏水中制配而成。

步骤S4中，将步骤(一)所得阳性对照、阴性对照和标准待测试过敏原分别等量转移至带编号的流式细胞上样管中，每管的总体积均为100-120μL，随后向每管中添加100-120μL肝素化待测患者血液，用封口膜密封所有样本，轻轻摇动并放置在孵育箱中，于37.0-37.5℃、3-5％CO₂条件下孵育10-15min。

步骤S6中，所有样本中分别加入50-60μL荧光染色混合液，轻轻混合，不涡旋，轻轻的重悬细胞，在室温、黑暗中孵育30-45min。

步骤S6中，所述荧光染色混合液为：取35-39μL FACS缓冲液，依次加入1-2μL丙种球蛋白、2-3μL VioBlue荧光标记的CD3、5-6μL FITC荧光标记的CD63、2-3μL PE荧光标记的CD203c和3-4μL APC荧光标记的CCR3制配而成。

步骤S10中，所述MACS缓冲液为溶解于PBS中的1％BSA和2mmol/L EDTA。

实施例1

一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法，需要准备以下材料：

采血管：采用LH 170IU真空采血管BD(目录号367526)；

培养基：RPMI 1640培养基(Bio Chrom目录号FG1215)；

RPMI 1640培养基的组分为：10％FCS、100U青霉素、100μg/mL链霉素；

青霉素/链霉素：有机铬酵母片(目录号A2213)；

胎牛血清FCS：有机铬酵母片(目录号SO113)；

牛血清白蛋白BSA：赛瓦(目录号11930)；

FACS缓冲液：PBS中1％的BSA；

MACS缓冲液：PBS中含1％BSA/2mmol/L EDTA；

蒸馏水；

PBS/EDTA缓冲液：PBS中含2mmol/L EDTA；

人源性CD203c PE：荧光染色剂，PE标记人源性CD203c，Immunotech(目录号IM3575)；

人源性CD3 VioBlue：荧光染色剂，VioBlue标记人源性CD3，Miltenyi Biotech(目录号130-094-363)；

人源性CCR3 APC：荧光染色剂，APC标记人源性CCR3，R&D(目录号FAB155A)；

人源性CD63 FITC：荧光染色剂，FITC标记人源性CD63，BD(目录号557288)；

人源性IgE：Biozol HP6029(目录号9250-01)、HP6061(目录号9240-01)；

丙种球蛋白：Aventis Behring(目录号17940321T)；

红细胞裂解液：BD(目录号349202)；

流式细胞上样管：Sarstedt 5mL试管(产品编号55.1579.002)；

过敏原：待检测的过敏原；

四种吸头：

吸头 1250μL (Sarstedt 70.11862.10)；

吸头 100-1000μL (Sarstedt 70.762.100)；

吸头 10-100μL (Sarstedt 70.760.502)；

吸头 0.5-10μL (Sarstedt 70.1115.100)；

移液器：Eppendorf Research 100-1000μL；Eppendorf Research 10-100μL；Eppendorf Research 0.5-10μL；

封口膜：美国国家Can公司(目录号WI54952)；

30μm孔径的细胞过滤器：Miltenyi Biotech GmbH(目录号130-041-407)；

运行缓冲液：Miltenyi Biotec BD(目录号130-092-747)；

弗洛伊细胞计数器：MACS Quant(Miltenyi Biotec GmbH)；激光405nm、488nm、635nm；探测器450/50、525/50、585/40、655LP。

如图1-7所示，一种嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的测试方法，包括以下步骤：

步骤(一)、样本制备

S1.人源性IgE抗体(HP6061和HP6029)使用PBS稀释成50μg/mL，再用90-100μL培养基稀释10-20μL稀释后的人源性IgE抗体作为阳性对照，最终浓度为5μg/mL；

S2.取100-120μL、浓度为5-7μg/mL的培养基作为阴性对照。

S3.以培养基作为稀释缓冲液，对待测过敏原进行1:7-9等比例稀释，依次稀释后作为标准测试样品；

S4.为对照和待测过敏原准备流式细胞上样管，标上编号；

S5.用无菌双蒸水按1:10-12的比例稀释红细胞裂解液，备用；

步骤S1-S2所得阳性对照、阴性对照和标准测试样品分别转移至编号的流式细胞上样管中，每管等量添加100-120μL样本；

S6.使用真空采血管采集患者A外周血，向其中加入肝素抗凝剂(或直接使用肝素化抗凝管采集外周血)，得到肝素化血液；

S7.随后向每个流式管中分别添加100-120μL待测患者A肝素化血液，用封口膜密封所有样本，轻轻摇晃并放置在孵育箱中，于37.0-37.5℃、3-5％CO₂条件下孵育10-15min，使用前将盛有肝素化血液的采血管上下颠倒几次使得血液轻轻混合；

S8.在温育过程中，患者A嗜碱性粒细胞将会被相应过敏原激活，此类过敏原将会和与IgE受体结合的特定IgE交联，随后激活级联反应将被启动，表面标记物如CD203c的表达将会上调，CD63将会从细胞内部移动至细胞膜外，以便被随后的流式细胞仪检测到。

S9.向所有样本中加入2-4mL PBS/EDTA缓冲液，于4℃、340g离心力条件下离心10-15min，离心后，用真空泵吸出上清液。

S10.在步骤S9离心的过程中，可同时准备荧光染色混合液，离心完成后，向步骤9得到的所有样品中分别加入荧光染色混合液，轻轻混合重悬，不要涡旋，在室温、暗处孵育样品30-45min，再分别加入红细胞裂解液，在漩涡振荡器上低速漩涡样本约10-15s，再次于室温、暗处孵育5-10min；

荧光染色混合液为：35-39μL FACS缓冲液、1-2μL丙种球蛋白、2-3μL VioBlue荧光标记的CD3、5-6μL FITC荧光标记的CD63、2-3μL PE荧光标记的CD203c、3-4μL APC荧光标记的CCR3。

S11.向所得的上述所有样本中加入2-4mL PBS，将样本在4℃、340g离心力条件下离心10-15min，丢弃上清液并重悬，若沉淀物仍有红色，重复离心和悬浮至没有红色沉淀物出现为止；用30μm孔径的无菌细胞滤器过滤所有样品，制备成单细胞悬液，随后向所有样本中添加300μL MACS缓冲液，在4℃的温度下保存，有效检测时间不超过24h。

S12.采用流式细胞仪检测步骤S11所得样品，在门控模式下根据染色标记物的平均荧光强度来检测、分析嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒的比例。

步骤S1-S3中，培养基为RPMI 1640培养基，其组分包括：10％FCS、100U青霉素、100μg/mL链霉素；红细胞裂解液为：取8.29g NH4Cl、1.00g KHCO₃、37.2mg Na₂EDTA，溶于1000mL蒸馏水中制配而成。

流式细胞缓冲液(FACS缓冲液)为：溶解于PBS中的1％BSA和2mmol/L EDTA。

由于嗜碱性粒细胞表面不表达CD3，图1将门1设置为CD3阴性。正常人全血中有70％左右的CCR3表达在嗜碱性粒细胞上，图2将门2设置为CCR3阳性。通过图1-2所示的两种筛选设置，可以将我们要寻找的嗜碱性粒细胞范围有效的缩小。进一步设置门3为CD203c阳性的细胞，确定嗜碱性粒细胞的范围；由于活化的嗜碱性粒细胞表面的CD203c表达大大增强，再设置门4为CD203c强阳性的细胞，筛选出只有活化的嗜碱性粒细胞。

图3-4分别为阳性对照及阴性对照中活化的嗜碱性粒细胞，可以明显看出阳性对照中活化的嗜碱性粒细胞明显多于阴性对照，阴性对照中基本没有活化的嗜碱性粒细胞，由此可以根据阳性对照及阴性对照来区分其他过敏原是否可以诱发嗜碱性粒细胞活化。图5为阳性对照中所有表达CD203c细胞中CD203c的平均荧光强度，设置M1为高表达CD203c的水平，便可以计算出活化的嗜碱性粒细胞的比例。图6-7的2D散点图表示在CCR3高表达的情况下，阳性对照和阴性对照中CD63高表达的细胞，可以看出阳性对照中有41.06％的细胞脱颗粒，阴性对照中仅有6.79％的细胞脱颗粒，能够根据图6-7来区分其他过敏原是否可诱发嗜碱性粒细胞脱颗粒。

本发明未说明的部分包括未详细说明的产品和方法，采用现有技术即可实现，在此不多做赘述。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。