阅读说明：本技术 一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用 (Rabbit-derived monoclonal antibody for resisting cryptococcus neoformans tunica polysaccharide and application thereof ) 是由 刘春龙 付成华 付彦凯 翟栓柱 盛长忠 周泽奇 粟艳 于 2019-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗隐球菌荚膜多糖的单克隆抗体及其应用,所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。本发明的单克隆抗体从新西兰大耳兔内获得,对隐球菌荚膜多糖具有较强的结合活性和中和活性,稳定性好,可潜在地应用于隐球菌感染的临床样本的检测与鉴定以及隐球菌抑制剂研发等。(The invention provides a monoclonal antibody against cryptococcus capsular polysaccharide and application thereof, wherein a heavy chain variable region of the monoclonal antibody comprises an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 7; the variable region of the light chain of the monoclonal antibody comprises an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 8. The monoclonal antibody is obtained from New Zealand big ear rabbits, has stronger binding activity and neutralizing activity on cryptococcus capsular polysaccharide, has good stability, and can be potentially applied to detection and identification of clinical samples of cryptococcus infection, research and development of cryptococcus inhibitors and the like.)

一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用。

背景技术

新型隐球菌是一种重要的条件性致病真菌，常侵犯脑膜、肺和皮肤，引起真菌感染。新型隐球菌脑膜炎(CNM)简称隐脑，是中枢神经系统最常见的真菌感染类型，近年来，CNM的发病率和死亡率呈明显上升的趋势。据统计，在美国大约有5％～10％的AIDS患者患有隐脑，而在一些发展中国家，AIDS患者患隐脑的发病率更高。同时，新型隐球菌感染呼吸系统引起的肺新型隐球菌病也呈逐年增多的趋势。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤细胞制备，基于细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，培养成细胞群后，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。

抗体检测法由于检测速度快、准确性高，正逐渐成为新的真菌感染诊断方法。CN109879961A公开了一种抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体及其杂交瘤细胞株制备与应用所述抗体能与隐球菌荚膜多糖特异性结合，并可用于隐球菌感染的体外检测，其抗体效价高达百万以上，具有极好的亲和力，具有很好的特异性结合能力；以该抗体为原料开发的胶体金标记免疫诊断试剂的检测限为0.5ng/ml，在灵敏度、特异性、稳定性，抗体各方面均有较佳表现，但是上述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，尽管鼠源单克隆抗体属于使用最广泛的抗体，但仍然存在亲和力弱、特异性差的问题。

因此，构建新的针对隐球菌的单克隆抗体，在真菌感染的诊断和治疗领域具有广泛的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，具有抗原识别位点多、特异性好、亲和力高的特点，解决了鼠源单克隆抗体在实际应用方面的问题，为建立念珠菌检测、诊断、预防和治疗提供了新的方案。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；

所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；

SEQ ID NO:3：KTSTSTYITNM；

SEQ ID NO:6：SSQKPATANIDDPQ。

优选地，所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:1所示的重链CDR1；

所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、如SEQID NO:4所示的轻链CDR1；

SEQ ID NO:2：PTEGYANWDTTTS；

SEQ ID NO:1：VDYYYLKVRQ；

SEQ ID NO:5：KYTGTWYCAYNNRL；

SEQ ID NO:4：AYTQSSEATSCGYY。

本发明中，选择新西兰大耳兔作为实验动物，以隐球菌夹膜多糖作为抗原进行免疫，得到的单克隆抗体特异性好、亲和力强，与人的同源性高。

第二方面，本发明提供了一种抗隐球菌夹膜多糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括如第一方面所述的抗原结合片段。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:7：

MEVSGFSLSSYITAPGKSGRWLVDLKMGRLTGLETGLYGMDLDTANGWGPGTLVTVSSLLVAVLKGVQCQSVEEYIGMISGANTGYANWTSPTTERFDMNWVTYVTPGTPLTLNYYYVRQTCFCARTISKTSTT；

SEQ ID NO:8：

MLLPSEACAGDQDAATYYGATLIVMGTQLWFSNNVPLTLLPKLLIYARLANCQAVIAFGGGTEVVVKTWYQFTLTISDGSVPVCYKYTGVYDSQKPSGSGTQVGSSTGSTLASGVDTQSDTRAPTPPSRFKGIQ。

优选地，所述单克隆抗体还包括兔源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为兔源IgG1恒定区。

第三方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞产生如第二方面所述的单克隆抗体。

第四方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA片段。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:9所示的核酸分子；

SEQ ID NO:9：

ATGGAAGTTTCTGGTTTTTCCTTATCATCGTATATTACTGCTCCTGGCAAAAGTGGACGTTGGTTGGTCGATCTTAAGATGGGGCGCCTCACCGGTCTAGAGACAGGCCTGTACGGAATGGACTTAGATACGGCCAATGGGTGGGGTCCCGGCACTTTGGTAACCGTGAGCTCTCTTCTCGTTGCAGTCCTAAAAGGAGTACAATGTCAGTCCGTGGAAGAGTATATCGGGATGATATCAGGTGCGAACACAGGCTACGCTAATTGGACGTCGCCAACTACCGAACGATTCGACATGAACTGGGTTACATATGTCACGCCGGGAACTCCTCTGACCTTAAATTACTATTACGTACGGCAAACATGCTTTTGTGCCAGAACGATTAGTAAGACTAGCACCACA。

优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:10所示的核酸分子；

SEQ ID NO:10：

ATGTTATTGCCTTCTGAAGCTTGTGCCGGTGATCAAGACGCAGCGACTTATTACGGCGCTACCCTTATTGTTATGGGAACACAGCTCTGGTTTTCCAATAACGTCCCCCTAACGCTGTTACCAAAATTGCTTATCTATGCCCGTCTCGCAAATTGCCAAGCGGTAATAGCTTTCGGGGGTGGCACTGAGGTGGTTGTCAAGACCTGGTACCAGTTTACACTAACGATTTCAGATGGATCGGTACCGGTGTGTTATAAATACACTGGGGTTTATGACAGTCAAAAGCCTAGCGGTTCTGGCACCCAGGTCGGATCCTCAACAGGGTCGACGCTGGCCAGTGGTGTAGATACTCAAAGCGAC361ACCCGCGCACCCACACCACCGTCTCGATTCAAAGGCATCCAG。

第五方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第四方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体还包括编码兔源IgG1恒定区的核酸分子。

第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有如第四方面所述的核酸分子和/或如第五方面所述的表达载体。

优选地，所述宿主细胞包括293T细胞或CHO细胞。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆抗体、如第三方面所述的杂交瘤细胞、如第四方面所述的核酸分子、如第五方面所述的表达载体或如第六方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了一种试剂盒，所示试剂盒包括如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆抗体、如第三方面所述的杂交瘤细胞、如第四方面所述的核酸分子、如第五方面所述的表达载体或如第六方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所示试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、抗体稀释液、显色液、终止液、封闭液或洗涤液中的任意一种或至少两种的组合。

第九方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆抗体、如第三方面所述的杂交瘤细胞、如第四方面所述的核酸分子、如第五方面所述的表达载体、如第六方面所述的宿主细胞、如第七方面所述的药物组合物或如第八方面所述的试剂盒在制备隐球菌感染疾病治疗药物和/或检测试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明选择新西兰大耳兔为实验动物，制备单克隆抗体，克服了小鼠源抗体亲和力弱的缺陷；

(2)本发明以隐球菌夹膜多糖作为抗原进行免疫，得到的脾脏细胞通过与骨髓瘤细胞进行细胞融合得到兔源单克隆抗体，稳定性好，对隐球菌夹膜多糖具有很强的亲和性；

(3)本发明制备的单克隆抗体特异性好，与夹膜多糖具有强亲和性，但是不与半乳甘露聚糖、甘露聚糖、脂多糖等其他糖类产生交叉反应，可潜在地应用于隐球菌的抗原检测、隐球菌感染临床样本的检测与鉴定等。

附图说明

图1为单克隆抗体电泳图，其中，泳道M为蛋白分子量，泳道1为单克隆抗体电泳结果；

图2为单克隆抗体对GXM的效价检测；

图3为交叉反应图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1动物免疫

(1)隐球菌夹膜多糖(GXM)的制备

将隐球菌接种于沙氏液体培养基(每升培养基含1％蛋白胨和4％D-葡萄糖)中，30℃培养约46h，摇床转速为200rpm/min，当培养液的pH值降至4.2～4.5时停止培养；将培养液在121℃下湿热灭菌40min，杀死菌体和可能存在的芽孢，将得到的菌液离心收集上清；

使用生理盐水清洗菌体后，缓慢加入醋酸钙粉末至终浓度为5％，再加冰醋酸调节pH至5.0；缓慢向混合液中加入三倍体积的95％乙醇，沉淀析出，4℃静置过夜；离心收集沉淀，烘干，使用去离子水复溶；加入CTAB处理复溶液，离心收集沉淀；

采用20％乙醇溶液重悬沉淀，并离心收集沉淀；采用1M氯化钠溶液溶解沉淀，3倍体积无水乙醇醇沉复溶液，离心收集沉淀；70％乙醇溶液重悬沉淀，清洗2次，去离子水复溶沉淀，并进行过滤，得到夹膜多糖粗提物，对夹膜多糖进行进一步纯化，得到纯化的夹膜多糖(GXM)。

(2)动物免疫

挑选适龄、重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房饲养3天，如无异常情况则开始进行免疫：

将30μg GXM抗原加入到0.5mL高压灭菌的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，加入0.5mL弗氏完全佐剂，用注射器相互推拉进行充分混合乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫；

两周后进行加强免疫，此后每隔一周加强免疫一次，共免疫六次，并且从第三次免疫开始，免疫一周后取大耳白兔耳缘静脉血200～500μL，测定效价和亲和性；

在最后一次免疫后，取脾脏进行细胞融合，用于制备杂交瘤细胞。

实施例2杂交瘤细胞的制备和筛选

对制备的兔抗血清进行效价检测，合格的情况下使用兔脾脏进行细胞融合，制备单克隆杂交瘤细胞株，方法如下：

(1)制备

将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取出脾脏，用细胞培养液清洗1次后研碎，过不锈钢筛网，将得到的细胞离心并用细胞培养液清洗2次；

取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液清洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液，37℃恒温处理90s左右；用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的HAT选择培养液重悬细胞，将细胞加入到96孔板中，37℃、5.0％CO₂中培养；

将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1-3个细胞/mL，加入到96孔板内，放入细胞培养箱中在37℃、5.0％CO₂条件下培养，每个细胞株进行编号，选取培养液上清呈阳性的细胞株进行扩大培养，最终得到杂交瘤细胞株；

(2)筛选

对获得的杂交瘤细胞采用ELISA法进行筛选，融合后第5天观察细胞的生长情况，第10～14天采用间接ELISA法检测细胞培养上清的效价，将效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大培养至细胞阳性率达100％，定株得到杂交瘤细胞株，冻存于液氮中备用。

实施例3利用RT-PCR从杂交瘤细胞中分离抗体可变区基因

将杂交瘤细胞匀浆化后，加入细胞裂解液进行RNA提取，用异丙醇从水相层中沉淀出RNA，离心后洗涤沉淀RNA，去除杂质，重悬后进行反转录，得到cDNA；

利用新西兰大耳兔的特异性引物进行PCR，以杂交瘤细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，得到如SEQ ID NO:9-10的抗体可变区基因片段。

实施例4构建单克隆抗体的表达载体

利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂，使用双酶将含有兔抗体重、轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的表达载体，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。

实施例5单克隆抗体的表达与纯化

将实施例4得到的单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；

孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyle^TM293表达培养基，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到抗念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体，具体步骤为：

(1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；

(2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；

(3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；

(4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分洗涤纯化柱；

(5)用0.1M pH＝3.0-3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；

(6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。

实施例6分子量测定

用SDS-PAGE电泳鉴定单克隆抗体的分子量，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量标准系列作为参照，首先在90V电压下电泳20min，再在140V电压下电泳直到指示剂全部跑出，取下凝胶，用考马斯亮蓝染色，染色后凝胶分析生物原料的分子量。从图1可知，单克隆抗体的蛋白重链和轻链主要分布在55kD和25kD左右。

实施例7效价测定

采用ELISA方法检测单克隆抗体对隐球菌夹膜多糖(GXM)的亲和活性(效价)，主要步骤如下：

(1)将GXM抗原用PBS稀释成1ng/μL，以每孔100μL加入到96孔酶标板中，37℃包被2h；

(2)弃上清，用0.01M的PBST洗板3次，用PBST配制含3％BSA的封闭液，每孔加入100μL，37℃封闭2h；

(3)弃上清，用PBST清洗5次，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从1:1000倍比稀释至1:2560000，加入各孔，每孔加入100μL，37℃温育1h；

(4)弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释羊抗兔IgG-HRP，每孔加入100μL，37℃温育1h；

(5)弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，加入TMB，100μL/孔，避光37℃放置15min；

(6)每孔加入50μL 1M稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度。结果如图1所示，在OD值保持不变的情况下，单克隆抗体的稀释倍数越大，说明抗原抗体的结合能力越强，筛选的单克隆抗体对GXM具有较强的结合能力，对GXM抗原的效价达到1:1280000(OD值＞0.5)。

表1

实施例8交叉反应

分别用荚膜多糖、半乳甘露聚糖、甘露聚糖、脂多糖、肽聚糖、1,3-β-D-葡聚糖和BSA包被酶标板，每孔包被量为50ng；将单克隆抗体稀释至10ng/mL，加入到各酶标板中，每孔加入100μL，37℃孵育1h；洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h；洗涤后加入TMB，37℃孵育15min，终止读数。如图3所示，表明单克隆抗体不与其他糖产生交叉反应，特异性强。

综上所述，本发明选择新西兰大耳兔为实验动物，以隐球菌夹膜多糖作为抗原进行免疫，制备单克隆抗体，克服了小鼠源抗体亲和力弱的缺陷，得到的兔源单克隆抗体稳定性好，对隐球菌夹膜多糖具有较强的亲和性，可潜在地应用于隐球菌的抗原检测、隐球菌感染临床样本的检测与鉴定等。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 丹娜（天津）生物科技有限公司

<120> 一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用

<130> 20191217

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 10

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<213> 兔源

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<212> PRT

<213> 兔源

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1 5 10

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<212> PRT

<213> 兔源

<400> 3

Lys Thr Ser Thr Ser Thr Tyr Ile Thr Asn Met

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<212> PRT

<213> 兔源

<400> 4

Ala Tyr Thr Gln Ser Ser Glu Ala Thr Ser Cys Gly Tyr Tyr

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<211> 14

<212> PRT

<213> 兔源

<400> 5

Lys Tyr Thr Gly Thr Trp Tyr Cys Ala Tyr Asn Asn Arg Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 兔源

<400> 6

Ser Ser Gln Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ile Asp Asp Pro Gln

1 5 10

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<212> PRT

<213> 兔源

<400> 7

Met Glu Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Ala Pro Gly

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Lys Ser Gly Arg Trp Leu Val Asp Leu Lys Met Gly Arg Leu Thr Gly

20 25 30

Leu Glu Thr Gly Leu Tyr Gly Met Asp Leu Asp Thr Ala Asn Gly Trp

35 40 45

Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Leu Val Ala Val Leu

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100 105 110

Leu Asn Tyr Tyr Tyr Val Arg Gln Thr Cys Phe Cys Ala Arg Thr Ile

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Ser Lys Thr Ser Thr Thr

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<212> PRT

<213> 兔源

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Met Leu Leu Pro Ser Glu Ala Cys Ala Gly Asp Gln Asp Ala Ala Thr

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Asn Asn Val Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Arg

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Leu Ala Asn Cys Gln Ala Val Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val

50 55 60

Val Val Lys Thr Trp Tyr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Gly Ser

65 70 75 80

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85 90 95

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Val Gly Ser Ser Thr Gly Ser Thr Leu Ala

100 105 110

Ser Gly Val Asp Thr Gln Ser Asp Thr Arg Ala Pro Thr Pro Pro Ser

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<212> DNA

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<400> 9

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tggttggtcg atcttaagat ggggcgcctc accggtctag agacaggcct gtacggaatg 120

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gttgcagtcc taaaaggagt acaatgtcag tccgtggaag agtatatcgg gatgatatca 240

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acccgcgcac ccacaccacc gtctcgattc aaaggcatcc ag 402