阅读说明：本技术 识别细极链格孢菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株AtD2 (Monoclonal antibody for identifying alternaria tenuis and hybridoma cell strain AtD2 thereof ) 是由 赵伟春 徐云飞 李吉二 王海林 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种识别细极链格孢菌Alternaria tenuissima的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株,所述识别细极链格孢菌的单克隆抗体,由保藏编号为：CCTCC No：C2019228的杂交瘤细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株AtD2,于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为：CCTCC No：C2019228。该单克隆抗体被用于由细极链格孢菌侵染引发的动植物病害的鉴定、动态监测以及细极链格孢菌的生物学研究,通过BaL b/c小鼠腹腔注射该细胞株,即可获得大量的该单克隆抗体,与多克隆抗体相比,具有纯度高,专一性强,重复性好等优点。(The invention discloses a monoclonal antibody for identifying Alternaria tenuissima and a hybridoma cell strain thereof, wherein the monoclonal antibody for identifying the Alternaria tenuissima is prepared from the following components in parts by weight: CCTCC No: c2019228 hybridoma cell strain secretion; the hybridoma cell strain is named as a hybridoma cell strain AtD2, is preserved in China Center for Type Culture Collection (CCTCC) in 2019, 10 and 17 months, and has the preservation number as follows: CCTCC No: C2019228. the monoclonal antibody is used for identification and dynamic monitoring of animal and plant diseases caused by Alternaria tenuissima infection and biological research of Alternaria tenuissima, and a large amount of monoclonal antibody can be obtained by injecting the cell strain into the abdominal cavity of a Balb/c mouse.)

识别细极链格孢菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株AtD2

技术领域

本发明属于动物领域，特别涉及一种识别细极链格孢菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株AtD2。

背景技术

半知菌亚门链格孢属真菌细极链格孢菌Alternaria tenuissima是贝母黑斑病的病原真菌之一。病菌以菌丝随病残组织遗落在土中越冬，第二年再次侵染贝母。细极链格孢菌也是众多农作物的黑斑病的致病菌，每年给农业生产造成严重损失。而链格孢属真菌种类繁多，近缘种的菌落、菌丝和孢子形态相似，难以依靠上述特征加以区分。本发明公开的针对细极链格孢菌的单克隆抗体(单抗)结合酶联免疫吸附试验(ELISA)由于具有灵敏度高、特异性强、适于大量检测田间细极链格孢菌的特点，为应用该抗体进行细极链格孢菌的鉴定和生物学研究，由细极链格孢菌感染的病害如浙贝母黑斑病等的发生动态监测奠定基础。

发明内容

本发明提供了一种识别细极链格孢菌的单抗，由保藏编号为：CCTCC No：C2019228的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株AtD2，于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC No：C2019228。

本发明具有如下有益效果：

(1)单抗的特异性强：该单抗与细极链格孢菌抗原反应强，且不与链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、灰葡萄孢菌、茎点霉菌、拟茎点霉菌的抗原发生反应，可用于细极链格孢菌及其引发的浙贝母黑斑病的检测。

(2)单抗的检测灵敏度高：采用间接ELISA检测结果表明，该单抗对细极链格孢菌菌丝及孢子制备的抗原的检测灵敏度为12.21ng/mL(即每孔1.221ng)。

(3)单抗的类型为IgM。

(4)单抗结合的目标蛋白单一：该单抗仅与细极链格孢菌约43kDa的抗原蛋白结合。

(5)浙贝母提取液对单抗的检测灵敏度无影响：该单抗对浙贝母蛋白提取液无存在交叉反应；在细极链格孢菌菌丝及孢子制备的抗原中加入浙贝母蛋白提取液后，浙贝母提取液对单抗的检测灵敏度无影响，为12.21ng/mL(即每孔1.221ng)，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1 AtD2的效价检测；

图2 AtD2与不同真菌抗原的反应；

图3 AtD2的检测灵敏度测定；

图4 AtD2的类型及亚类鉴定；

图5 AtD2结合的目标蛋白检测；

图6浙贝母提取液对AtD2的检测灵敏度的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施实例进一步解释本发明。

实施例1：杂交瘤细胞株制备

(1)挑取细极链格孢菌的单菌落分别接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在25℃下振荡培养4～5d后，用50mL离心管收集孢子和菌丝，6000r/min离心20min，用PBS洗涤2次后，超声破碎(功率200W，破碎2s，间歇2s)，将破碎液在6000r/min离心20min，收集上清液，用考马斯亮蓝法测上清蛋白含量，调整蛋白浓度为1000μg/mL，作为免疫抗原及后期检测用初始抗原，将抗原液少量分装后-80℃冰冻保存。在临用前取少量于-20℃保存。

(2)选取10～12周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μL。3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μL。再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。最后一次免疫后3天，收集抗血清(多克隆抗体)，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合。

(3)采用聚乙二醇(PEG-4000)作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0。整个过程在无菌条件下操作。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心(1200r/min，2min)后，吸尽上清液，以手指弹匀细胞。将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内缓慢加入细胞融合剂(50％PEG)0.7mL。静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的RMPI-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用。离心后(1000r/min，2min)弃上清液。将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5％(V/V)CO₂温箱中在37℃下培养。3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养，此时亲本均已死去，如有细胞生长即为杂交瘤细胞。

(4)当小孔中细胞生长到覆盖孔底四分之一面积时，即可吸取上清液用间接ELISA检测抗体。选出强阳性且不与木贼镰刀菌、灰葡萄孢菌、半裸镰刀菌、链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、茎点霉菌和拟茎点霉菌的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法进行多次克隆化培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单抗的细胞株AtD2，细胞株AtD2进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。该杂交瘤细胞于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC No：C2019228。

实施例2：单抗的产生

取8周龄左右BaL b/c小鼠，腹腔注射0.3mL降植烷，7-10天后腹腔注射5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹腔明显膨胀，取腹水，2000r/min离心3min，收集上清液，即为腹水型单抗。Protein A柱层析纯化单抗，-80℃保存。AtD2细胞株制备得单抗，即为可专一识别细极链格孢菌的单抗。

实施例3：单抗的效价检测实验

采用间接ELISA方法测定抗体的效价。将1000μg/mL的细极链格孢菌抗原用包被液稀释1000倍后包被整块酶标板(即1μg/mL)，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔，PBST洗涤三次后用脱脂奶封闭60min。将单抗AtD2倍比稀释加入包被孔，每孔加100μL，37℃，1h，PBST洗涤三次后加入按说明书稀释5000倍的辣根过氧化酶标记兔抗鼠(Sigma公司)100μL孔，37℃1h，PBST洗涤后加OPD底物显色液显色，使用50μL 2M的H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD_490nm，以与阴性比值大于2为阳性测定单抗腹水效价。

经检测，确定AtD2的效价为稀释2.56×10⁶倍，确定AtD2稀释20000倍用于其他检测实验(如图1)。

实施例4：单抗的特异性检测实验

检测对象分别是木贼镰刀菌、灰葡萄孢菌、半裸镰刀菌、链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、茎点霉菌和拟茎点霉菌，将上述抗原(1000μg/mL)用包被液稀释至1μg/mL后包被酶标板。以包被液为空白对照，用间接ELISA法检测抗体的特异性，其中单抗稀释20000倍，酶标二抗稀释5000倍。

经上述检测该抗体和上述真菌的抗原均不发生交叉反应，但该抗体与细极链格孢菌抗原反应强烈，可以明显判别是否存在细极链格孢菌抗原(图2)。

实施例5：单抗的灵敏度检测实验

采用间接ELISA方法测定单抗的灵敏度。将1000μg/mL的细极链格孢菌抗原用碳酸盐包被液倍比稀释为1:80×2⁰～1:80×2¹⁰，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复8次，第12列为空白对照，仅用包被液包被。单抗稀释20000倍，酶标二抗稀释5000倍。

通过检测得1000μg/mL的细极链格孢菌抗原的最大稀释倍数为80960倍，即检测灵敏度为：1000μg/mL÷80960＝12.21ng/mL，即每孔1.221ng(图3)。

实施例6：单抗的类型及亚类检测实验

采用小鼠单抗亚类鉴定试剂盒(佰奥通实验材料中心，批号：C060101-L)对单抗进行鉴定。取1000μg/mL的细极链格孢菌抗原用包被液稀释1000倍后包被酶标板，100μL/孔，重复16孔，置37℃温育2h或4℃放罝12h，甩去包被液后用PBST洗涤1次。取100μL用PBST稀释20000倍的腹水型单抗加入酶标板各孔，置37℃温育30min，用PBST洗涤5次，取试剂盒中8种检测抗体Ig类型及亚类的酶标抗体各100μL，分别加入各孔，每种酶标抗体设2个重复，置37℃温育30min，PBST洗涤5次，加OPD显色液避光显色20min，用50μL 2M的H₂SO₄终止反应。酶标仪检测OD_490nm，阳性孔所对应的抗体Ig类型及亚类即为该单抗的抗体类型及亚类。

经检测，确定AtD2的抗体类型为IgM(图4)。

实施例7：单抗结合蛋白的检测实验

采用SDS-PAGE及Western blot技术对抗体结合蛋白进行检测，步骤如下：

(1)制备5％(M/V)的浓缩胶和10％(M/V)的分离胶。

(2)取80μL细极链格孢菌抗原和20μL的5×样品缓冲液混合于1.5mL离心管中，99℃金属浴10min后立即放入冰浴中3min，然后10000r/min离心5min。

(3)用微量加样器将样品加入样品孔，每样加2个孔，同时加蛋白Marker。

(4)电泳：先80V恒压，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，再改为120V恒压，当溴酚蓝指示剂移到凝胶板下口约1cm时停止电泳。

(5)将凝胶分成两部分，将一半浸入染色液中，于摇床上染色45min，换脱色液脱色，至背景清晰为止。

(6)将另一半凝胶用半干转印法在25V恒压下转印30min，转移蛋白至硝酸纤维素膜上。

(7)转印后的膜用PBST洗涤4次，每次5min。

(8)将膜浸入3％(M/V)脱脂奶中，室温封闭1h。

(9)将膜浸入用3％(M/V)脱脂奶稀释2000倍的单抗溶液中，室温下75r/min摇动1h后，4℃孵育过夜。

(10)同(7)洗涤。

(11)将膜浸入用3％(M/V)BSA稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记抗体，室温75r/min摇动1h。

(12)同(7)洗涤。

(13)将膜浸入10mL新配制的DAB显色液中，避光缓慢摇动直到显色，用蒸馏水终止显色反应。膜上显色的条带即为抗体所结合的特异性蛋白，根据蛋白Marker计算结合蛋白的相对分子量。

经检测，该抗体与细极链格孢菌相对分子量约43kDa的蛋白特异性结合(图5)。

实施例8：浙贝母提取液对单抗检测灵敏度的影响实验

采用间接ELISA方法测定细极链格孢菌的宿主植物浙贝母对单抗检测灵敏度的影响。取新鲜浙贝母植株(包括鳞茎)，超声破碎(功率200W，破碎2s，间歇2s)10min，6000r/min离心10min，取上清液，用包被液稀释20倍备用。将1000μg/mL的细极链格孢菌抗原用上述浙贝母稀释液稀释1:40×2⁰～1:40×2¹¹，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复8次，以不加细极链格孢菌抗原的浙贝母稀释液包被酶标板作为阴性对照。单抗稀释20000倍，酶标二抗稀释5000倍。

经检测，AtD2对浙贝母蛋白提取液无交叉反应。加入浙贝母蛋白提取液后，1000μg/mL的细极链格孢菌抗原的最大稀释倍数为81920倍，即检测灵敏度为：1000μg/mL÷81920＝12.21ng/mL，表明浙贝母提取液对检测结果无影响(图6)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上事实例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。