酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用
阅读说明：本技术 酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用 (Saccharomyces cerevisiae calcium channel membrane protein Cch1p, Mid1p and Yvc1p antigens, antibodies, preparation method and application ) 是由 董晓宇 唐乾 王仁军 姜南 邱宇 于 2019-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用,属于基因工程技术领域。主要技术方案如下：酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原的氨基酸序列分别为SED ID NO:1、SED ID NO:2、SED ID NO:3,基因序列分别为CCH1-300、MID1-190、YVC1-236。制备的三种抗体分别为Anti-Cch1p-300、Anti-Mid1p-190、Anti-Yvc1p-236。本发明为钙通道膜蛋白Western blot检测研究提供实验保障,也有利于解决目前缺少商品化抗钙通道膜蛋白抗体的问题。(The invention relates to saccharomyces cerevisiae calcium channel membrane proteins Cch1p, Mid1p and Yvc1p antigen, antibody, a preparation method and application, and belongs to the technical field of genetic engineering. The main technical scheme is as follows: the amino acid sequences of the saccharomyces cerevisiae calcium channel membrane proteins Cch1p, Mid1p and Yvc1p are SED ID NO 1, SED ID NO 2 and SED ID NO 3 respectively, and the gene sequences are CCH1-300, MID1-190 and YVC1-236 respectively. The prepared three antibodies are Anti-Cch1p-300, Anti-Mid1p-190 and Anti-Yvc1p-236 respectively. The invention provides experimental guarantee for Western blot detection and research of the calcium channel membrane protein, and is also beneficial to solving the problem that a commercial anti-calcium channel membrane protein antibody is lacked at present.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用。
背景技术
酿酒酵母是生产乙醇的重要工业微生物，其代谢产物--生物乙醇是重要的石油替代品；此外，酿酒酵母还是真核模式菌。因此，对其钙离子通道调控机制的研究，不仅有利于提高菌体生产乙醇的能力，也为其它真核生物的代谢研究奠定基础。
酿酒酵母钙通道膜蛋白主要包括电压门控钙通道膜蛋白(Cch1p)、牵张敏感性钙通道膜蛋白(Mid1p)和瞬时受体电位钙通道膜蛋白(Yvc1p)，前二者调控细胞外钙内流入细胞质，后者调控液泡中内钙外流入细胞质。
随着分子生物学和生物化学的发展，蛋白质印迹技术(Western blot)被逐渐用于离子通道调控机制的研究中。Western blot技术是以特异性抗体检测某一特定抗原的一种蛋白质检测技术，从而获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达的信息。但是，在酿酒酵母钙通道膜蛋白的Western blot研究中，商品化的膜蛋白抗体未见报道。因此，制备出高质量的抗体是开展这一研究至关重要的基础。
抗体(Antibody，Ab)是指生物体在受到抗原刺激后，由B细胞通过增值分化变成浆细胞后所产生的糖蛋白。根据抗体识别抗原表位数量不同，抗体又分为多克隆抗体和单克隆抗体。单克隆抗体由于具有特异性高，亲和力强等特点，在生命科学领域受到广泛应用。
发明内容
本发明通过提供了酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用，为钙通道膜蛋白Western blot检测研究提供实验保障，也有利于解决目前缺少商品化抗钙通道膜蛋白抗体的问题。
本发明的技术方案如下：酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：
(1)确定适合做抗原片段的氨基酸序列SED ID NO:1、SED ID NO:2、SED ID NO:3；根据氨基酸序列推导出基因序列CCH1-300、MID1-190、YVC1-236；
(2)利用原核表达系统对酿酒酵母的Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1p-236区域蛋白进行重组表达；
(3)利用Ni2+-NTA树脂亲和层析技术获得重组蛋白；
(4)将三种重组纯化蛋白Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1p-236分别免疫小鼠，并通过细胞融合技术制备单克隆抗体，经筛选、纯化，获得效价高的3株单克隆抗体。
所述的制备方法具体为：
(1)分别以酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p为抗原，免疫小鼠；
(2)取小鼠脾脏制备免疫脾细胞，将免疫脾细胞和SP2/0细胞混合于离心管中，使用聚乙二醇融合细胞得到杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射生产腹水；
(3)取腹水过纯化柱得到洗脱液，将洗脱液再加入纯化柱进行二次纯化即为抗体。
进一步的，步骤(1)所述免疫小鼠的方法具体为：
酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p抗原免疫剂量25μg/只，每隔两周免疫一次，共四次；
酿酒酵母钙通道膜蛋白Mid1p抗原初免剂量为100μg/只，之后每次免疫剂量为50μg/只，每隔两周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次，共四次；
液泡膜钙通道膜蛋白Yvc1p抗原免疫初免剂量为100μg/只，之后每次免疫剂量为50μg/只，每隔两周免疫一次，共四次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次。
进一步的，步骤(2)所述免疫脾细胞和SP2/0细胞的比例为5:1。
进一步的，步骤(3)为：取腹水过纯化柱得到洗脱液，将洗脱液再加入纯化柱并封闭纯化柱下端，使用装有中和液的离心管收集洗脱液即为抗体。
本发明同时请求保护酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p单克隆抗体，分别为Anti-Cch1p-300、Anti-Mid1p-190、Anti-Yvc1p-236。
本发明同时请求保护所述的酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p单克隆抗体在Western blot检测中的应用。
本发明同时请求保护酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原，基因序列分别为CCH1-300、MID1-190、YVC1-236。
进一步的，所述酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原，氨基酸序列分别为SED ID NO:1、SED ID NO:2、SED ID NO:3。
进一步的，所述的酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原，由基因片段在大肠杆菌细胞中表达，并经过纯化得到。
进一步的，所述的酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原，制备方法为：将带有目的基因的重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株中，培养至对数期，以0.5mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导后离心收集细胞沉淀；
将收集的细胞沉淀使用破碎缓冲液重悬，超声波破碎取上清液，上清液经Ni2+-NTA树脂纯化，再使用PEG 20000浓缩即为抗原。
本发明的有益效果如下：本发明通过对三种抗酿酒酵母钙通道膜蛋白单克隆抗体的制备，为钙通道膜蛋白Western blot检测研究提供实验保障，也有利于解决目前缺少商品化抗钙通道膜蛋白抗体的问题，并且验证实验结果证明得到的三种单克隆抗体具有高效价、特异性强的特点。
附图说明
图1为酿酒酵母RNA反转录PCR扩增的目的基因；
其中：1、CCH1-300，926bp，2、MID1-190，570bp，3、YVC1-236，708bp，M、RealBandDNA分子量标准Marker 100。
图2为菌落PCR扩增的目的基因；
其中：1-1～3、CCH1-300，926bp，2-1～3、MID1-190，570bp，3-1～3、YVC1-236，708bp，M、RealBand DNA分子量标准Marker(100～10000bp)。
图3为蛋白Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1-236的诱导表达；
其中：A、Cch1p-300，分子量约60kDa，B、Mid1p-190，分子量25kDa，C、Yvc1p-236，分子量30kDa。1、诱导前总蛋白，2、20℃上清，3、20℃细胞内蛋白，4、37℃上清，5、37℃细胞内蛋白，M、蛋白标准品(14.4～116kDa)。
图4为纯化重组蛋白Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1-236的SDA-PAGE；
其中：1、Cch1p-300，分子量约60kDa，2、Mid1p-190，分子量25kDa，3、Yvc1p-236，分子量30kDa，M、蛋白标准品(14.4～116kDa)。
图5为重组纯化蛋白Cch1p-300、Midp1-190和Yvc1p-236的Western blot；
其中：1、Cch1p-300，分子量约60kDa，2、Mid1p-190，分子量25kDa，3、Yvc1p-236，分子量30kDa，M、蛋白标准品(10～180kDa)。
图6为重组纯化蛋白Cch1p-300的质谱检测结果。
图7为重组克隆表达的纯化膜蛋白与相应自制单克隆抗体的WB分析；
其中：1、Anti-Cch1p-300，分子量约60kDa，2、Anti-Mid1p-190，分子量25kDa，3、Anti-Yvc1p-236，分子量30kDa，M、Marker(25～130kDa)。
图8为酿酒酵母细胞钙通道膜蛋白的Western blot分析；
其中：1、Cch1p(234.6kDa)，2、Mid1p(61.5kDa)，3、Yvc1p(78kDa)，M、Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：
实施例1
1.1酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p的制备
(一)引物设计及PCR扩增获得目的基因片段
1)引物设计
根据酿酒酵母细胞膜钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和液泡膜钙通道膜蛋白Yvc1p氨基酸序列功能区信息，选定三种钙通道膜蛋白适合做抗原的区域。根据要求，从酿酒酵母数据库网站http：//www.yeastgenome.org/中分别查找膜蛋白Cch1p-300、Mid1p-190、Yvc1p-236对应的基因序列CCH1-300、MID1-190、YVC1-236，根据pMD18-T载体多克隆位点序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物。
表1引物信息
2)RNA抽提与纯化
利用Trizol总RNA抽提纯化试剂盒提取纯化酿酒酵母总RNA，具体实验操作按照试剂盒操作手册执行。通过1％琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性。
3)逆转录
采用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，在PCR仪上以总RNA为模板，反转录扩增形成cDNA的第一条链。
4)酿酒酵母CCH1-300、MID1-190和YVC1-236基因的克隆
以合成的cDNA为模板，分别利用上述三对特异性引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s；35个循环；72℃延伸7min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，用DNA胶回收试剂盒(上海生工SK1131)进行目的片段的回收。
(二)酶切、酶连及转化
1)以KpnⅠ和HindⅢ/SalⅠ分别双酶切目的基因cDNA片段和pMD18-T表达载体质粒，选择对应的酶和缓冲液，分别建立PCR产物及空质粒酶切体系，进行双酶切。酶切翻译体系如下：
表2酶切体系
添加好各组分后混合均匀，至37℃环境中酶切反应4h。分别取5μL质粒和扩增产物的酶切产物进行琼脂糖电泳，检测质粒是否完全切开并确定酶连是基因片段及质粒的比例。
2)酶切结束后，酶切完全的，用超薄DNA回收试剂盒分别纯化回收扩增产物及空质粒酶切产物。
3)建立酶连体系，在恒温循环水槽中16℃过夜酶连，反应体系如下：
表3酶连反应体系
4)将酶连产物转到感受态细胞SK2301，待感受态细胞恢复生长后，涂到LB-Amp选择固体培养基，37℃下过夜培养。
5)挑取单菌落在LB-Amp液体培养基中37℃下进行培养，约过6h后，即可进行菌落PCR。
(三)菌落PCR验证转化结果
取6μL菌液，15000rpm离心弃上清，当量为1μL DNA模板，用pMD18-T载体的通用引物进行PCR验证，反应体系如下：
表4 PCR反应体系
PCR反应条件：
预变性95℃，3min；变性94℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，60s；修复延伸72℃，10min；25个循环。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：配制1-1.2％琼脂糖进行电泳，凝胶中含有0.5mg/L EB，1×TAE缓冲液，5V/cm电压电泳1h，凝胶置于凝胶成像系统上观察、照相。
(四)产物回收及测序
采用PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK1131)中提供的手册中的方法，进行PCR产物回收操作，将获得的基因片段进行序列测定。
(五)Cch1p-300、Mid1p-190、Yvc1p-236蛋白表达与纯化
1.1三种蛋白的纯化(这个题目是我加的，您再看看是否正确？)
将带有目的基因的重组质粒(PET28a-CCH1-300、PET28a-MID1-190和PET28a-YVC1-236)1μL分别转化到大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)和菌株BL21(DE3)中，在含有卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单菌落于10mL LB培养基(含卡那霉素和氯霉素)中，于37℃，220r min-1摇床中培养至对数期OD600＝0.6。加入终浓度为0.5mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)，20℃诱导过夜或37℃诱导4h，离心分别收集上清液和细胞沉淀，细胞沉淀加入包涵体溶解液A或B(A：8M Urea，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0；B：8M Urea，50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)溶解并收集上清液。将诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度12％。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色分析。
将目的菌株扩大诱导培养至3-4L。离心收集细菌沉淀，3株含有不同重组质粒的菌株分别加入破碎缓冲液A、B或C(A：8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-100，pH 8.0；B：7M Gua-HCl，50mM Tris，300mM NaCl，0.1％Triton X-100，pH 8.0；C：50mMTris，300mM NaCl，0.1％Triton X-100，0.2mM PMSF，pH8.0)重悬，冰浴中超声破碎20min，12000r/min，4℃，离心20min，收集上清。取5mL Ni2+-NTA树脂(Novagen公司)，加入300mM连接缓冲液(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)，充分混匀，5000r/min，离心后弃上清，重复2次。向裂解液中加入5mL Ni2+-NTA树脂(Novagen公司)，用连接缓冲液(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液，检测是否穿透；分别用连接缓冲液和清洗缓冲液(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，20/50mM Imidazole，pH 8.0)洗脱，流速5mL/min，分别收集洗脱液(低浓度咪唑溶液主要作用是洗除结合在树脂上的杂蛋白)；用洗脱缓冲液(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole，pH8.0)洗脱，流速2mL/min(高浓度咪唑溶液能将树脂上结合的目的蛋白洗脱下来)；通过SDS-PAGE进行分析和优化蛋白纯化条件。对含有目的蛋白的洗脱液用含有0.1％SKL和2mM DTT的PBS(137mmol/L NaCl，2.68mmol/L KCl，8.1mmol/L Na2HPO4，1.46mmol/L KH2PO4，pH 8.0)透析，然后用PEG 20000浓缩，0.22μm(Cch1p和Yvc1p)或0.45μm(Mid1p)滤膜过滤后分装1mL/tube，-80℃保存。
1.2纯化蛋白检测
1)SDS-PAGE检测目标蛋白
通过SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度12％，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色分析，检测是否为目标蛋白，预染蛋白双色Marker。
2)Western blot检测目标蛋白
取目标蛋白1μg，以12％的SDS-PAGE凝胶电泳电离。将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜(Amersham Biosciences)。用含有5％的脱脂奶粉于37℃下封闭2h。一抗为兔抗his标签(Sangon Biotech，D110002)，稀释倍数1:500；二抗为羊抗兔(Sangon Biotech，D110058)，稀释倍数1：8000，TMB显色。
1.3纯化蛋白Cch1p-300氨基酸序列测定
将SDS-PAGE上的目标蛋白质条带切成1mm的凝胶条带，用胰蛋白酶消化。真空吹干后溶解在5μL含0.1％TFA溶液中，然后按照1:1比例混合至含有50％ACN的1％TFA的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液中。取1μL样品溶液通过MALDI-TOF/TOF二级质谱(ABI5800，AppliedBiosystems)进行蛋白质鉴定，PMF的质谱扫描范围为800-3500Da；选择强度最大的10个峰进行二级质谱。采用Mascot NCBI数据库进行相似性检索，酶为胰蛋白酶；允许最大漏切位点为1；固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)和Oxidation(M)；MS tolerance为100ppm，MS/MStolerance为：0.3Da.Protein score C.I.％大于95％为鉴定成功。
1.4单克隆抗体的制备和效价检测
单克隆抗体制备首先以纯化膜蛋白Cch1p、Midp和Yvc为抗原，免疫BALB/c小鼠。抗原Cch1p免疫剂量25μg/只，每隔两周免疫一次，共四次。抗原Mid1p初免剂量为100μg/只，之后每次免疫剂量为50μg/只，每隔两周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次，共四次。抗原Yvc1p免疫初免剂量为100μg/只，之后每次免疫剂量为50μg/只，每隔两周免疫一次，共四次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次。
取小鼠脾脏制备脾细胞，将免疫脾细胞和SP2/0细胞按5:1的比例混合于50mL离心管中。使用1mL聚乙二醇融合细胞，并观察杂交瘤细胞生长状况。以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照，筛选阳性杂交瘤细胞。对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养。杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射生产腹水，取腹水过纯化柱，用10倍柱体积1×PBS分2次冲洗。向纯化柱内倒入对应的腹水，冲散beads。静置，待beads在纯化柱底部全部沉淀后，放出腹水，并收集腹水流穿。1×PBS冲洗纯化柱，直到beads变白为止(少数洗不白的除外)。将腹水重新穿流过一遍纯化柱，重复上述操作至少2遍，10倍柱体积1×PBS分2次冲洗纯化柱。抗体洗脱，将洗脱液分别加入纯化柱(注意沿纯化柱侧壁缓慢加入)封闭纯化柱下端，冲散beads，待beads在纯化柱底部全部沉淀后，流出液体，用事先装有中和液的1.5mL离心管收集洗脱液。对纯化的抗体用MerintonSMA4000微量紫外分光光度计测定浓度；用ELISA法检测抗体效价。
1.5单克隆抗体与重组纯化膜蛋白的免疫印迹(Western blot，WB)实验
制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5％分离胶8％制样：重组蛋白上样量：1μg。电泳时，浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。湿转法转膜，280mA，60min。封闭采用5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。孵育一抗(Anti-Cch1p、Anti-Mid1p、Anti-Yvc1p)，稀释比为1:2000，4℃震荡过夜，次日，37℃复温90min。孵育二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG)以1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min后，曝光。
1.6单克隆抗体与酿酒酵母钙通道膜蛋白的WB实验
酵母培养液，在4℃，2000g条件下离心10min，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀，冷PBS洗涤酵母细胞沉淀两次，每次洗涤后尽可能吸干上清；得到约200μL酵母细胞沉淀物。按照蛋白提取试剂盒(上海贝博生物，BB-31572)说明书提取膜蛋白。加入约500μL提取液A，旋涡震荡，37℃振荡反应1h；4℃离心，2000×g，10min，去除上清，收集沉淀；在沉淀中加入500μL预冷含蛋白酶抑制剂的酵母蛋白提取液B，旋涡震荡混匀；4℃条件下震荡反应1h；将提取液再4℃条件下12000×g离心5min，取上清；将此上清在37℃水浴中反应10min；37℃，1000×g条件下离心10min，直到溶液清洗分层，上层部分为酵母细胞质蛋白，下层即为膜蛋白；用100μL膜蛋白溶解液C(含蛋白酶抑制剂)溶解下层蛋白，即得膜蛋白。
为了提取液泡，收集酵母沉淀，1mol/L山梨醇溶液重悬细胞，加入0.2％蜗牛酶，30℃消化60～90min。3000r/min离心5min收集细胞，1mol/L山梨醇清洗2次；12％Ficol溶液重悬，匀浆器匀浆，匀浆过程中加入酶抑制剂。取6mL匀浆液加入试管中，上层铺8％的Ficoll溶液，18000r/min离心1h，上层白色物质即为液泡。收集液泡，加入2％SDS进行裂解，即得液泡膜蛋白。
制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5％分离胶8％制样。酿酒酵母膜蛋白上样量为2μg，PBS代替膜蛋白上样作为阴性对照。电泳条件为浓缩胶90V，20min；分离胶160V，通过预染蛋白Marker确定电泳停止时间。湿转法转膜，300mA恒流，0.45μm孔径PVDF膜，转膜时间为180min。封闭采用5％BSA-TBST中室温轻摇60min。室温孵育一抗(Anti-Cch1p-300、Anti-Mid1p-190、Anti-Yvc1p-236)15min，稀释比为1:2000，4℃震荡过夜，次日，37℃复温90min。孵育二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG)以1:5000稀释，室温缓慢振荡40min后，曝光。
实施例2结果与讨论
2.1含目的基因的重组载体构建
通过对膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p氨基酸序列的信号肽区域、跨膜区域、亲水性区域和抗原性区域分析，确定适合做抗原片段的Cch1p氨基酸序列是1～300aa(Cch1p-300)、Mid1p氨基酸序列359～548aa(Mid1p-190)、Yvc1p氨基酸序列1～236aa(Yvc1p-236)。根据此信息，分别找到对应基因序列，设计并合成RT427-MID1-1F，RT427-MID1-570R，RT427-YVC1-1F，RT427-YVC1-708R，RT427-CCH1-16F，RT427-CCH1-941R引物，以酿酒酵母RNA为模板，分别通过反转录PCR扩增产生目片段，成功克隆所需的基因片段CCH1-300、MID1-190和YVC1-236，结果如图1所示。电泳图结果表明，基因片段CCH1-300、MID1-190和YVC1-236均PCR扩增所得，且与预期大小相同。
2.2菌落PCR验证
为了检测转化后宿主细胞是否含有***了目的基因的质粒，我们利用pMD18-T载体通用引物建立菌落PCR体系。目的基因成功地克隆到载体上，即能扩增出相应大小的目的条带，凝胶成像时也可以看到相应条带，否则凝胶成像时看不到相应条带。图2显示的是基因CCH1-300、MID1-190和YVC1-236菌落PCR结果。
2.3目的基因测序分析
将菌落PCR扩增产物进行测序，得到CCH1-300、MID1-190、YVC1-236基因序列。应用SequencherTM软件分析确定其碱基数量分别为926bp、570bp、708bp。将测定得到的3个基因序列与最初网络(http://www.yeastgenome.org/)查到的CCH1-300、MID1-190、YVC1-236基因序列进行比对，CCH1-300基因序列与理论序列同源性达到100％，MID1-190基因序列与理论序列同源性达到99.47％，YVC1基因序列与理论序列同源性达到99.72％，这一结果说明我们调取的3个基因是我们需要的目标基因。
CCH1拼接结果：
AGGACGCTTACGGAACCATTTGAGCCAAATACCAATCCATTTGGGGACAATGCAGCAGTAATGACGGAAAATGTTGAGGATAACAGCGAAACAGATGGTAACCGTCTAGAATCAAAACCACAAGCTTTGGTCCCACCAGCTTTAAATATCGTGCCACCAGAGAGCAGCATCCACAGTACTGAAGAAAAGAAAGGTGACGAGTACAATGGAAATGATAAAGATAGCTCCTTAATCTCCAACATATTTCGTACTCGTGTCGGAAGGAGTAGTCATGAAAACTTGAGCAGGCCTAAACTCTCACTTAAAACAGCATCATTTGGTGCCGCTGAATCTTCCCGGCGTAATGTTTCACCCTCTACAAAATCTGCCAAGTCTAGTTCGCAGTATATTGATTTAAATGATGAAAGGCTACGCAGGCGTAGCTTCAGTAGTTATAGCCGATCATCTAGTAGGCGTGTTTCTAATTCACCAAGCTCAACTGATAGGCCTCCACGGTCGGCAAAGGTTTTATCGCTAATTGCCGCTGATGATATGGATGATTTTGAAGATTTGCAAAAGGGATTTAAAAGTGCAATAGACGAAGAGGGCCTGACATGGCTACCTCAATTAAAATCAGAAAAAAGCCGTCCTGTATCAGACGTTGGAGAAGATAGAGGAGAAGGAGAACAAGAATCTATACCTGACGTTCATACACCCAATGTAGGAGCAAGCGCTACTCCAGGATCAATTCATCTAACACCCGAACCCGCGCAGAATGGTTCGGTATCTGAGGGTCTAGAAGGCTCTATTAATAATTCAAGAAAGAAACCCAGTCCAAAGTTTTTTCATCATTTATCACCGCAAAAAGAAGATAAAGACCAAACAGAAGTTATTGAGTATGCTGAAGACATTCTAGATTTTGAAACCCTTCAAAGAAAACTGGAATC
MID1拼接结果：
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YVC1拼接结果：
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本发明通过原核表达系统分别获得重组蛋白酿酒酵母细胞膜钙通道蛋白和液泡膜钙通道膜蛋白的抗原区域(Cch1p-300、Mid1p-190、Yvc1p-236)，制备了相应单克隆抗体Anti-Cch1p-300、Anti-Mid1p-190、Anti-Yvc1p-236，并且检测到酿酒酵母细胞膜钙通道蛋白Cch1p和Mid1p，液泡膜钙通道蛋白Yvc1p。
2.4融合蛋白诱导表达与蛋白纯化
将20℃和37℃诱导的小试样品的上清液和细胞裂解液进行SDS-PAGE分析，结果如图3。在相同上样量，37℃诱导的菌株Rosetta(DE3)-Cch1p和菌株BL21(DE3)-Yvc1p的小试样品细胞裂解液电泳杂蛋白条带较其它条件电泳杂蛋白条带少，目标条带清晰，故后面的实验诱导温度采用37℃，样品来源于细胞裂解液；20℃诱导的菌株BL21(DE3)-Mid1p的小试样品细胞裂解液电泳杂蛋白条带较其它条件电泳杂蛋白条带少，目标条带清晰，故后面的实验诱导温度采用20℃，样品来源于细胞裂解液。
将菌液37℃扩大诱导，裂解细胞，提取细胞内蛋白，利用N2+-NTA树脂亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳分析，如图4所示，在相应位置出现明显的单一、清晰条带，表明三种目标蛋白均得到成功纯化。Western Blot分析结果进一步证实纯化蛋白本别为Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1p-236(图5)，三种蛋白浓度分别为0.6mg/mL、1.2mg/mL、1.0mg/mL(表5)。
表5重组纯化蛋白Cch1-300、Mid1-190和Yvc1-236浓度
通过SDS-PAGE和Western Blot结果表明，成功表达并纯化了目的基因CCH1-300、MID1-190和YVC1-236表达的蛋白。其中，目的基因MID1-190和YVC1-236克隆表达的蛋白部分分子量与理论值接近，分别为25kD和30kD。但是，基因CCH1-300克隆的蛋白在SDS-PAGE和Western Blot中所显示的实际分子量和理论分子量还是存在明显的偏差，Cch1p-300理论分子量37kDa，但SDS-PAGE和Western Blot图中实际分子量近60kDa，故进一步对其进行质谱检测。
2.5重组纯化蛋白Cch1p-300的质谱检测
重组纯化蛋白Cch1p-300的质谱分析鉴定结果如图6所示。由质谱数据可知，score值为930(P＝6.3e-5<0.05)，sequence coverage为32％。文献曾报道，匹配多肽覆盖率至少20％，MASCOT score大于50(P<0.05)，即可判断与理论蛋白序列比对成功(Liao JL,HuangYJ.Evaluation of protocols used in 2-D electrophoresis for proteome analysisof young rice caryopsis[J].Genomics Proteomics and Bioinformatics,2011,9(6):229-237.)。故本实验中，基因CCH1-300克隆表达的蛋白Cch1p-300应该可以认为与理论序列无显著性差异。
2.6单克隆抗体的筛选和WB验证
通过对大量杂交瘤细胞的筛选、抗体纯化，最终获得单克隆抗体，即抗Cch1p-300抗体(Anti-Cch1p-300)、抗Mid1p-190抗体(Anti-Mid1p-190)和抗Yvc1p-236抗体(Anti-Yvc1p-236)，其蛋白浓度和抗体效价如表6所示，重组克隆表达的纯化膜蛋白Cch1p-300、Mid1p-190、Yvc1p-236与其相应抗体进行Western blot实验，结果表明抗原与抗体可以很好结合，如图7。
表6单克隆抗体蛋白浓度和抗体效价
2.7单克隆抗体在酿酒酵母钙通道膜蛋白表达中的验证
分别提取细胞膜、液泡膜总蛋白，经过定量后，进行免疫印迹(WB)实验。一抗采用效价较高的Anti-Cch1p-300、Anti-Mid1p-190、Anti-Yvc1p-236，二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多抗。免疫印迹结果显示，在细胞膜蛋白泳道约234.6kDa和61.5kDa处有特异性条带出现(图8)，这与预测的Cch1p蛋白和Mid1p蛋白大小相近，阴性对照均无特异性条带出现(数据未显示)；在液泡膜蛋白泳道约78kDa处有特异性条带出现(图8)，这与预测的Yvc1p蛋白大小相近，阴性对照无特异性条带出现(数据未显示)。
综上所述，本发明通过原核表达系统分别获得重组蛋白酿酒酵母细胞膜钙通道蛋白和液泡膜钙通道膜蛋白的抗原区域(Cch1p-300、Mid1p-190、Yvc1p-236)，制备了相应单克隆抗体Anti-Cch1p-300、Anti-Mid1p-190、Anti-Yvc1p-236，并且检测到酿酒酵母细胞膜钙通道蛋白Cch1p和Mid1p，液泡膜钙通道蛋白Yvc1p。