阅读说明：本技术 一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 (Hybridoma cell strain secreting serpentine monoclonal antibody and application thereof ) 是由 匡华 金国浩 胥传来 徐丽广 马伟 刘丽强 吴晓玲 宋珊珊 胡拥明 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用,属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号CGMCC No.18515。利用该菌株分泌获得的蛇形菌素单克隆抗体用于检测食品中蛇形菌素残留物。本发明获得的蛇形菌素单克隆抗体,对蛇形菌素有较好的检测灵敏度和特异性；其检测限,即抑制率20%-80%对应的加标量为1.57–22.6ng/mL,IC<Sub>50</Sub>值为5.97ng/mL；对蛇形菌素类似物交叉率小于1%。本发明还提供了一种全新的蛇形菌素完全抗原及其合成思路,采用该完全抗原筛选所获得的蛇形菌素单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。(A hybridoma cell strain secreting a serpentine monoclonal antibody and application thereof belong to the field of food safety immunodetection. The hybridoma cell strain OVA15 secreting the serpentine monoclonal antibody has been preserved in China general microbiological culture Collection center (CGMCC) with the preservation number of CGMCC No. 18515. The serpentine monoclonal antibody secreted by the strain is used for detecting serpentine residues in food. The snake shape obtained by the inventionThe rhzomorph monoclonal antibody has better detection sensitivity and specificity to the serpentin; the detection limit, namely the addition amount corresponding to the inhibition rate of 20-80% is 1.57-22.6 ng/mL, and the IC is 50 The value was 5.97 ng/mL; the crossing rate of the serpentine analog is less than 1 percent. The invention also provides a brand-new snakelike rhzomorph complete antigen and a synthesis thought thereof, and the snakelike rhzomorph monoclonal antibody cell strain obtained by adopting the complete antigen screening can be used for immunoassay detection.)

一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

蛇形菌素（Diacetoxyscirpenol，DAS）是由镰刀菌产生的剧毒次生代谢产物，属于A型单端孢霉烯族毒素，广泛分布于自然界，严重危害人类和动物健康。蛇形菌素是全世界农业饲料和食品的天然污染物，通常存在于谷物中，尤其是小麦，玉米，大米中，临床研究表明，它对不同动物物种具有很高的毒性。主要表现为厌食，呕吐，生长抑制，神经毒性，免疫毒性，遗传毒性和肝毒性。从人类和动物健康的角度来看，由A型单端孢霉烯族毒素能引起的厌食症的潜在威胁尤其令人关注。

由于其严重危害人类和动物的健康，因此，高度敏感和特异性的蛇形菌素分析对于评估食品和动物饲料的安全性至关重要。

蛇形菌素的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对蛇形菌素的高效、快速的检测方法。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测蛇形菌素的前提是得到对蛇形菌素具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对蛇形菌素具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

本发明尝试通过杂交瘤细胞制备蛇形菌素单克隆抗体，但在制备能分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备蛇形菌素半抗原和蛇形菌素完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；制备出的杂交瘤细胞株是否能分泌出蛇形菌素单克隆抗体，还需要进一步验证；分泌出的蛇形菌素单克隆抗体特异性、灵敏度如何，也需要进一步验证。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，此杂交瘤细胞株分泌的蛇形菌素单克隆抗体对蛇形菌素具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为5.97ng/mL），可以用于建立蛇形菌素的免疫学检测方法，检测食品中蛇形菌素的残留。

本发明的技术方案，一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18515。

本发明提供了分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15的制备方法，包含如下步骤：

（1）制备蛇形菌素半抗原及蛇形菌素完全抗原，将获得的蛇形菌素完全抗原制备成含抗原弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；

（2）将得到的含抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用含抗原不完全弗氏佐剂；

（3）将第3次免疫过程结束后第7天的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中蛇形菌素抗体含量高的获得免疫的小鼠；

（4）将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的蛇形菌素完全抗原进行；

（5）将进行冲击免疫结束3天后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞通过聚乙二醇（PEG 4000）法融合，将融合的细胞通过RPMI-1640培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行3次亚克隆，最终筛选出获得能分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15。

所述步骤（2）和（4）中的免疫过程包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔18~21天；首次免疫剂量为80μg/只，加强免疫剂量为40μg/只，冲刺免疫剂量为20μg/只。

本发明提供了上述一种分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15，上述一种分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15的制备方法，在制备蛇形菌素单克隆抗体方面的应用。

本法明提供了一种蛇形菌素半抗原，所述蛇形菌素半抗原的结构式如下：

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本发明提供了上述一种蛇形菌素半抗原的制备方法，所述方法为将蛇形菌素溶于吡啶中，加入琥珀酸酐和DMAP，高温环境下搅拌反应后，用氮气吹干。将残留物用三氯甲烷和水萃取，合并有机相继续氮气吹干，得到衍生物HS-DAS。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将1mg蛇形菌素溶于300μL吡啶中，加入7.2mg琥珀酸酐和3.4mg催化用的DMAP，在50℃环境中，避光磁力搅拌反应5h。然后加入50μL水终止反应，用氮气吹干。将残留物用1mL三氯甲烷与1mL水1：1萃取三次，合并有机相继续用氮气吹干，得到衍生物HS-DAS。

本发明提供了上述一种蛇形菌素半抗原在制备蛇形菌素完全抗原、分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株、蛇形菌素单克隆抗体方面的应用。

本发明提供了一种蛇形菌素完全抗原，所述蛇形菌素完全抗原的结构式如下：

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本发明提供了上述一种蛇形菌素完全抗原的制备方法，所述方法为将蛇形菌素半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温磁力搅拌反应 (称为A液)。将血蓝蛋白（KLH）加入至磷酸盐缓冲液中，获得B液（称为B液），将A液逐滴加入到B液中，室温反应过夜，经PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，获得完全抗原。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将蛇形菌素半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入3倍蛇形菌素物质量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温磁力搅拌反应6-8h(称为A液)。将2000倍蛇形菌素物质量的血蓝蛋白（KLH）加入至磷酸盐缓冲液中，获得B液（称为B液），将A液逐滴加入到B液中，室温反应过夜，经PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，获得蛇形菌素完全抗原。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液（PBS）为浓度为0.01mol/L、pH为7.4。

本发明提供了上述一种蛇形菌素完全抗原或上述一种蛇形菌素完全抗原的制备方法在制备分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株、蛇形菌素单克隆抗体方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述蛇形菌素单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNo.18515的杂交瘤细胞株OVA15分泌产生。

本发明提供了上述一种蛇形菌素单克隆抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.18515的杂交瘤细胞株OVA15，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单抗低温保存。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶保藏编号为CGMCC No.18515的杂交瘤细胞株，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

本发明提供了上述一种蛇形菌素单克隆抗体或上述一种蛇形菌素单克隆抗体的制备方法在识别蛇形菌素方面的应用。

本发明提供了应用上述一种分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种蛇形菌素完全抗原或上述一种蛇形菌素单克隆抗体制备得到的检测试剂盒，用于检测食品中蛇形菌素残留物。

所述食品具体为谷物。

检测方法为制备ELISA竞争法检测蛇形菌素的试剂。

本发明的有益效果：本发明获得的蛇形菌素单克隆抗体，对蛇形菌素有较好的检测灵敏度和特异性；其检测限，即抑制率20%-80%对应的加标量，为1.57–22.6ng/mL，IC₅₀值为5.97ng/mL；对蛇形菌素类似物交叉率小于1%，交叉率=（蛇形菌素的IC₅₀/类似物的IC₅₀）×100%）。

本发明还提供了一种全新的蛇形菌素完全抗原及其合成思路，采用该完全抗原筛选所获得的蛇形菌素单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测。

生物材料样品保藏：一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株OVA15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18515。

附图说明

图1是蛇形菌素单克隆抗体对蛇形菌素的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中涉及的培养基如下：PMI-1640培养基。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

蛇形菌素抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用包被缓冲液抗原稀释至0，01，0.03，0.1和0.3μg/ mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/ mL。选择最佳工作点后，将蛇形菌素标准品稀释为8个浓度（0，0.27，0.82，2.47，7.41，22.22，66.67，200ng/mL），按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图，结果如图1所示。获得DAS标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1：蛇形菌素半抗原的合成

合成路径如下：

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由于蛇形菌素小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将蛇形菌素偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，将DAS分子衍生出羧基，加长间隔臂，使小分子偶联蛋白后也能充分暴露，提高免疫效果。

将1mg DAS溶于300μL吡啶中，然后加入7.2 mg琥珀酸酐和3.4 mg催化量的DMAP。将在50℃环境下避光搅拌反应5h。 然后加入50μL超纯水终止反应，并用氮气吹干。将残留物用1mL三氯甲烷与1mL水1︰1萃取三次，取有机相继续用氮气吹干，得到衍生物HS-DAS。

实施例2：蛇形菌素完全抗原的合成

将蛇形菌素半抗原（HA-DAS）溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入3倍蛇形菌素物质量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温磁力搅拌反应6-8h(称为A液)。将2000倍蛇形菌素物质量的血蓝蛋白（KLH）加入至磷酸盐缓冲液中，获得B液（称为B液），将A液逐滴加入到B液中，室温反应过夜，经PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，获得完全抗原。

实施例3：蛇形菌素包被原的合成

将1 mg DAS溶于200μL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，添加8mg N,N-羰基二咪唑（CDI），并在37℃下进行磁力搅拌2 h。将反应溶液滴加到1mL的0.05M碳酸钠缓冲溶液（牛血清白蛋白BSA 2mg）中，在室温下搅拌过夜，用0.01M PBS透析三天，并在-20℃下保存。DAS-CDI-BSA充当包被抗原。

实施例4：分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得

将DAS完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为80.μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为40μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为20μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

2、细胞融合

在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO₂培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1~4﹚×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

3、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用蛇形菌素为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；

选择对蛇形菌素标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；

按上述方法进行三次亚克隆，最终获得蛇形菌素单克隆抗体细胞株。

实施例5：蛇形菌素单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶蛇形菌素杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，采用OriginPro 8.5做图，结果如图1所示。获得DAS标准抑制曲线，其R² = 0.99946，Y = 0.207+1.631/[1+(x/5.967)^1.039]，检测限（抑制率20%-80%对应的加标量）为1.57–22.6 ng/mL，IC₅₀值为5.97ng/mL、对蛇形菌素类似物交叉率小于1%，说明对蛇形菌素有很好的灵敏度，可用于蛇形菌素免疫分析检测。

（交叉率=（蛇形菌素的IC₅₀/类似物的IC₅₀）×100%）

实施例6：蛇形菌素单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于DAS的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）将用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0、0.27、0.82、2.47、7.41、22.22、66.67、200μg/L的DAS标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL以1:32000稀释的抗DAS单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（4）每孔加入100μL用含0.1%明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（5）每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

（6）添加回收及样品前处理：

选择大米为检测样品。

待测样品洗净、切碎，分别称取三份样品，每份2g，向样品中分别添加100ppb、250ppb、500ppb的DAS标准品（根据抗体线性范围及IC₅₀设定添加浓度），加入20mL 25%乙醇-PBS提取液提取，剧烈震荡1h后，离心取上清液稀释5倍。（即一共稀释了50倍以减少样品基质的影响）。

采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为99%，104%，110%。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。