一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束及其制备方法和应用 (Polyguluronic acid sulfate-adriamycin polymer micelle and preparation method and application thereof ) 是由 李春霞 仇晓雷 王世欣 范子瑞 王定福 于 2021-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束及其制备方法和应用。所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的制备方法包括：首先利用聚古罗糖醛酸硫酸酯通过二硫键以及酰腙键逐步合成聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素,并再经过透析和过滤后,最终得到具有pH以及氧化还原响应的聚合物胶束。所述聚合物胶束可以与P-选择素(selectin)结合,使其对肿瘤细胞产生靶向性,达到靶向递送化疗药物的作用,并降低药物的副作用,实现药物在肿瘤细胞中的有效累积,对难渗透的肿瘤组织部位的药物递送提供了新的策略。(The invention discloses a polyguluronic acid sulfate-adriamycin polymer micelle and a preparation method and application thereof. The preparation method of the polyguluronic acid sulfate-adriamycin polymer micelle comprises the following steps: firstly, polyguluronic acid sulfate is gradually synthesized into polyguluronic acid sulfate-adriamycin through disulfide bonds and acylhydrazone bonds, and finally, the polymer micelle with pH and redox response is obtained after dialysis and filtration. The polymer micelle can be combined with P-selectin (selectin), so that the polymer micelle can generate targeting to tumor cells, achieve the effect of targeted delivery of chemotherapeutic drugs, reduce the side effect of the drugs, realize the effective accumulation of the drugs in the tumor cells, and provide a new strategy for the drug delivery of tumor tissue parts which are difficult to permeate.)
技术领域
本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束及其制备方法和应用。
背景技术
P-选择素(P-selectin)是负责白细胞募集和血小板结合的炎症细胞粘附分子，在内皮细胞中表达，并储存在Weibel-Palade体的细胞内颗粒中。近期研究表明，在肿瘤转移过程中，P-selectin通过促进循环癌细胞对远处器官中活化的血小板和内皮的粘附而促进转移过程。在人类的许多侵袭性肿瘤组织中，P-selectin高度表达，而正常组织P-selectin表达很少；另外较低表达P-selectin的肿瘤在辐射诱导下也可以导致P-selectin的过量表达，这些研究结果表明P-selectin可能成为癌症药物输送和放射导向药物输送的靶标。
肿瘤组织表现出与正常组织显著不同的生理特点：例如低pH，高水平的活性氧，肿瘤细胞外及肿瘤细胞内过度表达如基质金属蛋白酶、酯酶、α-淀粉酶等，高浓度的谷胱甘肽等。基于这些独特的生理特征，我们针对肿瘤微环境中低pH及高浓度的谷胱甘肽，设计pH及GSH双响应的智能型纳米药物递送系统，实现化疗药物在体内的靶向递送和智能释放，促进化疗药物在临床的进一步应用。
发明内容
本发明提供一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束及其制备方法和应用。本发明将具有靶向P-selectin的聚古罗糖醛酸硫酸酯与阿霉素通过二硫键(GSH响应)以及酰腙键(pH响应)偶联，得到了具有pH以及氧化还原响应的聚合物胶束，该聚合物胶束具有靶向性、稳定性，且能够实现药物的控制释放，其制备方法合成路线设计合理、操作简单。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺的合成：将聚古罗糖醛酸硫酸酯溶解后，加入羧基活化剂活化搅拌，再加入胱胺二盐酸盐溶液反应，透析、浓缩冻干，得到聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺；
(2)聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯的合成：将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺先后溶解于无水甲酰胺溶液、甲醇溶液后，加入丙烯酸甲酯、三乙胺反应，然后利用沉淀剂收集沉淀，复溶、透析、浓缩冻干，得到聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯；
(3)聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼的合成：将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯溶于水合肼溶液中反应，透析、浓缩冻干，得到聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼；
(4)聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素的合成：将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼溶于甲酰胺溶液中，加入阿霉素和冰醋酸反应，然后利用沉淀剂收集沉淀，复溶、透析、浓缩冻干，得到聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素；
(5)聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的合成：将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素经过透析和过滤后，得到聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束。
进一步的，所述步骤(1)中羧基活化剂为EDC/NHS，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯与EDC/NHS的摩尔比为0.5-10∶1。
进一步的，所述步骤(1)中聚古罗糖醛酸硫酸酯与EDC/NHS的质量比为1-2∶1。
进一步的，所述步骤(2)中聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺与无水甲酰胺溶液的质量体积比为1-30∶1；所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺与甲醇溶液、丙烯酸甲酯、三乙胺的质量体积比为1∶2-6∶2-5∶1-5。
进一步的，所述步骤(3)中聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯与水合肼溶液的质量体积比为1∶1-30。
进一步的，所述步骤(4)中聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼与甲酰胺溶液的质量体积比为1-30∶10；所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼与阿霉素的质量比为1∶0.2-10。
进一步的，所述透析的截留分子量不高于3500Da；透析至电导率小于3μs/cm。
进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯的分子量为2000Da-20000Da，S％含量为0％-15％。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素具有如下所示的结构示意式：
其中，a≤z≤y≤x≤n，n代表10-100之间的整数，R＝SO3Na。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束。
进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束具有pH和GSH敏感性。
本发明还提供了所述的聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束通过与P-选择素结合，在肿瘤部位特异性富集，促进肿瘤细胞对所述聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的摄入，实现阿霉素在肿瘤细胞中的释放和累积。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明以抗肿瘤药物阿霉素作为模型药，以硫酸多糖聚古罗糖醛酸硫酸酯为原料，通过二硫键(GSH响应)以及酰腙键(pH响应)偶联等多步反应合成了聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素，并进一步获得了具有pH以及氧化还原响应的聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束。本发明证实聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束可与肿瘤部位高表达的P-selectin特异性结合，使聚合物胶束具有靶向性，与抗肿瘤药物连接后可实现的定向给药，使药物有目标性的载入病灶部位，降低化疗药物阿霉素的毒副作用，提高阿霉素的生物利用度。另外，聚合物胶束利用二硫键的谷胱甘肽响应性与酰腙键的pH响应性，实现药物的控制释放。本发明的聚合物胶束的制备方法简单，易操作，制备成本较低，易于产业化生产，对难渗透的肿瘤组织部位的药物递送提供了新的策略。
附图说明
图1为聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素的合成流程图。
图2为聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素及其中间体的核磁谱图；A：聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺体系核磁氢谱，B：聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯体系核磁氢谱，C：聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼体系核磁氢谱，D：聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素核磁氢谱。
图3为聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的粒径和Zeta电位图。
图4为聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的透射电镜图。
图5为聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束体外药物释放图。
图6为聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束与P-selectin相互作用的SPR图。
图7为P-selectin介导的聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的细胞摄取图，其中A：DOX，B：聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束。
图8为体外模拟实体瘤对聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的摄入图，其中A：DOX，B：聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。在下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1：聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素的制备
1、聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺的合成方法
称取1.5g PGS(聚古罗糖醛酸硫酸酯)溶于100mL 0.01M PBS(pH＝7.4)溶液中，加入EDC(0.01mol)1.273g，NHS(0.01mol)1.150g，40℃搅拌30min，活化羧基；称取11.20g(0.05mol)胱胺二盐酸盐，加入20mL 0.01M PBS(pH＝7.4)溶解，缓慢滴加至预活化的聚古罗糖醛酸硫酸酯溶液中，50℃反应12h；反应体系呈澄清透明状态，反应结束后反应溶液用3500Da的透析袋于0.5％的氯化钠水溶液透析24h，接着用去离子水透析至电导率小于3μs/cm，透析结束浓缩冻干，得到胱胺二盐酸盐接枝的白色粉末状固体聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺(PGS-SS)1.6g。
2、聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯的制备方法
称取0.5g PGS-SS加入50mL无水甲酰胺，室温搅拌溶解，加入2.5mE甲醇(0.082mol)，搅拌30min，加入5mL丙烯酸甲酯(0.056mol)，1.0mL三乙胺(0.007mol)，室温反应24h；反应结束后加入三倍体积丙酮(150mL)沉淀；离心收集沉淀；复溶，透析(MWCO3500Da)除盐至电导率小于3μs/cm，浓缩冻干，得到白色粉末状固体聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯0.403g。
3、聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼的制备方法
称取0.5g聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯加入25mL 80％的水合肼(0.4mol)中搅拌溶解至澄清，室温搅拌反应24h，去离子水透析(MWCO 3500Da)至电导率小于3μs/cm，透析液浓缩，冻干，得到白色粉末的聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼0.426g。
4、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素的制备方法
称取0.2g聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼加入20mL甲酰胺中，搅拌充分溶解至澄清，40mg DOX(阿霉素)溶于3mL DMSO，将含DOX的DMSO溶液滴入聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼溶液中，加入50μL冰醋酸，反应液呈澄清红色，室温搅拌反应72h，反应结束后，反应液加入三倍体积丙酮沉淀，离心得到红色沉淀，沉淀加去离子水复溶，用去离子水透析(MWCO3500Da)至电导率小于3μs/cm，透析液浓缩，冻干，得到红色粉末聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素0.198g。
实施例2：聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的制备方法
一、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束(简称聚合物胶束)的制备
采用透析法制备聚合物胶束。分别称取聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素20mg，加入2mL去离子水使其完全溶解；将上述溶液加入透析袋(MWCO 3500Da)中，置于去离子水中透析48h，期间定期换水，透析完成后使用0.45μm滤膜过滤，得到聚合物胶束。
二、表征分析
1、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素及其中间体的NMR分析表征。
NMR分析方法：JNM-ECP 600M超导核磁共振波谱仪上测定1H-NMR谱图。
精密称取30mg聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素或其中间体聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺、聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-丙烯酸甲酯、或聚古罗糖醛酸硫酸酯-胱胺-酰肼溶于1mLD2O(99.96％)中，25℃条件下进行NMR测试。
NMR分析结果：聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素中间体的核磁1H-NMR如图2A-2C所示，聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素的核磁1H-NMR如图2D所示；以重水溶剂峰(4.80ppm)定标，5.3ppm是糖环上H1的信号峰、4.5-4.9ppm分别为糖环上H5、H4、H3、H2的质子信号，化学位移8.25ppm是阿霉素苯环中质子的信号峰；3.5ppm附近是与N原子相连的碳原子上的-CH2信号峰，在3.0ppm附近是胱胺中与-SS-相连的-CH2质子峰，1.5ppm处的是DOX中的5’-CH3质子峰，通过聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素核磁氢谱可以证明DOX成功接枝到聚古罗糖醛酸硫酸酯主链上。
2、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束粒径及电位的表征
采用动态光散射(DLS)对聚合物胶束的粒径、电位及粒径分布进行检测，检测温度为25℃。
粒径测量：马尔文纳米粒度仪开机预热30min。取聚合物胶束1mL加入粒径样品池，缓慢加入避免气泡，同时倾斜样品池装样至10-15mm之间。样品池放入测量槽，抛光的光学表面面向仪器，测量聚合物胶束粒径。
通过动态光散射对聚合物胶束的粒径及分布进行检测，结果如图3所示，聚合物胶束形成胶束粒径分布均匀，其中聚合物胶束粒径的平均粒径为89nm，分布较窄(PDI为0.178)，Zeta电位约为-41.1mV.
3、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的形态特征测定
透射电镜观察胶束：取一干净的表面皿，取聚合物胶束10μL滴加到铜网表面，干燥除去水分，滴加10μL复染试剂2％磷钨酸染色20min，晾干，在120kV电压下观察聚合物胶束的透射电镜结构。
聚合物胶束TEM的形态学观察结果图4所示，证明了聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束具有尺寸分布均匀的球形形态。
4、聚合物胶束的体外药物释放分析
将聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束(2mL，DOX的含量为1mg)置于透析袋(MWCO 3500Da)中，该透析袋置于200mL缓冲液中，缓冲液分别为0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液、0.01M pH 7.4的PBS和10mM GSH(谷胱甘肽)混合液、0.01M pH 5.0的乙酸钠缓冲液、0.01M pH 5.0的乙酸钠缓冲液和10mM GSH的混合液，然后置于恒温摇床中，振荡速度200r/min，37℃。在0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72h从释放介质中取5mL，并加入5mL相应的释放介质保持总体积不变，测量释放介质中阿霉素的浓度，再根据下述公式计算阿霉素的累计释放率Er：
式中，V1是取样体积；V0是释放介质初始体积；Ci与Cn代表第i次与第n次样品浓度；m是聚合物胶束中DOX的质量。
实验结果如图5所示，聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束在模拟的人体正常生理状态(pH 7.4PBS缓冲液)下，孵育72h，DOX释放量均低于10％，这一结果表明，在人体正常生理状态下药物的泄露已保持在最低水平，减少了潜在的化疗药物阿霉素的毒副作用。pH 5.0模拟的是肿瘤细胞的内涵体以及溶酶体的酸性环境，而10mM GSH模拟的肿瘤细胞细胞质中较高浓度的GSH环境，如图5所示，在低pH或高浓度GSH存在下，聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的DOX释放均显著增加；在pH 5.0和10mM GSH状态下，聚合物胶束的DOX释放达到62.5％。上述结果说明，聚合物胶束具有pH以及氧化还原敏感性，可以显著减少DOX在全身循环过程中药物泄露，而在到达肿瘤部位后pH及高浓度的GSH可以快速触发阿霉素释放实现更高的抗肿瘤功效。
5、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束与P-选择素的SPR分析
采用生物大分子相互作用仪测定聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束与靶点蛋白P-selectin(P-选择素)之间的亲和力，利用的CM5芯片偶联P-selectin，聚合物作为分析物检测结合的亲和力。
运行缓冲液：采用的是1×HEPES-P缓冲液，配制200mL运行缓冲液。使用醋酸钠缓冲液将P-selectin稀释至10μg/mL。聚合物胶束使用HEPES缓冲液分别稀释至0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL。
首先通过EDC/NHS活化芯片表面的羧基，与流动相中的P-selectin相互作用使蛋白结合到芯片上，然后再通过乙醇胺对芯片完成封闭。使用不同浓度的聚合物溶液通过芯片，根据折光率变化记录曲线，实验结果拟合，得到亲和力数值。
通过SPR实验检测聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束与P-selectin之间的相互作用，结果如图6所示，聚合物胶束与P-selectin之间具有很好的结合能力，并随着反应浓度的增加，结合信号也逐渐升高，说明结合量增大，且都表现出快结合快解离，对其响应值拟合得到结合动力学常数值为1.19×10-8。上述结果表明聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束可以通过与P-selectin之间的亲和力在肿瘤部位特异性富集，达到靶向递送化疗药物的作用。
6、P-selectin介导的聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的细胞摄取实验
将4T1细胞以1.0×105个细胞/孔的密度接种共聚焦小皿中，37℃孵育12h，细胞贴壁后移除培养基。分别在培养基中加入游离DOX(1μg/mL)、聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束(DOX的最终浓度为1μg/mL)共孵育0.5h，孵育结束后除去培养基，PBS洗三次，每次10min使用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS冲洗三次，每次10min，加入5％的BSA封闭30min，吸走封闭液，加入P-selectin一抗(PBS配制，1∶200稀释)4℃过夜；PBS冲洗三次，每次10min。加入二抗避光反应30min。反应结束后，吸走二抗，PBS冲洗三次，每次10min。加入DAPI室温孵育30min，反应结束后PBS冲洗三次，每次10min。加入少量PBS浸润细胞，使用共聚焦显微镜检测拍照。
使用激光共聚焦显微镜分析了聚合物胶束被细胞内化后在4T1细胞内分布以及与P-selectin之间的关系，结果如图7所示。DOX是一种小分子药物，通过图7A可以看出DOX直接进入到4T1细胞核中，在细胞中集中在细胞核中，与P-selectin的分布无关。聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物在有水的环境中成聚合物胶束，进入细胞的主要方式是通过细胞内吞作用，在进入细胞后，在细胞的细胞质(GSH)及细胞的内涵体(低pH)部位释放出阿霉素，然后进入到细胞核中，从图7B可以看出阿霉素不仅在细胞核中分布，在细胞质中也会存在，同时与P-selectin之间的亲和力使聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束与P-selectin结合，达到持续促进细胞对聚合物胶束的摄入能力，实现阿霉素在4T1细胞中的有效累积。
7、体外模拟实体瘤对聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束的摄入实验
将4T1细胞以1.0×106个细胞/孔的密度接种到低吸附6孔板(coming 3471)中，在含有20ng/mL表皮生长因子、10ng/mL成纤维细胞生长因子、2％B27和5μg/mL胰岛素的无血清DMEM/F12(1∶1)培养基中形成肿瘤球，37℃孵育3天，细胞成球后分别在培养基中加入游离DOX、聚合物胶束(DOX的最终浓度为2μg/mL)分别孵育20min，孵育结束后除去培养基，PBS洗三次，每次10min使用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS冲洗三次，每次10min，加入DAPI室温孵育30min，反应结束后PBS冲洗三次，每次10min。处理结束后将各组肿瘤球转移至共聚焦小皿中，加入少量PBS浸润细胞，使用激光共聚焦显微镜检测拍照。
通过体外培养4T1细胞肿瘤球模拟实体瘤，利用激光共聚焦显微镜观察阿霉素以及聚合物胶束对肿瘤球的渗透能力，实验结果如图8所示，聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束与游离阿霉素相比，可以更加有效的进入肿瘤球的内部，在位于肿瘤球内部的肿瘤细胞也能够观察到阿霉素的摄入，而游离阿霉素主要是被肿瘤球的外部细胞摄取，难以进入到肿瘤球的内部细胞，说明聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束可以更好渗透到肿瘤组织内部，从而使得聚合物胶束对实体瘤可以实现高效、深度的组织渗透，对难渗透的肿瘤组织部位的药物递送提供了新的策略。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。