阅读说明：本技术 一种重组马血清白蛋白及其制备方法和应用 (Recombinant horse serum albumin and preparation method and application thereof ) 是由 范铁炯 胡金贵 胡双锋 孙九如 梁光军 史小月 柏伟 李鑫 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组马血清白蛋白及其制备方法,将经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)构建入真核细胞诱导表达载体中,然后转入真核细胞进行培养后诱导表达,并进行纯化,从而获得所述重组马血清白蛋白。此外本发明还公开了该重组马血清白蛋白在制备免疫马匹用的狂犬病疫苗中的应用。用本发明重组马血清白蛋白作为稳定剂的狂犬病抗原免疫马匹后获得高抗狂犬病毒抗体,未检测出抗人血清白蛋白的抗体。本发明获得的重组马血清白蛋白可以替代人血清白蛋白作为免疫马匹用狂犬病疫苗的稳定剂,用于生产高质量马抗人狂犬病毒血清。(The invention discloses a recombinant horse serum albumin and a preparation method thereof, wherein a nucleotide sequence (shown as SEQ ID NO: 2) which is optimized by a codon and used for coding the horse serum albumin is constructed into an eukaryotic cell induction expression vector, then is transferred into eukaryotic cells for culture, then is subjected to induction expression, and is purified, so that the recombinant horse serum albumin is obtained. In addition, the invention also discloses application of the recombinant horse serum albumin in preparing rabies vaccines for immunizing horses. The high anti-rabies virus antibody is obtained after the horse is immunized by the rabies antigen taking the recombinant horse serum albumin as the stabilizer, and the anti-human serum albumin antibody is not detected. The recombinant horse serum albumin obtained by the invention can replace human serum albumin to be used as a stabilizer of a rabies vaccine for immune horses, and is used for producing high-quality horse anti-human rabies virus serum.)

一种重组马血清白蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及重组表达蛋白领域，具体是表达一种哺乳动物血浆蛋白，尤其涉及一种重组马血清白蛋白(Equine serum albumin, ESA)及其制备方法；此外，本发明还涉及采用上述方法获得的重组马血清白蛋白的应用。

背景技术

血清白蛋白是哺乳动物血浆内最主要的蛋白，在制药工业上被广泛用作为辅料或保护剂，以保护药品有效成分的稳定。许多病毒疫苗采用白蛋白作为保护剂。人狂犬病疫苗就是其中的一种。

狂犬病（Rabies）是狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）引起的人和所有温血动物的急性致死性中枢神经系统（CNS）的自然疫源性疾病。本病呈全球性分布，人多因被患病动物咬伤而感染，同种和异种动物之间除通过咬伤传播以外，还可以通过吸入、食入或垂直传播等方式传播。人狂犬病患者几乎100%死亡。我国是狂犬病严重流行国家之一，加强狂犬病的研究和防治是十分迫切而又任重道远的。根据WHO对于狂犬病防治的指导原则，被疑似患病动物抓、咬伤后，立即或尽早进行暴露处理。除了需要注射狂犬病疫苗外，伤口处理后应立即或尽早局部浸润注射抗狂犬病毒免疫球蛋白，使机体获得保护。

抗人狂犬病免疫球蛋白是用人用狂犬病疫苗免疫马匹后，采血加工制备而成。由于人用狂犬病疫苗在制备过程中添加人血清白蛋白，用之免疫马匹，马匹产生高滴度抗人血清白蛋白抗体，因而使抗血清成品中含有一定量的抗人血清白蛋白抗体，注射后容易产生致敏，过敏反应的几率非常高。为了克服这一问题，我们开发了马血清白蛋白的基因工程表达研究。用重组马血清白蛋白替代人血清白蛋白作为狂犬病毒疫苗的细胞培养生产病毒过程与疫苗原液中的保护剂，以避免上述的副作用。

申请人于2017年3月13日申请的发明专利CN201710147935公开了一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法。在发明专利CN201710147935中，申请人采用酵母的α-交配因子（α-mating factor）的信号肽作为干扰素的信号肽，用于干扰素的分泌表达，取得良好效果。但是在马血清白蛋白的毕赤酵母分泌表达中，申请人发现用酵母的α-交配因子（α-mating factor）的信号肽作为白蛋白的信号肽，目的蛋白的表达量很低。

本研究的目的是采用毕赤酵母重组表达马血清白蛋白，以马血清白蛋白代替人血清白蛋白制备马用狂犬病毒疫苗。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种重组马血清白蛋白(Equine serumalbumin, ESA)的制备方法。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种上述方法制得的重组马血清白蛋白。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种上述重组马血清白蛋白的应用，将该重组马血清白蛋白作为稳定剂或保护剂用于制备免疫马匹用的狂犬病疫苗。本发明用重组马血清白蛋白替代人血清白蛋白作为狂犬病毒疫苗的细胞培养生产病毒过程与疫苗原液中的保护剂，以避免过敏反应的副作用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供一种重组马血清白蛋白的制备方法，将经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列构建入真核细胞诱导表达载体中，然后转入真核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马血清白蛋白；所述经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

作为本发明优选的技术方案，所述培养包括预接种的预备步骤。

作为本发明优选的技术方案，所述真核细胞是酵母细胞（如酿酒酵母，汉逊酵母或毕赤酵母），优选为毕赤酵母细胞，最优为毕赤酵母GS115。

作为本发明优选的技术方案，表达方式可以是细胞内表达或分泌表达，本发明优选分泌表达方法，所述真核细胞诱导表达载体是分泌表达载体，在所述诱导表达后，离心除去细胞与颗粒物质，取上清进行所述纯化。

作为本发明优选的技术方案，所述分泌表达载体是毕赤酵母表达载体，表达载体可以为pHIL-D2,pPIC9,pGAP,pPIC3.5，优选为pHIL-D2表达载体；含有马血清白蛋白表达盒，分泌表达必需的信号肽可以是酵母α-factor secretion singal或者是马血清白蛋白自身分泌信号肽，优选为马血清白蛋白自身分泌信号肽。

作为本发明优选的技术方案，所述经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列是根据NCBI Reference Sequence: NM_001082503.1所提供的序列(如SEQ ID NO:1所示的序列)，按酵母偏好的密码子进行优化, 在起始子前和终止子之后添加EcoR I, 人工合成cDNA表达盒，***到毕赤酵母表达载体pHIL-D2的EcoR I位点中，构建成ESA马血清白蛋白/ pHIL-D2表达载体；取一定量的pHIL-D2质粒DNA用Sal I酶切线性化后，加入到毕赤酵母培养中，用电击法将质粒DNA转入酵母，使其整合到酵母基因组DNA中，用缺组氨酸的培养基筛选获得表达白蛋白的细胞株。

作为本发明优选的技术方案，所述转入真核细胞进行培养后诱导表达，所用的培养基可以是BMGY/BMMY (具有缓冲作用的复合甘油或甲醇培养基，其组成为，1% 酵母提取物， 2% 蛋白胨，100 mM 磷酸钾 pH 6.0，1.34% 无氨基酸酵母氮源，4x 10-5% 生物素，1%甘油或0.5% 甲醇)、BMG/BMM (具有缓冲作用的最低浓度甘油培养基或甲醇培养基, 其组成为100 mM 磷酸钾 pH 6.0, 1.34% 无氨基酸酵母氮源, 4x 10-5% 生物素，1%甘油或0.5% 甲醇)，或者是YPD/YPM （1%酵母提取物， 2% 蛋白胨 , 2%葡萄糖 或 0.5% 甲醇），本发明优选采用YPD/YPM培养基系统。

作为本发明优选的技术方案，所述培养步骤具体为：挑取克隆，接种到YPD培养基中，30℃、200rpm培养24-72小时，较佳地培养48小时，离心去上清，更换培养基为YPM，28℃、200rpm培养24-120小时，较佳地28℃、200rpm培养48-96小时，更佳地28℃、200rpm培养72小时。

作为本发明优选的技术方案，所述诱导表达通过在酵母培养过程中逐步添加甲醇而达到，较佳地每隔24小时添加甲醇0.5-1.5%，更佳地每隔24小时添加甲醇1%。

作为本发明优选的技术方案，所述纯化方法为用离心方法获得的培养上清用阴阳离子交换层析分离纯化。所述的方法包括用阳离子交换层析捕获目的蛋白，所用的阳离子交换凝胶可以是CM-Sepharose FF凝胶也可以是SP-Sepharose FF凝胶，较佳地，选用SP-Sepharose FF凝胶。阴离子交换层析捕获马血清白蛋白。所用的阴离子交换凝胶可以是Q-Sepharose FF凝胶也可以是DEAE-Sepharose FF凝胶，较佳地，选用DEAE-Sepharose FF凝胶。

在本发明的第二方面，提供一种采用上述的制备方法制得的重组马血清白蛋白。

在本发明的第三方面，提供一种所述的重组马血清白蛋白在制备免疫马匹用的狂犬病疫苗中的应用。所述重组马血清白蛋白作为免疫马匹用的生产马抗人狂犬病毒免疫球蛋白的狂犬病疫苗保护剂或稳定剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：经实验验证，用本发明方法所得到的疫苗免疫马匹获得的马抗人狂犬抗血清不存在抗人血清白蛋白的抗体，质量符合药典要求。本发明采用目的蛋白自身的信号肽表达，目的蛋白的表达量高。本发明用重组马血清白蛋白替代人血清白蛋白作为狂犬病毒疫苗的细胞培养生产病毒过程与疫苗原液中的保护剂，以避免抗血清成品中含有一定量的抗人血清白蛋白抗体，注射后容易产生致敏，过敏反应的几率非常高的副作用。狂犬病抗原添加2%马血清白蛋白（w/v）和2%山梨醇（w/v），2-8℃保存2年效价不变；市售人血清白蛋白作为稳定剂的狂犬病抗原免疫马匹后产生高滴度的马抗人血清白蛋白抗体；导致最终制品马抗人狂犬病血清在人群中应用时产生极高的阳性反应。而用马血清白蛋白作为稳定剂的狂犬病抗原免疫马匹后获得高抗狂犬病毒抗体，未检测出抗人血清白蛋白的抗体。本发明获得的重组马血清白蛋白可以替代人血清白蛋白作为免疫马匹用狂犬病疫苗的稳定剂，用于生产高质量马抗人狂犬病毒血清。

附图说明

图1是本发明实施例2中重组马血清白蛋白毕赤酵母表达载体结构示意图。

图2是本发明实施例3中用甲醇诱导筛选表达克隆，检测克隆表达目的蛋白的量的SDS-PAGE电泳图谱。图2中，从左到右1-9孔为克隆1-9经YPD培养2天，YPM培养3天后取2微升培养上清电泳结果；第10孔为蛋白分子量标准。图2显示克隆5未表达目的蛋白；克隆1表达微量目的蛋白；克隆4和克隆6表达量较高。

图3是本发明实施例4中克隆6在YPD培养基中高密度生长2天，用甲醇诱导取样SDS-PAGE电泳图。图3从左到右，第1孔为蛋白分子量标准;第2-9孔分别为克隆1-8。从图中可见8个克隆的目的蛋白表达量基本相同。

图4是本发明实施例5中DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化的目的蛋白SDS-PAGE电泳图谱；图4中，第1孔为DEAE-Sepharose纯化的重组马血清白蛋白；第2孔为蛋白分子量标准。

图5是本发明实施例5中重组马血清白蛋白SEC-HPLC（高压液相）层析图。20微克重组马血清白蛋白用TSK gel UP-SW3000（4.6 mm I.D. ×15 cm）层析柱在Agilent1260高效液相色谱仪层析结果。目的蛋白在11.215分钟出峰，纯度大于99%。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特以含重组马血清白蛋白制备、马用狂犬病疫苗的配制与免疫方法为例，列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

实施例1. 马血清白蛋白氨基酸序列，根据酵母偏好进行密码子优化

在核酸转录氨基酸的过程中，组成蛋白质氨基酸有20种，编码氨基酸的密码子有61种，一种氨基酸对应的密码子可以有几个。酵母对密码子有偏好，导致酵母细胞内一种氨基酸的有几种密码子翻译效率高，有的密码子翻译效率低。马血清白蛋白的核苷酸序列中含有一些酵母细胞翻译效率低的密码子（马血清白蛋白的核苷酸序列见SEQ ID No.1，马血清白蛋白氨基酸序列见SEQ ID No.4）。为了提高目的蛋白在细胞内的表达水平，本发明委托上海生物工程公司（生工）将马血清白蛋白的核苷酸序列全部改写为在酵母细胞内翻译效率最高的序列。优化后的序列见SEQ ID No.2，并委托生工用人工方法合成此序列，在起始密码子前加和3’ 末端分别引入EcoR I（GAATTC）限制性内切酶序列（见SEQ ID No.3）。克隆至pBluescript KS（-）载体中，获得质粒ESA/pBluescript。

实施例2. 构建毕赤酵母细胞表达载体ESA/ pHIL-D2

20微升反应体系中含20 微克ESA/pBluescript（由实施例1制得）、20单位EcoR I（购自宝生物），37゜C酶切4小时后琼脂糖电泳，在紫外灯下切取分子量为1.6Kb左右的马血清白蛋白 DNA（ESA cDNA），用百泰克DNA回收试剂盒回收DNA。

pHIL-D2质粒线性化反应条件如下：20微升反应体系中含10 微克pHIL-D2质粒、20单位EcoR I（购自宝生物），37゜C酶切4小时后用等体积酚:氯仿（1:1,v/v）抽提一次，再用乙醇沉淀回收DNA。将乙醇溶液置于冰上15分钟后14000rpm离心10分钟回收沉淀的DNA，用90微升10mmol/L Tris-HCl（pH8.3）溶解DNA。加入0.5微升小牛肠碱性磷酸酶（CIP）和10微升10xCIP缓冲液（购自New England Biolabs）37℃温育30分钟，加入EDTA（pH8.0）使终浓度为5mmol/L，充分混匀，于65℃温育30分钟，灭活CIP。反应物冷却到室温后用酚：氯仿抽提一次，用乙醇沉淀法回收DNA。

线性化pHIL-D2质粒与ESA cDNA的连接反应采用20微升反应体系（含2微升线性化pcDNA3.1 DNA,2微升T4 DNA连接酶（购自宝生物），14微升ESA cDNA，2微升10x T4 DNA连接酶缓冲液），混合物置16゜C反应过夜。使马血清白蛋白的cDNA与线性化pHIL-D2质粒连接。连接后的产物转染大肠杆菌感受态细胞。

大肠杆菌感受态细胞的制备如下：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落大肠杆菌DH5α细胞，转到一个含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中。于37℃ 250rpm培养约2～3h， 每隔20～30min测量OD₆₀₀值≈0.4。在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。于4℃以4000r/min离心10min。弃离心上清，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。以10ml用冰预冷的0.1mM CaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上30分钟。4℃ 4000r/min离心10min，弃上清，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉淀。用冷却的无菌吸头从感受态细胞悬液中取200μl转移到无菌的微量离心管中，加DNA或连接反应混合物5μl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90秒后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1分钟。加800μl SOC培养基（SOC培养基：2 % w/v 胰蛋白胨，0.5% w/v 酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mMMgCl₂，10mM MgSO₄，20mM 葡萄糖，pH7.0)，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏。取2块含50微克氨苄西林/毫升的LB琼脂平板，每块板涂布200微升复苏后的大肠杆菌，37℃ 培养过夜。挑取10个克隆用PCR方法鉴定马血清白蛋白表达盒***的方向正确。PCR反应物配置如下：在0.5毫升PCR反应管中加入10xTaq缓冲液25微升、25 mM MgCl₂ 15微升、1.25 mM dNTP 40微升、100pmol/微升引物1（如SEQ ID No.5所示）2.5微升、100pmol/微升引物2（如SEQ ID No.6所示）2.5微升、纯水165μl，5 U/μl Taq酶2.5μl。充分混匀后分装10个PCR管，每管25μl， 用无菌木质牙签挑取大肠杆菌克隆，加入含PCR反应液的管中。PCR反应条件为第一步94℃ 2分钟，第二步94℃ 30秒，第三步60℃ 30秒，第四步72℃ 90秒，重复第二步至第四步30个循环，第五步72℃ 5分钟。PCR产物用1%琼脂糖电泳分析，表达盒正向***的PCR产物为1.5kd左右的DNA片段，表达盒反向***的PCR产物为0.5kd左右的DNA片段。挑取PCR产物为1.5kd左右DNA片段的克隆，制备质粒DNA,经DNA测序确认后用于转染毕赤酵母。构建的重组马血清白蛋白毕赤酵母细胞表达载体ESA/pHIL-D2结构示意图见图1。

实施例3.构建表达重组马血清白蛋白毕赤酵母细胞株（ESA/GS115）

在40微升反应体系中含40微克毕赤酵母细胞表达载体ESA/ pHIL-D2的质粒DNA、40单位Sal I（购自宝生物），37゜C酶切4小时使之线性化，酶切后的反应物用等体积酚:氯仿（1:1,v/v）抽提一次，再用乙醇沉淀回收DNA。将乙醇溶液置于冰上15分钟后14000rpm离心10分钟回收沉淀的DNA，用20微升10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶解DNA。

挑取GS115单克隆加入到含5毫升YPD培养基的50毫升conical管中，30℃、200rpm生长过夜。取0.5毫升培养的GS115加入到含500毫升新鲜YPD（1%酵母提取物,2% 蛋白胨,2%葡萄糖）培养基的2升烧瓶中，30℃、200rpm生长过夜，直至OD₆₀₀ = 1.3–1.5。4℃、1500rpm离心5分钟，弃上清，GS115细胞重悬于冰浴预冷的500毫升无菌水中。1500rpm离心5分钟，弃上清，GS115细胞重悬于冰浴预冷的250毫升无菌水中。4℃、1500rpm离心5分钟，弃上清，GS115细胞重悬于冰浴预冷的20毫升1M山梨醇中。4℃、1500rpm离心5分钟，弃上清，GS115细胞重悬于冰浴预冷的1毫升1M山梨醇中。此时GS115细胞重悬液的体积大约为1.5毫升。取80微升重悬细胞与10微升线性质粒DNA混合，转移到预先在冰浴中冷却的0.2 cm电转杯，在冰浴上放置5分钟后进行电转，电转的参数为电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为10毫秒。

立即加入在冰浴中预冷的1 M山梨醇，并转移到1.5毫升无菌离心管中。取300微升涂布到RDB平板上（RDB：含 1M 山梨醇、2%葡萄糖、1.34%酵母氮基（YNB）、4x10^-5%生物素、2%琼脂），共涂布3块RDB板。将RDB板置30℃培养至克隆生成。

挑取10个白色克隆，分别接种到5毫升YPD培养基中，30℃、200rpm生长2天。接种的酵母培养管3000rmp离心5分钟、在无菌条件下弃上清后加入5毫升YPM培养基（含0.5%甲醇、1%酵母提取物、2%蛋白胨），置30℃、200rpm生长，在培养的第24、48小时分别添加25微升无菌甲醇，培养72小时后离心，取上清，用SDS-PAGE分析克隆的表达（见图 2）。从图2中可见克隆6表达量最高。

实施例4.马血清白蛋白表达克隆筛选与纯化

第一轮筛选：挑取克隆6，用琼脂平板划线分离接种法接种在YPD琼脂板（1%酵母提取物,2% 蛋白胨,2% 葡萄糖, 2% 琼脂）上，30℃培养2天后挑取8个单克隆，分别接种在另一块YPD琼脂板，同时分别接种在含5毫升YPD培养基的50毫升培养管（Falcon conical tube）中，琼脂平板放30℃培养箱培养2天，置4℃保存，培养管置30℃摇床200rmp培养2天，在无菌条件下弃上清后加入5毫升YPM培养基（含0.5%甲醇、1%酵母提取物、2%蛋白胨），置30℃、200rpm生长，在培养的第24、48小时分别添加25微升无菌甲醇，培养72小时后离心，取上清，用SDS-PAGE分析克隆的表达，见图3。如图3所示，本轮筛选挑取的8个克隆均表达马血清白蛋白，表达量基本相同。

第二轮筛选：挑取第一轮筛选5个克隆中的克隆1，用琼脂平板划线分离接种法接种在YPD琼脂板上，30℃培养2天后挑取5个单克隆，分别接种在另一块YPD琼脂板，同时分别接种在含5毫升YPD培养基的50毫升培养管（Falcon conical tube）中，琼脂平板放30℃培养箱培养2天，置4℃保存，培养管置30℃摇床200rmp培养2天，在无菌条件下弃上清后加入5毫升YPM培养基（含0.5%甲醇、1%酵母提取物、2%蛋白胨），置30℃、200rpm生长，在培养的第24、48小时分别添加25微升无菌甲醇，培养72小时后离心，取上清，用SDS-PAGE分析克隆的表达。本轮筛选挑取的5个克隆均表达马血清白蛋白，表达量相同。

第三轮筛选：挑取第二轮筛选5个克隆中的克隆1，用琼脂平板划线分离接种法接种在YPD琼脂板上，30℃培养2天后挑取5个单克隆，分别接种在另一块YPD琼脂板，同时分别接种在含5毫升YPD培养基的50毫升培养管（Falcon conical tube）中，琼脂平板放30℃培养箱培养2天，置4℃保存，培养管置30℃摇床200rmp培养2天，在无菌条件下弃上清后加入5毫升YPM培养基（含0.5%甲醇、1%yeast extract、2%蛋白胨），置30℃、200rpm生长，在培养的第24、48小时分别添加25微升无菌甲醇，培养72小时后离心，取上清，用SDS-PAGE分析克隆的表达。本轮筛选挑取的5个克隆均表达马血清白蛋白，表达量相同。

取第三轮筛选中的克隆1，接种在含10毫升YPD培养基的50毫升培养管（Falconconical tube）中，培养管置30℃摇床200rmp培养2天，离心弃上清，细胞沉淀加5毫升YPD和5毫升甘油，充分混匀后以0.2毫升/管分装入0.5毫升塑料无菌管内，-70℃保存。此为主种子库。

实施例5 重组马血清白蛋白纯化

取30毫升SP-Sepharose FF凝胶装直径2.5cm层析柱，凝胶用20 mM 醋酸，50 mM氯化钠pH4.0缓冲液平衡至流穿液pH和电导与平衡液相同。

挑取实施例4中第三轮筛选中的克隆1，接种在1000mlYPD培养基中，30℃摇床200rmp培养2天，离心弃上清，细胞沉淀加1000毫升含1%甲醇的YP培养基，30℃摇床200rmp培养，第2小时和第3天各加10毫升甲醇，第3天末培养结束，离心弃沉淀，上清用1 M醋酸调pH至4.5后以每分钟10毫升速度过SP-Sepharose FF层析柱。上样结束后用20 mM 醋酸，50mM氯化钠pH4.5缓冲液洗涤至OD₂₈₀小于0.05，接着用20 mM 醋酸，150 mM氯化钠pH4.5缓冲液洗涤至OD₂₈₀小于0.05，然后用20 mM磷酸，500 mM氯化钠，pH7.0缓冲液洗脱，收集OD₂₈₀大于0.1的蛋白。用截留值10kD的超滤膜包超滤浓缩到50毫克/毫升，并置换缓冲液为20 mM磷酸，50 mM氯化钠，pH7.0缓冲液。

取20毫升DEAE-Sepharose FF凝胶装直径2.5cm层析柱，凝胶用20 mM磷酸，50 mM氯化钠，pH7.0缓冲液平衡至流穿液pH和电导与平衡液相同超滤后的样品以每分钟5毫升速度过DEAE-Sepharose FF层析柱。上样结束后用20 mM磷酸，50 mM氯化钠，pH7.0缓冲液洗涤至OD₂₈₀小于0.05，接着用20 mM磷酸，100 mM氯化钠，pH7.0缓冲液洗涤至OD280小于0.05，然后用20 mM磷酸，3500 mM氯化钠，pH7.0缓冲液洗脱，收集OD280大于0.1的蛋白。图4为DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化的目的蛋白SDS-PAGE电泳图谱，从图中可见在66KD有一条带，此条带即为马血清白蛋白。

DEAE-Sepharose FF纯化的目的蛋白用截留值10kD的超滤膜包超滤浓缩到100毫克/毫升，并置换缓冲液为20 mM磷酸，150 mM氯化钠，pH7.0缓冲液。为鉴定重组马血清白蛋白的纯度，用高压液相层析方法（SEC-HPLC）分析，层析柱在Agilent1260高效液相色谱仪层析所用的层析柱为TSK gel UP-SW3000（4.6 mm I.D. ×15 cm）,上样量20微克。图5为重组马血清白蛋白的高压液相层析图谱，目的蛋白在11.215分钟出峰，纯度大于99%，在10.879分钟处有一小峰，为目的蛋白的二聚体。

实施例6 狂犬病抗原制备

将VERO 细胞复苏后，按生产工艺传代和放大培养，达到生产规模后用于接种狂犬病毒。按病毒：细胞为1：200比例将狂犬病毒接种到VERO 细胞上复制增殖，待病毒滴度达到最佳水平时收获病毒细胞培养液。收获的狂犬病毒液用0.45μm滤芯浓缩20倍，以每4升病毒液加1毫升的比例加入β-丙内酯灭活剂，搅拌均匀后4℃孵育48小时进行灭活；接着置37℃2小时彻底降解β-丙内酯。病毒灭活检验合格后，过柱高为90cm的Sepharose 4B分子排阻凝胶层析柱，用pH7.0，20 mM磷酸，0.15 M氯化钠缓冲液洗涤。收集外水体积流出的蛋白峰，即为纯化的狂犬病抗原。

柱层析获得的狂犬病抗原分成3组。第一组加入每100毫升狂犬病抗原加重组马血清白蛋白至2%（w/v），山梨醇至2%（w/v），用1N盐酸或氢氧化钠调节pH至7.0-7.2，2-8℃避光保存；第二组加入每100毫升狂犬病抗原加人血清白蛋白至2%（w/v），山梨醇至2%（w/v），用1N盐酸或氢氧化钠调节pH至7.0-7.2，2-8℃避光保存；第三组加入每100毫升狂犬病抗原加山梨醇至2%（w/v），用1N盐酸或氢氧化钠调节pH至7.0-7.2，2-8℃避光保存。

实施例7狂犬病抗原稳定性实验

三组添加不同稳定剂的狂犬病抗原进行2-8℃ 24个月，25℃ 12个月，37℃ 3个月稳定性实验。表1为稳定性实验结果：

表1

实施例8 马匹免疫实验

挑选6匹4岁马，随机分成2组，每组3匹。第一组马匹编号为1、2、3，所用的抗原为人血清白蛋白作为保护剂的狂犬病抗原；第二组马匹编号为4、5、6，所用抗原为重组马血清白蛋白作为稳定剂的狂犬病抗原。每匹马每次免疫剂量为5U,免疫时抗原与等量福氏不完全佐剂混匀成乳状后颈部皮下注射。共注射4次，每次间隔2周，第四次注射后10天颈静脉采血进行检测。

实施例9 马血清抗狂犬病毒抗体效价测定

狂犬病毒包被的ELISA板选用购自宁波天润人狂犬病病毒 IgG抗体测定试剂盒（酶联免疫法），阳性对照血清用狂犬病毒疫苗原液（购自宁波荣安生物药业有限公司）免疫、已知抗体效价的马抗人狂犬病毒血清，待检样品为实施例8马匹免疫四次后采集的血清，阴性血清为正常马血清。HRP标记的兔抗马IgG购自北京百奥莱博科技有限公司。

从试剂盒中取出已包被狂犬病毒抗原的酶标板。阳性对照血清用PBS稀释1000倍、待检马血清样品用PBS稀释1000倍、阴性对照血清用PBS稀释20倍后各取0.1ml加入到上述已包被狂犬病毒抗原的酶标板反应孔中，置37℃孵育1小时。洗涤3次，每次3分钟。HRP标记的兔抗马IgG用PBS以1:10000稀释后每孔加0.1毫升，置37℃孵育1小时后弃去，洗涤3次，每次3分钟。最后一次洗涤后吸干残留液体，于各反应孔中加入临时配制的TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液0.1ml，37℃反应20分钟后于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止反应。在ELISA检测仪上，读取OD450。表2的ELISA结果中显示用两种不同白蛋白作为保护剂的狂犬病抗原免疫的马匹均呈现抗狂犬病毒抗体阳性反应，而且抗体滴度相似。

表2. 马匹血清抗狂犬病毒效价

实施例10 马血清抗人血清白蛋白效价测定

人血清白蛋白购自上海生物制品研究所，马抗人血清白蛋白血清作为阳性对照系我公司免疫室制备，阴性对照为正常马血清。人血清白蛋白用用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液稀释至蛋白质含量为1μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟 (简称洗涤，下同)。每孔加0.2ml封闭液（20 mMPBS，pH7.2，含5%脱脂奶粉），室温放置1小时1后弃去，洗涤一次。阳性对照血清与用人血清白蛋白为保护剂的狂犬病抗原免疫马匹的血清用PBS稀释1000倍、重组马血清白蛋白为保护剂的狂犬病抗原免疫马血清样品与阴性对照血清用PBS稀释20倍后取0.1ml加入到上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。洗涤3次，每次3分钟。HRP标记的兔抗马IgG用PBS以1:10000稀释后每孔加0.1毫升，置37℃孵育1小时后弃去，洗涤3次，每次3分钟。最后一次洗涤后吸干残留液体，于各反应孔中加入临时配制的TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液0.1ml，37℃反应20分钟后于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止反应。在ELISA检测仪上，读取OD₄₅₀。从表3中可见用重组马血清白蛋白为保护剂的狂犬病抗原免疫的马匹血清中无人血清抗白蛋白抗体。

表3.ELISA法检测马血清抗人血清白蛋白抗体

。

序列表

<110>上海赛伦生物技术股份有限公司

<120>一种重组马血清白蛋白及其制备方法和应用

<130> WH-NP-19-100486

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1827

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

acaatgaagt gggtaacctt tgtttccctt ctctttctct tcagctctgc ttattccaga 60

ggcgtgttgc gtcgtgatac acacaagagt gagattgctc atcggtttaa tgatttggga 120

gaaaaacatt tcaaaggcct ggtgctggtt gccttttctc agtatctcca gcagtgccca 180

tttgaggacc acgtaaaatt agtgaatgaa gtaactgaat ttgcaaaaaa atgtgctgct 240

gatgagtcag ctgaaaattg tgacaagtca cttcatactc tttttggaga taaactgtgt 300

acagttgcaa ctcttcgtgc aacctacggt gaactggctg actgctgtga aaaacaagaa 360

cctgagagaa atgaatgctt cctgacacac aaagatgatc acccgaacct ccccaagctg 420

aaaccagaac cggacgctca gtgcgccgcc ttccaggaag atccagacaa gtttctggga 480

aaatacctgt atgaagttgc cagaagacat ccttactttt acggcccaga actacttttc 540

cacgctgagg aatataaagc agattttaca gaatgctgtc cagctgatga taagctggcc 600

tgtctgatac cgaagcttga tgctttgaag gaaagaatac tgctttcatc tgccaaagag 660

agactcaagt gctccagttt ccaaaatttt ggggagagag ctgtcaaagc atggtcagta 720

gctcgcctga gccagaaatt tcccaaggct gactttgcag aggtttccaa gatagtgaca 780

gatcttacca aagtccacaa ggaatgctgc cacggtgacc tgcttgaatg tgccgatgac 840

agggcggatc ttgccaagta catatgtgaa catcaagatt caatctctgg caaactgaaa 900

gcatgctgtg ataaaccttt gttgcaaaaa tcccactgca ttgccgaggt gaaagaagat 960

gacctgccta gtgacctgcc tgcattagct gctgattttg ctgaagataa ggaaatctgc 1020

aaacactata aggatgccaa agatgtcttc ctgggcacgt ttttgtatga atactcaaga 1080

aggcatcctg attactccgt ctccttgctg ttgagaattg ccaagacata tgaagccacg 1140

ctggagaagt gctgtgcgga ggccgaccct cctgcgtgct accgcacagt gtttgatcag 1200

tttacacctc ttgtggagga gcctaagagt ttagtcaaga aaaactgtga cctttttgaa 1260

gaggttggag agtatgactt tcaaaatgcg ctcatagttc gttacaccaa gaaagcaccc 1320

caggtgtcaa ctccaactct cgtggagatt ggaaggaccc tggggaaagt gggcagcaga 1380

tgctgtaaac ttcctgaatc agaaagattg ccctgttctg aaaaccatct ggccttggcc 1440

ctgaaccggt tgtgtgtgtt gcatgagaag acaccagtga gtgagaagat taccaaatgc 1500

tgcacggatt ccttggcgga aagacggcca tgcttttctg ctctggaact cgatgaagga 1560

tatgttccca aagaatttaa ggctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

cctgaagatg agaaacaaat caagaaacaa tctgcacttg ctgaactggt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagaaca actgaaaact gtcctgggaa atttctcagc ctttgtagcc 1740

aagtgctgcg gacgtgagga caaagaggcc tgctttgctg aggagggtcc aaaacttgtt 1800

gcttcgagtc aacttgcctt agcctaa 1827

<210> 2

<211> 1824

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

atgaagtggg tgacgtttgt aagtctgttg tttttgttct catccgccta ctcaagaggc 60

gtcctgcgtc gtgacactca taaatccgag atagctcata ggttcaatga tcttggagag 120

aaacatttta agggccttgt tctggtcgca ttttcccagt acctgcagca gtgtcccttc 180

gaagatcacg ttaagttggt aaatgaggtg acggaatttg ccaagaagtg tgccgccgat 240

gagtccgccg agaactgcga taagtctttg catactcttt tcggagacaa gttatgtaca 300

gtggccactc taagggccac ttatggcgaa cttgctgact gctgcgagaa acaggagcct 360

gagaggaatg aatgtttcct tacacacaaa gacgatcatc ccaatcttcc aaaactgaaa 420

cctgagccag acgcacagtg tgcagcattc caagaggatc ctgacaaatt cctaggaaaa 480

tatctttatg aagtggccag gagacatcct tatttctacg gtccagaact gctattccac 540

gcagaggagt acaaggctga cttcacggag tgctgtccag cagacgataa actggcttgt 600

ttgattccta agttggatgc tttaaaggag agaattttgc tatcttctgc caaagaacgt 660

ctaaaatgtt ctagttttca gaactttggt gaaagggcag tcaaagcctg gtcagtagct 720

aggttatcac aaaaatttcc aaaggcagac tttgctgagg tatccaagat agtcaccgac 780

ttaactaagg ttcacaagga atgctgtcac ggtgacctat tggaatgcgc tgatgatcgt 840

gctgacctgg ccaaatacat ctgcgaacat caggactcta tatcaggcaa gcttaaagcc 900

tgttgtgaca agcccctttt gcaaaagtca cattgcatag ctgaggtcaa ggaggacgat 960

ctgccttcag atctgccagc attggccgcc gacttcgccg aggataaaga aatctgcaag 1020

cactataaag acgctaagga cgttttttta ggaaccttct tgtatgagta ttcccgtcgt 1080

cacccagatt atagtgtctc tttgctacta agaattgcaa agacatatga ggctacgctt 1140

gagaaatgct gtgcagaagc agacccccct gcatgctatc gtactgtgtt cgaccagttc 1200

acgcccttag tcgaagagcc taaatccttg gtaaaaaaaa attgcgattt atttgaagag 1260

gtgggagaat acgactttca aaatgctcta atagtccgtt atacaaaaaa ggccccccaa 1320

gtatctactc ccacgttggt tgagatcggc agaacgcttg gcaaggtcgg ctctcgttgc 1380

tgtaaattac ctgaatccga acgtttacca tgcagtgaaa atcacttagc cttggctctg 1440

aacagattgt gtgtgttgca cgagaaaacc ccagtcagtg aaaaaattac taaatgctgt 1500

acggactcat tagctgaacg tcgtccatgc ttctcagcac tggagttaga cgagggctac 1560

gtgcccaaag agtttaaagc agaaacgttc acctttcatg cagacatctg tacgttacca 1620

gaagatgaaa aacagatcaa gaagcaatca gccttggccg agctagttaa acacaagcct 1680

aaggccacga aagagcagtt gaaaacggtt ctgggcaatt tctcagcttt tgtcgccaaa 1740

tgttgcggca gagaggataa agaggcatgc ttcgcagagg agggccccaa gctagttgct 1800

tcctcacaat tggcactagc ctaa 1824

<210> 3

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

ctgaattcaa taatgaagtg ggtgacgttt gtaagtctgt tgtttttgtt ctcatccgcc 60

tactcaagag gcgtcctgcg tcgtgacact cataaatccg agatagctca taggttcaat 120

gatcttggag agaaacattt taagggcctt gttctggtcg cattttccca gtacctgcag 180

cagtgtccct tcgaagatca cgttaagttg gtaaatgagg tgacggaatt tgccaagaag 240

tgtgccgccg atgagtccgc cgagaactgc gataagtctt tgcatactct tttcggagac 300

aagttatgta cagtggccac tctaagggcc acttatggcg aacttgctga ctgctgcgag 360

aaacaggagc ctgagaggaa tgaatgtttc cttacacaca aagacgatca tcccaatctt 420

ccaaaactga aacctgagcc agacgcacag tgtgcagcat tccaagagga tcctgacaaa 480

ttcctaggaa aatatcttta tgaagtggcc aggagacatc cttatttcta cggtccagaa 540

ctgctattcc acgcagagga gtacaaggct gacttcacgg agtgctgtcc agcagacgat 600

aaactggctt gtttgattcc taagttggat gctttaaagg agagaatttt gctatcttct 660

gccaaagaac gtctaaaatg ttctagtttt cagaactttg gtgaaagggc agtcaaagcc 720

tggtcagtag ctaggttatc acaaaaattt ccaaaggcag actttgctga ggtatccaag 780

atagtcaccg acttaactaa ggttcacaag gaatgctgtc acggtgacct attggaatgc 840

gctgatgatc gtgctgacct ggccaaatac atctgcgaac atcaggactc tatatcaggc 900

aagcttaaag cctgttgtga caagcccctt ttgcaaaagt cacattgcat agctgaggtc 960

aaggaggacg atctgccttc agatctgcca gcattggccg ccgacttcgc cgaggataaa 1020

gaaatctgca agcactataa agacgctaag gacgtttttt taggaacctt cttgtatgag 1080

tattcccgtc gtcacccaga ttatagtgtc tctttgctac taagaattgc aaagacatat 1140

gaggctacgc ttgagaaatg ctgtgcagaa gcagaccccc ctgcatgcta tcgtactgtg 1200

ttcgaccagt tcacgccctt agtcgaagag cctaaatcct tggtaaaaaa aaattgcgat 1260

ttatttgaag aggtgggaga atacgacttt caaaatgctc taatagtccg ttatacaaaa 1320

aaggcccccc aagtatctac tcccacgttg gttgagatcg gcagaacgct tggcaaggtc 1380

ggctctcgtt gctgtaaatt acctgaatcc gaacgtttac catgcagtga aaatcactta 1440

gccttggctc tgaacagatt gtgtgtgttg cacgagaaaa ccccagtcag tgaaaaaatt 1500

actaaatgct gtacggactc attagctgaa cgtcgtccat gcttctcagc actggagtta 1560

gacgagggct acgtgcccaa agagtttaaa gcagaaacgt tcacctttca tgcagacatc 1620

tgtacgttac cagaagatga aaaacagatc aagaagcaat cagccttggc cgagctagtt 1680

aaacacaagc ctaaggccac gaaagagcag ttgaaaacgg ttctgggcaa tttctcagct 1740

tttgtcgcca aatgttgcgg cagagaggat aaagaggcat gcttcgcaga ggagggcccc 1800

aagctagttg cttcctcaca attggcacta gcctaagaat tc 1842

<210> 4

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

MKWVTFVSLL FLFSSAYSRG VLRRDTHKSE IAHRFNDLGE KHFKGLVLVA FSQYLQQCPF 60

EDHVKLVNEV TEFAKKCAAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRATYGE LADCCEKQEP 120

ERNECFLTHK DDHPNLPKLK PEPDAQCAAF QEDPDKFLGK YLYEVARRHP YFYGPELLFH 180

AEEYKADFTE CCPADDKLAC LIPKLDALKE RILLSSAKER LKCSSFQNFG ERAVKAWSVA 240

RLSQKFPKAD FAEVSKIVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICEH QDSISGKLKA 300

CCDKPLLQKS HCIAEVKEDD LPSDLPALAA DFAEDKEICK HYKDAKDVFL GTFLYEYSRR 360

HPDYSVSLLL RIAKTYEATL EKCCAEADPP ACYRTVFDQF TPLVEEPKSL VKKNCDLFEE 420

VGEYDFQNAL IVRYTKKAPQ VSTPTLVEIG RTLGKVGSRC CKLPESERLP CSENHLALAL 480

NRLCVLHEKT PVSEKITKCC TDSLAERRPC FSALELDEGY VPKEFKAETF TFHADICTLP 540

EDEKQIKKQS ALAELVKHKP KATKEQLKTV LGNFSAFVAK CCGREDKEAC FAEEGPKLVA 600

SSQLALA 607

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

cctgagagga atgaatgttt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

gcaaatggca ttctgacatc c 21