阅读说明：本技术 一种提取枣树叶片中的dna的方法 (Method for extracting DNA from jujube tree leaves ) 是由 李春丽 于 2018-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种提取枣树叶片中的DNA方法。本发明提供的提取枣树叶片中的DNA方法包括如下步骤：选取新鲜枣树嫩叶于冰箱内下暗处理、研磨、加入第一缓冲液、恒温水浴中、离心、加入酚、氯仿和异戊醇混合液、离心、加入氯仿、异戊醇混合液、离心、加入第二缓冲液、加入冷乙醇漂洗、加入第三缓冲液过夜溶解等步骤。使用本发明提供的方法提取的DNA纯度较高,浓度较大,本发明还提高了DNA提取的效率。(The invention provides a method for extracting DNA from jujube leaves. The method for extracting DNA from jujube tree leaves provided by the invention comprises the following steps: selecting fresh jujube tender leaves, performing dark treatment in a refrigerator, grinding, adding a first buffer solution, performing constant-temperature water bath, centrifuging, adding a mixed solution of phenol, chloroform and isoamyl alcohol, centrifuging, adding a mixed solution of chloroform and isoamyl alcohol, adding a second buffer solution, adding cold ethanol, rinsing, adding a third buffer solution, dissolving overnight and the like. The DNA extracted by the method provided by the invention has higher purity and higher concentration, and the invention also improves the efficiency of DNA extraction.)

一种提取枣树叶片中的DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种DNA提取方法，尤其涉及一种提取枣树叶片中的DNA的方法。

背景技术

黄原酸盐，由于颜色发黄，俗称黄药，是金属硫化矿浮选最常用的捕收剂。几乎所有品种的黄药均可作为泡沫浮选的捕收剂。近年来，随着纳米科技的迅速兴起，黄药作为制备硫化物纳米粒子前驱体的研究再一次引起了人们对这种传统浮选捕收剂的关注。PEX(potassium ethyl xanthate)属于黄药类试剂，在常温下是淡黄色粉末状固体，常因杂质存在而颜色稍深，有刺激性臭味，具有一定的毒性，所以在操作的时候要注意防护。

众所周知，要从植物组织或细胞中得到高质量的DNA，尤其当植物被用作原材料时，步骤会比较复杂。而对于带有多糖、坚硬的细胞壁、色素或次生代谢复杂的化学成份较多的植物来说，在分离过程中必须特殊考虑这些成分，要提取到好的DNA，更是比较困难。

枣树各组织中蛋白质、酚类、单宁、色素、多糖含量较高，尤以生长旺盛的幼嫩组织为甚。当植物组织所含的蛋白质等诸多物质含量高时，严重影响基因组DNA提取质量，很容易出现DNA呈黏稠状的现象，枪头难以吸取，各类酶对其作用时将完全或部分失去活性。对于ISSR分子标记技术，它是一种迅速、简单、可靠、灵敏并且能够提供丰富基因组信息的DNA指纹技术，是基于PCR技术为基础的，因此ISSR易于受到PCR的影响因素(如模板浓度、引物、温度、Taq DNA酶以及Mg²⁺浓度等)的影响。若提取的DNA有降解，或者纯度不够，实验无结果或者结果不稳定。

到目前为止，已经出版的关于枣树DNA的提取方法。主要是利用SDS或CTAB试剂，一般CTAB提取纯化时步骤比较多，DNA丢失比较严重，提取到的DNA量相对较少；SDS法虽简便，但一般提取的纯度又不够，尤其对于成分复杂的枣树种类来说，提取到高纯度的基因组DNA比较困难。

发明内容

为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种使用PEX方法对枣树叶片中的DNA进行提取的方法。

本发明提供了的使用PEX方法对枣树叶片中的DNA进行提取的方法包括以下步骤：1、一种提取枣树叶片中的DNA方法，包括如下步骤：a)选取新鲜枣树嫩叶，于冰箱内0～4℃下暗处理48h，快速称取0.1g于液氮中研磨成细粉，取其快速地转移到1.5mL EP管中，加入65℃预热的800μL的第一缓冲液混匀，第一缓冲液包括2.5mM的PEX、浓度为4％(g/mL)的可溶性PVP、100mM pH值为7.5的Tris、10mM pH值为7.5的EDTA、浓度为2％(μL/mL)的β-巯基乙醇、700mM NaCl；b)65℃恒温水浴中温育20min，每5min轻轻颠倒混匀一次；取出后，13000rpm室温离心5min；c)取上清，向其中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，其中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1，上下颠倒混匀，13000rpm离心5min；d)取上清，加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1，颠倒混匀，13000rpm离心5min；e)移上清液至一加有700μL预冷的异丙醇的2mL EP管中，再加入150μL第二缓冲液后轻轻上下颠倒混匀，所述第二缓冲液是3M pH值为5.2的NaAC；13000rpm于4℃离心10min，倒掉上清收集沉淀；f)将沉淀中加入1mL70％的冷乙醇漂洗，重复两次，倒掉乙醇室温或真空干燥沉淀；g)加入50μL第三缓冲液，所述第三缓冲液是RTE，其中含有20ug/mL的pH值为8.0的RNase，4℃条件下过夜溶解。

附图说明

图1指所提取DNA经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测的结果；

图2指由引物UBC-807扩增的ISSR分子标记技术检测DNA的质量图谱；

图3指由引物UBC-811扩增的ISSR分子标记技术检测DNA的质量图谱。

其中，1-10号为材料，M为分子质量标准

具体实施方式

本实施例中，采用如下步骤对枣树叶片中的DNA进行提取：

a)选取新鲜枣树嫩叶，于冰箱内0～4℃下暗处理48h，快速称取0.1g于液氮中研磨成细粉，取其快速地转移到1.5mL EP管中，加入65℃预热的800μL的第一缓冲液混匀，第一缓冲液包括2.5mM PEX、4％(每100mL中含4g)可溶性PVP、100mM pH值为7.5的Tris、10mM pH值为7.5的EDTA、2％(每100mL中含2μL)β-巯基乙醇、700mM NaCl；b)65℃恒温水浴中温育20min，每5min轻轻颠倒混匀一次，取出后，13000rpm室温离心5min；c)取上清，向其中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，其中，酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1(体积比)，上下颠倒混匀后，13000rpm离心5min；d)取上清，加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其中氯仿∶异戊醇＝24∶1(体积比)，颠倒混匀后，13000rpm离心5min；e)移上清液至一加有700μL预冷的异丙醇的2mL EP管中，再加入150μL第二缓冲液后轻轻上下颠倒混匀，所述第二缓冲液是3M pH值为5.2的NaAC；13000rpm/min于4℃离心10min，倒掉上清收集沉淀；f)将沉淀中加入1mL70％的冷乙醇漂洗，重复两次，倒掉乙醇室温或真空干燥沉淀；g)加入50μL第三缓冲液，所述第三缓冲液是RTE，其中含有20ug/mL的pH值为8.0的RNase，4℃条件下过夜溶解。

下面利用实验对提取得到的DNA进行分析。

1、对提取的DNA浓度和纯度鉴定。

分别取5μL提取的DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪(美国UVP)检测，结果如图1所示。

结果显示所提取的10种枣树DNA整齐单一，基本没有弥散的条带，说明提取的DNA完整性较好，而且大部分材料点样孔清晰可见(少数几个孔道如第3、6、9有拖尾现象)，初步说明DNA的杂质含量较少。

对所得DNA用微量紫外分光光度计(Thermo nanodrop 2000)进一步检测其浓度及纯度，读出DNA的浓度以及A₂₆₀/A₂₈₀与A₂₆₀/A₂₃₀的比值。(表1)。

A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀的比值用于评估样品的纯度。对于纯净的DNA样品，一般A₂₆₀/A₂₈₀的比值大于1.8，A₂₆₀/A₂₃₀的比值大于2.0。当A₂₆₀/A₂₈₀比值低于1.8，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响；若A₂₆₀/A₂₃₀的比值小于2.0，表明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染，需要进一步纯化样品。

表1 样品DNA纯度及浓度

由表1可以看出，所提取的枣树DNA样品的浓度都很高，且大部分材料的A₂₆₀/A₂₈₀比值大于1.8，A₂₆₀/A₂₃₀的比值大于2。由此说明此方法对于枣树材料中的蛋白质或者酚类物质的纯化效果较好，而对于部分材料的A₂₆₀/A₂₃₀比值小于2.0，说明碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染的除去效果欠佳，个人认为可能由于几种枣树材料中糖分含量较高，彻底除去比较困难，但通过后面ISSR分子标记实验验证结果表明，基本不影响实验的分析。

2、对所提取枣树DNA的ISSR分子标记应用分析

将所提取的DNA按照ISSR-PCR反应体系要求，用去离子水统一稀释到所用浓度后，4℃备用(此条件下不能储存时间太长)。

ISSR-PCR反应体系：10×Buffer(Mg²⁺plus)，200μmol/L dNTP，0.2μmol/L primer，3ng/μL template，0.04U/μL Taq DNA polymerase，补ddH₂O至20μL。

PCR扩增反应程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，45s；50℃，45s；72℃，90s，35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像分析仪扫描照相。根据指纹图谱的清晰度、多态性进一步评价DNA质量。结果见图2。

由图2看到，经前期实验筛选出来两个的ISSR引物UBC-807、UBC-811，按照体系扩增结果验证，每一个材料都有相应的多态性条带(即使部分材料提取的纯度不高)，结果稳定，可靠，为有效的实验结果图，且与初试结果相符。说明提取的DNA是有意义的。

相对CTAB与SDS提取方法来说，本发明使用的PEX法，方法较简单、省时，而且提取量大，提取的DNA能够满足ISSR-PCR实验的要求。且PEX试剂一般用作化工试剂，价格相对低廉，这对于研究大量样本(如植物组织、群体分离)的研究者来说，无疑是一个很好的选择。此发明是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，提取的DNA纯度较高，浓度较大，提高了DNA提取的效率。个人认为，对于此提取法不仅适用于枣树，也可推广到其他物种如高糖分材料的研究中。如果按照标准的提取方法操作，提取结果仍然不满意，可以考虑适当加大NaCl浓度，或者加入酚、氯仿和异戊醇一步骤继续纯化，达到满意的效果为止。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。