阅读说明：本技术 用于鉴定多房棘球绦虫引物对、引物探针组以及他们的应用 (Primer pair and primer probe set for identifying echinococcus multilocularis and application of primer pair and primer probe set ) 是由 贾万忠 吴燕涛 闫鸿斌 李立 朱国强 李秀荣 李双男 姚刚 付宝权 于 2018-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于鉴定多房棘球绦虫引物对、引物探针组以及他们的应用。本发明提供了特异引物对,由序列2所示单链DNA分子和序列3所示单链DNA分子组成。本发明还保护引物探针组,由特异引物对和特异探针组成；特异探针自上游至下游依次由如下元件组成：区段甲、四氢呋喃和区段乙；区段甲如序列4所示,且3’末端第2位核苷酸被荧光基团修饰；区段乙如序列5所示,且5’末端第2位核苷酸被淬灭基团修饰,且3’末端进行C3 Spacer修饰。特异引物对或引物探针组可用于：鉴定多房棘球绦虫；鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫。本发明提供特异引物对或引物探针组用于鉴定多房棘球绦虫,操作简便、快速、特异性强、灵敏度高。(The invention discloses a primer pair and a primer probe set for identifying Echinococcus multilocularis and application thereof. The invention provides a specific primer pair, which consists of a single-stranded DNA molecule shown in a sequence 2 and a single-stranded DNA molecule shown in a sequence 3. The invention also protects a primer probe group, which consists of a specific primer pair and a specific probe; the specific probe is composed of the following components from upstream to downstream in sequence: segment a, tetrahydrofuran, and segment b; segment A is shown as sequence 4, and the 2 nd nucleotide at the 3' terminal is modified by a fluorescent group; segment B is shown in sequence 5, and the 2 nd nucleotide at the 5 'end is modified by a quencher group, and the 3' end is modified by C3 Spacer. Specific primer pairs or primer probe sets can be used for: identifying Echinococcus multilocularis; and identifying whether the sample to be detected contains Echinococcus multilocularis. The specific primer pair or primer probe set provided by the invention is used for identifying the Echinococcus multilocularis, and has the advantages of simple and convenient operation, rapidness, strong specificity and high sensitivity.)

用于鉴定多房棘球绦虫引物对、引物探针组以及他们的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定多房棘球绦虫引物对、引物探针组以及他们的应用。

背景技术

多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis,AE)又叫做泡型棘球蚴病、多房性棘球蚴病、泡型包虫病等，是我国最常见的棘球蚴病之一。它是由多房棘球绦虫的中绦期幼虫——多房棘球蚴(该病的病原体)寄生于人和动物等中间宿主的肺、肝和肠等脏器组织而引起的一类危害严重的***共患寄生虫病。肝脏是该病的原发器官，临床上病例几乎全部都是肝包囊。多房棘球蚴形成的囊泡外观呈葡萄状，经1～2年的侵润性发育几乎就可以占据整个肝脏，而后向肝脏表面蔓延至其他器官，甚至可以寄生于整个体腔。泡型包囊(“虫癌”)呈侵润性生长，可以像恶性肿瘤一样不断扩散转移至其他部位。该病严重威胁到人类的身体健康，若治疗不及时患者病死率极高，是一种能造成严重后果的***共患寄生虫病。

多房棘球绦虫的终宿主常见的是红(赤)狐、藏狐、沙狐、家犬和无主犬、狼、土狼、獾、野猫、家猫等，狐狸和犬是其中最主要的传染源。犬在泡型蚴病的传播过程中扮演着十分重要的角色，在我国的半农半牧地区几乎家家养犬，而且犬的排便区距离居民区很近，这极大的增加了人被虫卵感染的机会。多房棘球绦虫的中间宿主主要是啮齿动物，在我国常见的的啮齿动物包括高原田鼠、乌尔黄鼠、中华鼢鼠、青海田鼠和黑唇鼠兔等，另有有三种常见家畜(藏羊、牦牛和藏猪)等也有泡球蚴感染的报道。

多房棘球绦虫成虫在外观上和细粒棘球绦虫高度相似，但体型更小，长度通常为1.2mm～3.7mm，是带科绦虫中体型最小的虫种之一。虫体大多含有4～5个节片，有时可见含有6个节片的虫体。常见的虫体组成成分：头节、颈节、幼节、成节和孕节。头颈部略呈梨形，头顶部含有顶突和4个吸盘，顶突上有两圈小钩(通常为23～36个)。多房棘球绦虫的生殖孔开口常无规则，但大多数都开口于节片一侧的中前部，睾丸数量为16～36个，整个孕节几乎被子宫完全占据，子宫内含有大量的虫卵(约200个左右)。棘球绦虫的中绦期(续绦期)幼虫称为多房棘球蚴，是由无数形状不规则的白色或糜黄色，彼此界限不清晰的多房型囊泡聚集而成。在适宜中间宿主(如高原田鼠)体内囊泡发育成呈球形或不规则球形，囊泡大小形态很相似(直径0.1cm～0.7cm)，囊泡与囊泡相互交联贯通，囊泡外被机体组织(外膜)包裹。囊泡内含透明囊液和原头蚴的称为育囊；含胶状物而无原头蚴，则叫做不育囊。在田鼠等啮齿动物体内，多房棘球蚴包囊多为育囊；而在不适宜中间宿主(如人)体内常为呈胶团样物质的囊泡群，包囊内含少量原头蚴(原头节)或者甚至无原头蚴。外生性出芽生殖是泡球蚴的主要无性繁殖方式，泡球蚴能不断以侵润和转移方式感染并定居于包囊周围组织，少数也可向内芽生形成隔膜而分离出新囊泡，称为子囊。外生性子囊可以脱离病灶，经体液循环(血液和淋巴液)迁移到其他部位，发育为新的泡球蚴。

在彻底阐明多房棘球蚴病的病原体之前，泡型棘球蚴一直被当做是一种肝脏癌变。1885年德国的病理学家(Rudolf Virchow)首次发现该病是由一种寄生虫引起的，但这种寄生虫病和常见的单房型或囊型棘球蚴病不同，它具有传染性和浸润性，危害更大。Virchow将这种多室的(multilocular)、包囊小而多、含有明胶状物质且含有少量原头节的寄生虫病称为“多房型棘球蚴病”，这为多房棘球绦虫命名奠定了基础。直到1863年德国科学家(Rudolf Leuckart)才正式确立它是一个独立的种，并命名为多房棘球绦虫(E.multilocularis)。多房棘球蚴病多流行于寒冷地区呈泛北极分布，包括中欧、欧亚大陆、最北部和中部(向东延伸到日本)及北美州的部分地区。青海、宁夏、甘肃、新疆、四川和西藏等地牧区和半农半牧区是我国多房棘球蚴病的高发区，该病的治疗比囊型棘球蚴更加困难，部分患者除了手术摘取病灶外还需肝移植，给患者自身和家庭都带来了巨大的经济负担。

RPA技术全称为重组酶聚合酶扩增技术，主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB蛋白)、链置换活性的DNA聚合酶。RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。RPA技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。

因此，建立一种简便、快速、有效的棘球绦虫RPA检测方法，对于棘球蚴病的防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴定多房棘球绦虫引物对、引物探针组以及他们的应用。

本发明首先提供了特异引物对，由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。

本发明提供的引物对是基于RPA技术的。

本发明还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定多房棘球绦虫；

(b)鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定多房棘球绦虫；

(b)鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫。

本发明还保护一种鉴定待测绦虫是否为多房棘球绦虫的方法，包括如下步骤：

以待测绦虫的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行重组酶聚合酶扩增，如果可以实现有效扩增、待测绦虫为或候选为多房棘球绦虫，如果不能实现有效扩增、待测绦虫为或候选为非多房棘球绦虫。

本发明还保护一种鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫的方法，包括如下步骤：

以待测样本的总DNA为模板，采用所述特异引物对进行重组酶聚合酶扩增，如果可以实现有效扩增、待测样本含有多房棘球绦虫，如果不能实现有效扩增、待测样本不含有多房棘球绦虫。

所述方法中，具体通过电泳检测实现判断。

所述方法用于为非诊断目的。

本发明还保护一种引物探针组，由所述特异引物对和特异探针组成；

特异探针自上游至下游依次由如下元件组成：区段甲、四氢呋喃和区段乙；区段甲如序列表的序列4所示，且3’末端开始计的第2位核苷酸被荧光基团修饰；区段乙如序列表的序列5所示，且5’末端开始计的第2位核苷酸被淬灭基团修饰，且3’末端进行C3Spacer修饰。

本发明提供的引物探针组是基于RPA技术的。

所述荧光基团具体可为FAM。所述淬灭基团具体可为BHQ1。

本发明还保护所述引物探针组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定多房棘球绦虫；

(b)鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定多房棘球绦虫；

(b)鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫。

本发明还保护一种鉴定待测绦虫是否为多房棘球绦虫的方法，包括如下步骤：

以待测绦虫的基因组DNA为模板，采用所述引物探针组进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，如果可以实现有效扩增、待测绦虫为或候选为多房棘球绦虫，如果不能实现有效扩增、待测绦虫为或候选为非多房棘球绦虫。

本发明还保护一种鉴定待测样本中是否含有多房棘球绦虫的方法，包括如下步骤：

以待测样本的总DNA为模板，采用所述引物探针组进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，如果可以实现有效扩增、待测样本含有多房棘球绦虫，如果不能实现有效扩增、待测样本不含有多房棘球绦虫。

所述方法中，具体通过检测荧光实现判断。

所述方法用于为非诊断目的。

以上任一所述待测绦虫为多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫或石渠棘球绦虫。

以上任一所述待测样本为来自于多房棘球绦虫的宿主动物的样本。

采用本发明提供的引物探针组，利用RPA技术检测多房棘球绦虫，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。本发明提供特异引物对或引物探针组用于鉴定多房棘球绦虫，操作简便、快速、特异性强、灵敏度高，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

附图说明

图1为实施例1中采用特异引物对进行PCR扩增的电泳图。

图2为实施例1中采用对照引物对甲进行PCR扩增的电泳图。

图3为实施例1中采用对照引物对乙进行PCR扩增的电泳图。

图4为实施例1中采用特异引物对进行RPA的电泳图。

图5为实施例2的结果。

图6为实施例3的步骤二的结果。

图7为实施例3的步骤三的结果。

图8为实施例4的步骤一的结果。

图9为实施例4的步骤二的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、引物的设计和筛选以及引物探针组的确定

一、引物的设计和筛选

RPA技术中的扩增引物可以说是整个反应的关键所在。引物过短会严重影响重组酶的活性。长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。对于RPA技术中的扩增引物来说，还没有一个确定的设计规则。因此，因此需要对候选引物进行测试和筛选(引物筛选主要分为以下几步：选择靶标区域，设计候选引物，筛选候选引物，提升性能再次筛选)。

经过上述步骤，获得最佳扩增引物对，由上游引物Em-c-Fnew2和下游引物Em-c-Rnew2组成(命名为特异引物对)。将筛选过程中的另外两对扩增引物对作为对照。其中，一对扩增引物对由上游引物Em-RPA-C-F和下游引物Em-RPA-C-R组成(命名为对照引物对甲)，另一对扩增引物对由上游引物Em-RPA-C-Fnew和下游引物Em-RPA-C-Rnew组成(命名为对照引物对乙)。

Em-c-Fnew2(序列2)：5′-TGTAGCAGATTCAACAGATTTAAAGGGATAC-3′；

Em-c-Rnew2(序列3)：5′-CTAAAACACCTACTCAACCCAATTATTAAATAC-3′。

Em-RPA-C-F：5′-TCTGTTGCTACATTGGTTGTTGCATGTTTTTA-3′；

Em-RPA-C-R：5′-CACCTACTCAACCCAATTATTAAATACATAAC-3′。

Em-RPA-C-Fnew：5′-GGTTGTTGCATGTTTTTATAGTGGTATAGAG-3′；

Em-RPA-C-Rnew：5′-CTGCTCAGAAAATCTATAAATAGCCCAAATC-3′。

以待测样本的基因组DNA为模板，分别采用三对引物对(特异引物对、对照引物对甲或对照引物对乙)进行PCR扩增。待测样本分别为：多头带绦虫(Tm)、泡状带绦虫(Th)、豆状带绦虫(Tp)、多房棘球绦虫(Em)、细粒棘球绦虫(Eg)、石渠棘球绦虫(Es)或健康田鼠肝组织(NC)。PCR扩增的反应体系(50μL)：上游引物1μL、下游引物1μL、Ex Taq预混酶25μL、基因组DNA 2μL、ddH₂O 21μL。PCR扩增的反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。采用特异引物对的电泳图见图1。采用对照引物对甲的电泳图见图2。采用对照引物对乙的电泳图见图3。只有特异引物对能对多房棘球绦虫进行特异性扩增(经测序，特异性扩增产物为247bp)，采用特异引物对时除了多房棘球绦虫其他待测样本均无扩增产物，表明该引物对的特异性良好。

以待测样本的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行RPA。待测样本分别为多头带绦虫(Tm)、泡状带绦虫(Th)、豆状带绦虫(Tp)、多房棘球绦虫(Em)、细粒棘球绦虫(Eg)、石渠棘球绦虫(Es)或健康田鼠肝组织(NC)。RPA的具体步骤(采用TwistAmp Basic试剂盒)：①将如下试剂加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀：上游引物(10μmol/L)2.4μL、下游引物(10μmol/L)2.4μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(基因组)1μL、ddH₂O 12.2μL；②将步骤①制备的47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；③完成步骤②后，将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀；④完成步骤③后，将反应管置于38℃孵育4min；⑤完成步骤④后，从38℃反应器中拿出反应管，上下颠倒混匀，涡旋后重新置于38℃反应器孵育20min；⑥使用DNA纯化试剂盒对扩增结果进行回收；⑦取5μL回收产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图4。只有多房棘球绦虫具有特异性扩增产物(经测序，特异性扩增产物为247bp)，其他待测样本均无扩增产物，表明该引物对的特异性良好。

二、引物探针组的确定

最终选择的引物探针组由上游引物Em-c-Fnew2、下游引物Em-c-Rnew2和特异探针Em-c-probe组成。

特异探针Em-c-probe为单链DNA分子，自上游至下游依次由如下元件组成：区段甲、四氢呋喃和区段乙。特异探针Em-c-probe的元件示意：区段甲-THF-区段乙。

区段甲如序列表的序列4所示，且3’末端开始计的第2位核苷酸(方框标注)被荧光基团FAM修饰。区段乙如序列表的序列5所示，且5’末端开始计的第2位核苷酸(方框标注)被淬灭基团BHQ1修饰，且3’末端进行C3Spacer修饰(SpacerC3)。

序列表的序列4：

序列表的序列5：

实施例2、引物探针组的特异性

待测样本分别为多头带绦虫(Tm)、泡状带绦虫(Th)、豆状带绦虫(Tp)、多房棘球绦虫(Em)、细粒棘球绦虫(Eg)、石渠棘球绦虫(Es)或健康田鼠肝组织(NC)。

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1确定的引物探针组(上游引物Em-c-Fnew2、下游引物Em-c-Rnew2、特异探针Em-c-probe)进行特异性荧光RPA检测(采用TwistAmp exo试剂盒)。

①将如下试剂加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀：Em-c-Fnew2(10μmol/L)2.1μL、Em-c-Rnew2(10μmol/L)2.1μL、Em-c-probe(10μmol/L)0.6μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(基因组)1μL、ddH₂O 12.2μL；

②将步骤①制备的47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

③完成步骤②后，将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀。此时的反应体系中，Em-c-Fnew2、和Em-c-Rnew2的浓度均为0.42μmol/L，Em-c-probe的浓度为0.12μmol/L。

④完成步骤③后，将反应管置于荧光定量PCR仪中，38℃反应20min，每分钟收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

结果见图5。只有多房棘球绦虫显示阳性扩增曲线(箭头标注)，其他待测样本均未发生有效扩增，表明该引物探针组的特异性良好。

实施例3、引物探针组的灵敏度

一、构建质粒标准品

将序列表的序列1所示的双链DNA分子***pMD19-T simple载体(TaKaRaBiotech)中，得到重组质粒pMD19-T-EmC，即为质粒标准品。

二、引物探针组的灵敏度

1、制备各个浓度的质粒标准品溶液，重组质粒pMD19-T-EmC的浓度分别为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL。

2、以步骤1得到的质粒标准品溶液为模板，采用实施例1确定的引物探针组(上游引物Em-c-Fnew2、下游引物Em-c-Rnew2、特异探针Em-c-probe)进行特异性荧光RPA检测(采用TwistAmp exo试剂盒)。

①将如下试剂加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀：Em-c-Fnew2(10μmol/L)2.1μL、Em-c-Rnew2(10μmol/L)2.1μL、Em-c-probe(10μmol/L)0.6μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(质粒标准品溶液)1μL、ddH₂O 12.2μL；

②将步骤①制备的47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

③完成步骤②后，将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀。此时的反应体系中，Em-c-Fnew2、和Em-c-Rnew2的浓度均为0.42μmol/L，Em-c-probe的浓度为0.12μmol/L。

④完成步骤③后，将反应管置于荧光定量PCR仪中，38℃反应20min，每分钟收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

将健康田鼠肝组织的基因组DNA作为质粒标准品的阴性对照(NC)。

结果见图6。随着模板中质粒标准品拷贝数的降低，曲线起飞时间和荧光信号值逐渐的下降，在模板中质粒标准品的拷贝数为10²时仍有扩增曲线。阴性对照没有明显的扩增曲线。

三、实时荧光PCR扩增的灵敏度

1、制备各个浓度的质粒标准品溶液，重组质粒pMD19-T-EmC的浓度分别为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL。

2、以步骤1得到的质粒标准品溶液为模板，进行SYBR Green I荧光定量PCR。

荧光定量PCR的引物如下：

Em-T-qpcr-F1：5’-TATTTATTTTGTGGTTGTAG-3’；

Em-T-qpcr-R1：5’-AAATAATCACCACCCAACTT-3’。

反应体系(25μL)：1μL模板，12.5μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix，上游引物、下游引物和水。反应体系中，上游引物的浓度和下游引物的浓度均为0.4μmol/L。

反应条件：95℃3min；95℃10min、55℃30s，40个循环。

Cq﹥35判定为无效扩增。

结果见图7。实时荧光PCR可检测的质粒拷贝数为10³copies/μL。

实施例4、临床样品检测

14份待测样本：样本1、样本3、样本4、样本5、样本7、样本10、样本11、样本12、样本14均为已确认感染多房棘球绦虫的犬粪样品，样本2、样本6、样本8、样本9、样本13均为已确认未感染多房棘球绦虫的犬粪样品。

4份人工感染细粒棘球绦虫的犬粪样品(依次命名为样本Eg1至样本Eg4)。将多房棘球绦虫的基因组DNA作为阳性对照(+)。将健康田鼠肝组织的基因组DNA作为阴性对照(-)。

一、普通-RPA检测

1、提取待测样本的总DNA。

2、以步骤1得到的总DNA为模板，采用特异引物对进行RPA。

RPA的具体步骤(采用TwistAmp Basic试剂盒)：

①将如下试剂加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀：Em-c-Fnew2(10μmol/L)2.4μL、Em-c-Rnew2(10μmol/L)2.4μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(总DNA)1μL、ddH₂O12.2μL；

②将步骤①制备的47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

③完成步骤②后，将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀；

④完成步骤③后，将反应管置于38℃孵育4min；

⑤完成步骤④后，从38℃反应器中拿出反应管，上下颠倒混匀，涡旋后重新置于38℃反应器孵育20min；

⑥使用DNA纯化试剂盒对扩增结果进行回收；

⑦取5μL回收产物进行琼脂糖凝胶电泳。

电泳图见图8。

二、实时荧光-RPA检测

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1确定的引物探针组进行特异性荧光RPA检测(采用TwistAmp exo试剂盒)。

①将如下试剂加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀：Em-c-Fnew2(10μmol/L)2.1μL、Em-c-Rnew2(10μmol/L)2.1μL、Em-c-probe(10μmol/L)0.6μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(基因组)1μL、ddH₂O 12.2μL；

②将步骤①制备的47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

③完成步骤②后，将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀。此时的反应体系中，Em-c-Fnew2、和Em-c-Rnew2的浓度均为0.42μmol/L，Em-c-probe的浓度为0.12μmol/L。

④完成步骤③后，将反应管置于荧光定量PCR仪中，38℃反应20min，每分钟收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

结果见图9。

结果表明：阴性对照样品、感染细粒棘球绦虫的犬粪和未感染多房棘球绦虫的犬粪样品的荧光RPA和普通PCR检测结果均呈阴性，而感染多房棘球绦虫的犬粪样品DNA检测结果均为阳性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 用于鉴定多房棘球绦虫引物对、引物探针组以及他们的应用

<130> GNCYX181466

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atatttcttt gtcgtctgtt gctacattgg ttgttgcatg tttttatagt ggtatagaga 60

tttgtttttt tatttattgg tattactttt tctgggggtt atgtagaatt atttattttg 120

tggttgtagc agattcaaca gatttaaagg gatactattt ttggttgttt tgttttttat 180

tattagtgac tcctgtatct atgcctttag tatataagtt gagtgtgtgt gttggtatat 240

tttattcttc agtttatatc ttgttgattt gggctattta tagattttct gagcagtttt 300

ttttgtttaa gttgggtggt gattattttt atagttatgt atttaataat tgggttgagt 360

aggtgtttta gtttttatta gtattgtaat gtagtttatg aaaaattttc gttttacacg 420

cgagagaact cggtttgagc tttactatat taaacatggt agtttattaa aaatattgag 480

tttgcgtctc gatgataggt a 501

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tgtagcagat tcaacagatt taaagggata c 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ctaaaacacc tactcaaccc aattattaaa tac 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ctcctgtatc tatgccttta gtatataagt tg 32

<210> 5

<211> 17

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<400> 5

gtgtgtgtgt tggtata 17