阅读说明：本技术 微生物发酵生产氨基葡萄糖硫酸钾盐的方法 (Method for producing glucosamine potassium sulfate salt by microbial fermentation ) 是由 卢健行 韩宁 吴祥舟 张建华 卢建功 卢建智 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种微生物发酵生产氨基葡萄糖硫酸钾盐的方法,将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌进行种子活化后制得混合发酵剂,将混合发酵剂接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中恒温摇床培养,得到含有氨基葡萄糖的发酵液,经分离纯化后进一步制得氨基葡萄糖硫酸钾盐并提纯。本发明通过混合发酵剂提高大肠杆菌的发酵活力,半胱氨酸、丙氨酸的加入可以降低发酵过程中谷氨酸的产生速度,提高氨基葡萄糖合成速率和产品纯度,从而提高最终产品氨基葡萄糖硫酸钾盐的纯度。(The invention discloses a method for producing glucosamine potassium sulfate by microbial fermentation, which comprises the steps of activating seeds of escherichia coli, bacillus subtilis and staphylococcus to prepare a mixed starter culture, inoculating the mixed starter culture into a fermentation medium containing glucose and a nitrogen source, carrying out constant-temperature shaking table culture to obtain a fermentation broth containing glucosamine, separating and purifying, and further preparing and purifying the glucosamine potassium sulfate. The fermentation activity of the escherichia coli is improved by the mixed starter, the production speed of the glutamic acid in the fermentation process can be reduced by adding the cysteine and the alanine, the synthesis rate of the glucosamine is increased, the purity of the product is improved, and the purity of the final product, namely the glucosamine potassium sulfate is improved.)

微生物发酵生产氨基葡萄糖硫酸钾盐的方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵生产氨基葡萄糖硫酸钾盐的方法。

背景技术

氨基葡萄糖(GleN)是一种重要的氨基己糖，它由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，目前市面上氨基葡萄糖主要有两类，一是氨基葡萄糖盐酸盐，一类是氨基葡萄糖硫酸盐。氨基葡萄糖盐酸盐(D-Glucosamine Hydrochloride)，分子式C₆H₁₃NO₅·HCl，是一种白色结晶，无气味，略有甜味，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于乙醇等有机溶剂，它对人体具有重要的生理功能，参与肝肾解毒，发挥抗炎护肝作用，对治疗风湿性关节炎症和胃溃疡有良好的疗效，是合成抗生素和抗癌药物的主要原料；还可应用于食品、化妆品和饲料添加剂中。氨基葡萄糖盐酸盐是由天然的甲壳质提取的，是一种海洋生物制剂，是硫酸软骨素的主要成分。它能促进人体粘多糖的合成，提高关节滑液的粘性，能改善关节软骨的代谢，有利于关节软骨的修复，具有明显的消炎镇痛作用。它具有促进抗生素注射效能的作用，可供糖尿病者作营养补助剂。

目前生产氨基葡萄糖的方法主要有酸水解法、酶解法及微生物发酵法。酸水解法和酶解法的生产原料来源于鱼虾蟹等的外骨骼，通过提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或酶解获得氨基葡萄糖；但酸水解法工艺过程中需要使用大量浓盐酸，会带来较严重的工业污染；酶解法是利用壳聚糖对鱼虾蟹外骨骼进行降解，该工艺效率低下，生产成本较高，因此，寻找合适的微生物发酵法实现氨基葡萄糖的工业化生产是目前的环境和市场需求。大肠杆菌是一种较为常见的氨基葡萄糖合成酶生产菌。研究表明：在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶(GlmS)的催化作用下，生成氨基葡萄糖。但是现有技术中，该工艺的氨糖生产量较低，很难实现工业化高效生产，且产品纯度达不到消费者眼球。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种微生物发酵生产氨基葡萄糖硫酸钾盐的方法，生产效率高，成本低，操作简单。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种微生物发酵生产氨基葡萄糖硫酸钾盐的方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌进行种子活化后制得混合发酵剂；

(2)将混合发酵剂接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中恒温摇床培养，控制摇床转速230-250rpm，培养温度为35-38℃，培养时间为35-48h；

(3)发酵过程采用恒速补料方式进行，控制葡萄糖补料速度为3-5L/h，用氨水控制发酵过程pH为6.8-7.0，发酵培养35-48h得发酵液；

(4)发酵液离心分离，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入盐酸进行水解得水解液；

(5)水解液在75-90℃、真空度-0.05～-0.1MPa下真空浓缩，回收盐酸；

(6)将浓缩液降温至5-10℃，在搅拌下结晶5-7h，沉淀3-4h后，离心分离得氨基葡萄糖盐酸盐粗品，离心所得母液加入浓盐酸用于飞机熬夜浓缩液水解；

(7)所得粗产品用水溶解，水溶液经预处理过的大孔吸附树脂柱层析，用水洗脱，直至无氯离子，减压浓缩、重结晶得氨基葡萄糖盐酸盐；

(8)将氨基葡萄糖盐酸盐溶解在水中，在搅拌条件下加入硫酸钾，在40-50℃搅拌30-60min，反应产物在真空下冷冻干燥得氨基葡萄糖硫酸钾盐。

作为优选方案，步骤(1)中所述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌在进行种子活化前在平板培养基上活化培养6-8h。

进一步的，步骤(1)中所述平板培养基包括鱼蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉6g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、琼脂15g/L。

进一步的，步骤(1)中所述混合发酵剂按照大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌的体积比3:(1-2):(0.8-1)制得。

进一步的，步骤(1)中所述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌的种子活化为将菌种接种在种子培养基中，控制培养温度36-38℃，摇床速度220-270rpm，培养时间为12-14h。

进一步的，步骤(1)中所述种子培养基包括鱼蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、甘油5.5g/L，pH 6.8-7.0。

作为优选方案，步骤(2)中所述发酵培养基包括：葡萄糖25g/L、酵母浸粉20g/L、丙氨酸10g/L、半胱氨酸10g/L、硝酸钠3g/L、磷酸氢二钾1.05g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乳糖3.2g/L、甘油5.5g/L。

进一步的，步骤(2)中所述混合发酵剂按10％的接种量接种在发酵培养基上。

作为优选方案，步骤(4)中所述盐酸为30％浓盐酸。

作为优选方案，步骤(6)中所述搅拌结晶的搅拌速度为50rpm。

作为优选方案，步骤(7)中所述大孔吸附树脂柱为732阳离子交换柱；水溶液通过柱床流速为3-5ml·cm^-2·min^-1；洗脱后的溶液用3-5％AgNO₃溶液检验洗脱液中的氯离子。

进一步的，步骤(7)中重结晶采用85-95％乙醇溶液进行。

作为优选方案，步骤(8)中硫酸钾、氨基葡萄糖盐酸盐、水的质量比为1:(2-4):(10-15)。

本发明的有益效果是：本发明通过混合发酵剂提高大肠杆菌的发酵活力，实现高效发酵生产氨基葡萄糖，半胱氨酸、丙氨酸的加入可以降低发酵过程中谷氨酸的产生速度，提高氨基葡萄糖的合成速率，通过酸解、浓缩、结晶、脱色提高产品纯度，不仅降低了反应的成本，而且提高了产品的收率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，本发明的保护范围包括但不限于以下实施例，在不偏离本申请的精神和范围的前提下任何对本发明的技术方案的细节和形式所做出的修改均落入本发明的保护范围内。

以下实施例均按照下列培养基组成：

平板培养基包括：鱼蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉6g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、琼脂15g/L。

种子培养基包括：鱼蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、甘油5.5g/L；

发酵培养基包括：葡萄糖25g/L、酵母浸粉20g/L、丙氨酸10g/L、半胱氨酸10g/L、硝酸钠3g/L、磷酸氢二钾1.05g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乳糖3.2g/L、甘油5.5g/L。

实施例1

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌在平板培养基上活化培养6h，控制培养温度37℃，摇床速度200rpm；将培养的大肠杆菌、酿酒酵母、葡萄球菌按照体积比3:1:0.8混合后接种在种子培养基中活化培养，控制培养温度37℃，摇床速度230rpm，培养时间为12h，用氨水调节pH值6.9；将混合发酵剂按照10％接种量接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中在发酵罐中进行发酵培养，培养温度为37℃，摇床速度230rpm，培养时间为40h，用氨水调节pH值6.9，得到含有氨基葡萄糖的发酵液，整个发酵过程控制葡萄糖补料速度为4L/h；发酵液离心分离，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入30％盐酸进行水解得水解液；水解液在80℃、真空度-0.07MPa下真空浓缩，回收盐酸；将浓缩液降温至10℃，在50rpm速度搅拌下结晶6h，沉淀4h后，离心分离得氨基葡萄糖盐酸盐粗品，离心所得母液加入浓盐酸用于飞机熬夜浓缩液水解；所得粗产品用水溶解，水溶液经预处理过的732阳离子交换柱层析，水溶液通过柱床流速为3ml·cm^-2·min^-1，用水洗脱，用5％AgNO₃溶液检测直至无氯离子，减压浓缩，采用95％乙醇溶液进行重结晶得氨基葡萄糖盐酸盐；用过的树脂床用95％的乙醇洗脱即可再生；将氨基葡萄糖盐酸盐溶解在水中，在搅拌条件下加入硫酸钾，硫酸钾、氨基葡萄糖盐酸盐、水的质量比为1:2:10，在40℃搅拌60min，反应产物在真空下-35℃冷冻干燥得氨基葡萄糖硫酸钾盐，纯度为98.3％。

实施例2

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌在平板培养基上活化培养6h，控制培养温度37℃，摇床速度200rpm；将培养的大肠杆菌、酿酒酵母、葡萄球菌按照体积比3:1.2:0.8混合后接种在种子培养基中活化培养，控制培养温度36℃，摇床速度240rpm，培养时间为13h，用氨水调节pH值6.8；将混合发酵剂按照10％接种量接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中在发酵罐中进行发酵培养，培养温度为36℃，摇床速度240rpm，培养时间为38h，用氨水调节pH值6.8，得到含有氨基葡萄糖的发酵液，整个发酵过程控制葡萄糖补料速度为4.5L/h，发酵液离心分离，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入30％盐酸进行水解得水解液；水解液在80℃、真空度-0.05MPa下真空浓缩，回收盐酸；将浓缩液降温至5℃，在50rpm速度搅拌下结晶7h，沉淀3h后，离心分离得氨基葡萄糖盐酸盐粗品，离心所得母液加入浓盐酸用于飞机熬夜浓缩液水解；所得粗产品用水溶解，水溶液经预处理过的732阳离子交换柱层析，水溶液通过柱床流速为3ml·cm^-2·min^-1，用水洗脱，用5％AgNO₃溶液检测直至无氯离子，减压浓缩，采用95％乙醇溶液进行重结晶得氨基葡萄糖盐酸盐；用过的树脂床用95％的乙醇洗脱即可再生；将氨基葡萄糖盐酸盐溶解在水中，在搅拌条件下加入硫酸钾，硫酸钾、氨基葡萄糖盐酸盐、水的质量比为1:2:10，在40℃搅拌60min，反应产物在真空下-35℃冷冻干燥得氨基葡萄糖硫酸钾盐，纯度为97.8％。

实施例3

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌在平板培养基上活化培养6h，控制培养温度37℃，摇床速度200rpm；将培养的大肠杆菌、酿酒酵母、葡萄球菌按照体积比3:1.5:0.7混合后接种在种子培养基中活化培养，控制培养温度38℃，摇床速度250rpm，培养时间为12h，用氨水调节pH值6.9；将混合发酵剂按照10％接种量接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中在发酵罐中进行发酵培养，培养温度为38℃，摇床速度250rpm，培养时间为46h，用氨水调节pH值6.9，得到含有氨基葡萄糖的发酵液，整个发酵过程控制葡萄糖补料速度为4L/h，发酵液离心分离，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入30％盐酸进行水解得水解液；水解液在75-90℃、真空度-0.1MPa下真空浓缩，回收盐酸；将浓缩液降温至10℃，在50rpm速度搅拌下结晶5h，沉淀3h后，离心分离得氨基葡萄糖盐酸盐粗品，离心所得母液加入浓盐酸用于飞机熬夜浓缩液水解；所得粗产品用水溶解，水溶液经预处理过的732阳离子交换柱层析，水溶液通过柱床流速为3ml·cm^-2·min^-1，用水洗脱，用5％AgNO₃溶液检测直至无氯离子，减压浓缩，采用95％乙醇溶液进行重结晶得氨基葡萄糖盐酸盐；用过的树脂床用95％的乙醇洗脱即可再生；将氨基葡萄糖盐酸盐溶解在水中，在搅拌条件下加入硫酸钾，硫酸钾、氨基葡萄糖盐酸盐、水的质量比为1:2:10，在40℃搅拌60min，反应产物在真空下-35℃冷冻干燥得氨基葡萄糖硫酸钾盐，纯度为97.6％。

实施例4

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌在平板培养基上活化培养6h，控制培养温度37℃，摇床速度200rpm；将培养的大肠杆菌、酿酒酵母、葡萄球菌按照体积比3:1.2:0.8混合后接种在种子培养基中活化培养，控制培养温度37℃，摇床速度230rpm，培养时间为14h，用氨水调节pH值7.0；将混合发酵剂按照10％接种量接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中在发酵罐中进行发酵培养，培养温度为37℃，摇床速度230rpm，培养时间为48h，用氨水调节pH值6.9，得到含有氨基葡萄糖的发酵液，整个发酵过程控制葡萄糖补料速度为5L/h，发酵液离心分离，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入30％盐酸进行水解得水解液；水解液在90℃、真空度-0.1MPa下真空浓缩，回收盐酸；将浓缩液降温至6℃，在50rpm速度搅拌下结晶6h，沉淀4h后，离心分离得氨基葡萄糖盐酸盐粗品，离心所得母液加入浓盐酸用于飞机熬夜浓缩液水解；所得粗产品用水溶解，水溶液经预处理过的732阳离子交换柱层析，水溶液通过柱床流速为3ml·cm^-2·min^-1，用水洗脱，用5％AgNO₃溶液检测直至无氯离子，减压浓缩，采用95％乙醇溶液进行重结晶得氨基葡萄糖盐酸盐；用过的树脂床用95％的乙醇洗脱即可再生；将氨基葡萄糖盐酸盐溶解在水中，在搅拌条件下加入硫酸钾，硫酸钾、氨基葡萄糖盐酸盐、水的质量比为1:2:10，在40℃搅拌60min，反应产物在真空下-35℃冷冻干燥得氨基葡萄糖硫酸钾盐，纯度为97.9％。

实施例5

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌在平板培养基上活化培养6h，控制培养温度37℃，摇床速度200rpm；将培养的大肠杆菌、酿酒酵母、葡萄球菌按照体积比3:2:0.5混合后接种在种子培养基中活化培养，控制培养温度36℃，摇床速度240rpm，培养时间为12h，用氨水调节pH值6.8；将混合发酵剂按照10％接种量接种至含有葡萄糖和氮源的发酵培养基中在发酵罐中进行发酵培养，培养温度为36℃，摇床速度240rpm，培养时间为35h，用氨水调节pH值6.8，得到含有氨基葡萄糖的发酵液，整个发酵过程控制葡萄糖补料速度为3.5L/h，发酵液离心分离，去除菌体，收集上清液，向上清液中加入30％盐酸进行水解得水解液；水解液在90℃、真空度-0.1MPa下真空浓缩，回收盐酸；将浓缩液降温至10℃，在50rpm速度搅拌下结晶5h，沉淀4h后，离心分离得氨基葡萄糖盐酸盐粗品，离心所得母液加入浓盐酸用于飞机熬夜浓缩液水解；所得粗产品用水溶解，水溶液经预处理过的732阳离子交换柱层析，水溶液通过柱床流速为3ml·cm^-2·min^-1，用水洗脱，用5％AgNO₃溶液检测直至无氯离子，减压浓缩，采用95％乙醇溶液进行重结晶得氨基葡萄糖盐酸盐；用过的树脂床用95％的乙醇洗脱即可再生；将氨基葡萄糖盐酸盐溶解在水中，在搅拌条件下加入硫酸钾，硫酸钾、氨基葡萄糖盐酸盐、水的质量比为1:2:10，在40℃搅拌60min，反应产物在真空下-35℃冷冻干燥得氨基葡萄糖硫酸钾盐，纯度为98.1％。