用于绵羊肺炎支原体毒力比较分析方法
阅读说明：本技术 用于绵羊肺炎支原体毒力比较分析方法 (Comparative analysis method for virulence of mycoplasma ovipneumoniae ) 是由 郝华芳 储岳峰 陈胜利 颜新敏 袁婷 刘永生 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种不同绵羊支原体菌株毒力比较分析方法。本发明比较分析绵羊支原体菌株毒力的方法是将经复苏的各待比较分析的绵羊支原体分别接种于不同鸡胚上,再将接种后的鸡胚置于恒温箱内培养,定时检测鸡胚状态及死亡情况,统计各个菌株的鸡胚致死率和接种7d死亡率,结合死亡鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体的鉴定结果,以此进行比较判定。本发明的方法成本低、实验动物SPF鸡胚容易获得、操作简单方便、试验周期短、重复性好等优点,克服了现有技术存在的实验动物价格较为昂贵、对实验动物要求高,动物饲养繁琐、试验周期长、重复性较差等缺点。(The invention discloses a comparative analysis method for virulence of different mycoplasma ovis strains. The method for comparatively analyzing the mycoplasma ovis strain virulence comprises the steps of respectively inoculating each recovered mycoplasma ovis to be comparatively analyzed on different chick embryos, culturing the inoculated chick embryos in a constant temperature box, regularly detecting the state and death condition of the chick embryos, counting the chick embryo mortality and the inoculated 7d mortality of each strain, and carrying out comparison and judgment by combining the identification result of the mycoplasma ovis with the dead chick embryo allantoic fluid. The method has the advantages of low cost, easy acquisition of SPF chick embryos of experimental animals, simple and convenient operation, short test period, good repeatability and the like, and overcomes the defects of expensive experimental animals, high requirement on the experimental animals, complicated animal feeding, long test period, poor repeatability and the like in the prior art.)
技术领域
本发明涉及一种同种不同微生物菌株某种性质的比较方法，特别涉及一种不同绵羊支原体菌株毒力比较分析方法。
背景技术
绵羊肺炎支原体是一种可感染绵羊和山羊的病原体，主要引起羊呼吸道疾病如咳嗽、气喘、流鼻涕等，该病在全世界范围内流行。绵羊肺炎支原体可存在正常羊鼻腔。近年来，我国绵羊肺炎支原体感染发病的报道不断增多，严重危害养羊业健康发展。疫苗免疫接种是防控该病的一个重要手段，目前主要为灭活疫苗。
绵羊肺炎支原体基因型众多，毒力存在较大差异。绵羊肺炎支原体对细胞的感染程度也有差异。目前，绵羊肺炎支原体毒力比较的方法主要依靠动物实验。实验动物主要为羊。然而，存在实验动物要求高(健康绵羊或山羊，绵羊肺炎支原体病原和抗体均阴性)、实验周期长(一般21～28天甚至更长)、实验动物羊价格较为昂贵、饲养要求较高、试验操作复杂等缺点。建立一种简单的绵羊肺炎支原体毒力比较方法对于绵羊肺炎支原体的毒力研究和疫苗菌株筛选均具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种简单比较分析不同绵羊支原体菌株毒力的方法。
本发明的简单比较分析绵羊支原体菌株毒力的方法是将经复苏的各待比较分析的绵羊支原体分别接种于不同鸡胚上，再将接种后的鸡胚置于恒温箱内培养，定时检测鸡胚状态及死亡情况，统计各个菌株的鸡胚致死率和接种7d死亡率，结合死亡鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体的鉴定结果，以此进行比较判定。
优选地，本发明的比较分析绵羊支原体菌株毒力的方法是：
(1)SPF鸡胚准备：准备7～8日龄的健康SPF鸡胚，鸡胚活力旺盛、血管清晰，孵化箱培养(温度37.0～37.5℃，湿度50％)。
(2)绵羊肺炎支原体待测菌液准备：复苏绵羊肺炎支原体菌株，接种绵羊肺炎支原体培养基，37℃恒温培养1～2天，传代培养，待培养基的颜色变黄，或pH值不高于6.8时，生理盐水调节菌液浓度，使菌液活菌滴度达109CCU/ml。
(3)鸡胚的接种与观测：无菌条件下，绵羊肺炎支原体待测菌液接种7～8日龄健康SPF鸡胚，卵黄囊接种，每个菌株按0.2ml(前述菌液/枚)进行接种；接种后，孵化箱继续培养13～14d。具体操作中可将绵羊肺炎支原体待测菌液在无菌条件下接种7～8日龄健康SPF鸡胚，卵黄囊接种，每个菌株接种10枚SPF鸡胚，0.2ml/枚。同时设置阴性对照组。阴性对照组鸡胚卵黄囊接种生理盐水，0.2ml/枚，10枚；空白对照组鸡胚未做任何处理，10枚；试验组接种后，孵化箱继续培养13～14d。
(4)统计分析与结果判定：统计每个菌株的鸡胚致死率、接种7d死亡率。并进行比较分析与结果判定。具体做法是每天观察鸡胚死亡情况并记录。收集死亡鸡胚，置2～8℃冰箱6～24h，收集死亡鸡胚尿囊液，进行绵羊肺炎支原体分离和PCR鉴定；统计每个菌株的鸡胚死亡数，计算鸡胚死亡率，同时统计接种7d死亡率。结合死亡鸡胚尿囊液绵羊肺炎支原体的鉴定结果来综合分析，比较不同菌株绵羊肺炎支原体毒力。
本发明所述方法可在绵羊支原体疫苗筛选或制备中的应用，也可在绵羊肺炎支原体毒力或致病研究中的应用。
与现有技术相比，本发明的方法成本低、实验动物SPF鸡胚容易获得、操作简单方便、试验周期短、重复性好等优点，克服了现有技术存在的实验动物价格较为昂贵、对实验动物要求高，动物饲养繁琐、试验周期长、重复性较差等缺点。因此，本发明方法既可以用于绵羊肺炎支原体疫苗研发中毒力菌株的筛选，也可用于绵羊肺炎支原体毒力研究。
具体实施方式
以下结合本发明的实施例说明。
用于绵羊肺炎支原体毒力比较分析方法，步骤如下：
1、准备7日龄的健康SPF鸡胚(SPF种蛋购自山东昊泰实验动物繁育有限公司)，于孵化箱孵化，温度37.0～37.5℃，湿度50％，于接种前照蛋，弃去无精蛋，死胚及弱胚。
2、绵羊肺炎支原体菌液准备：复苏绵羊肺炎支原体Y98株(购自中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC，编号CVCC384)、MoGH3-3菌株(中国农业科学院兰州兽医研究所分离保存)，分别接种绵羊肺炎支原体培养基(改良Thiaucourt's培养基)，37℃恒温培养1～2天，传代培养，待培养基的颜色变黄时(或pH值不高于6.8时)，8000rpm离心15min，生理盐水调节菌液浓度，使菌液活菌滴度达109CCU/ml。
3、鸡胚的接种与观测：将制备好的绵羊肺炎支原体菌液接种鸡胚卵黄囊，每个菌株接种10枚SPF鸡胚，0.2ml/枚，同时设阴性对照组(接种生理盐水，0.2ml/枚，10枚)和空白对照组(未做任何处理，10枚)，接种后，孵化箱继续培养13～14d。
4、观测和统计分析：每天观察鸡胚死亡情况并记录。收集死亡鸡胚，置2～8℃冰箱6～24h，收集鸡胚尿囊液备用，进行绵羊肺炎支原体分离鉴定。阴性对照和空白对照鸡胚均无死亡；统计每个菌株的鸡胚死亡数，计算鸡胚致死率，同时统计接种7d死亡率。
绵羊肺炎支原体的分离鉴定方法：收集死亡鸡胚尿囊液，接种改良Thiaucourt's培养基，进行绵羊肺炎支原体分离鉴定。提取鸡胚尿囊液细菌DNA，进行PCR分析。
SEQ ID No.1上游引物5’-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3,
SEQ ID No.2下游引物5’-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3’；
PCRmix 12.5μL、ddH2O 8.5μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL、DNA2.0μL。PCR程序如下：95℃5min，35个循环(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，72℃10min，4℃保存。PCR目的片段361bp。
结果见表1：
表1
可以看出，绵羊肺炎支原体Y98株和MoGH3-3株感染鸡胚死亡时间在接种后1～10d；在接种7d时，绵羊肺炎支原体Y98株仅有10％(1/10)死亡，而绵羊肺炎支原体MoGH3-3株50％(5/10)死亡；绵羊肺炎支原体MoGH3-3株接种7d死亡率为50％，而绵羊肺炎支原体Y98株接种7d死亡率为10％；绵羊肺炎支原体Y98株的鸡胚致死率为40％，MoGH3-3株的鸡胚致死率为50％；由此可见，MoGH3-3株的鸡胚接种7d死亡率和鸡胚致死率均高于Y98株。死亡鸡胚尿囊液均含有绵羊肺炎支原体病原。从鸡胚结果看，绵羊肺炎支原体MoGH3-3株的毒力高于Y98株，这与对绵羊毒力强弱相符合。本发明的方法具有成本低、实验动物容易获得、操作简单、试验周期短、重复性好、工作量小等优点。
应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 用于绵羊肺炎支原体毒力比较分析方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 上游引物(PR)
<400> 1
tgaacggaat atgttagctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 下游引物(PF)
<400> 2
gacttcatcc tgcactctgt 20