阅读说明：本技术 一种乏氧响应性壳聚糖药物载体及其制备方法与应用 (Hypoxia responsive chitosan drug carrier and preparation method and application thereof ) 是由 郭东波 石松庆 缑泽明 凌世长 黄林旋 张洋 何佳鹏 游柏浩 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种乏氧响应性壳聚糖药物载体及其制备方法与应用。所述乏氧响应性壳聚糖药物载体的结构如式Ⅰ所示,其侧链带有硝基咪唑基团,R为带有苯基、对苯基和甲基中至少一种的烷烃链,a为0-100,b为0-100,c为0-100,d为1-100,n为0-100。本发明中的乏氧响应性壳聚糖药物载体可用于装载抗癌药物、抗生物、蛋白等药物,在肿瘤微微环境下,疏水性的硝基咪唑基团降解成亲水的氨基咪唑基团,可控释放药物,起到治疗效果。<Image he="242" wi="700" file="DDA0002270675300000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention disclosesDiscloses a hypoxia responsive chitosan drug carrier and a preparation method and application thereof. The structure of the hypoxia-responsive chitosan drug carrier is shown as a formula I, a side chain of the drug carrier is provided with a nitroimidazole group, R is an alkane chain provided with at least one of phenyl, p-phenyl and methyl, a is 0-100, b is 0-100, c is 0-100, d is 1-100, and n is 0-100. The hypoxia-responsive chitosan drug carrier can be used for loading anticancer drugs, antibiotics, protein and other drugs, and under the slight environment of tumors, hydrophobic nitroimidazole groups are degraded into hydrophilic aminoimidazole groups, so that the drugs can be controllably released, and the therapeutic effect is achieved.)

一种乏氧响应性壳聚糖药物载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗材料技术领域，具体涉及一种乏氧响应性壳聚糖药物载体及其制备方法与应用。

背景技术

壳聚糖材料为天然可降解材料，常常被用于生物医用和临床领域。其中，由于其侧链具有可修饰的氨基，常常被用于设计成不同的药物载体。然而，现有的壳聚糖材料在用于肿瘤治疗时，由于肿瘤所处的微环境，例如高渗透压、少血管、乏氧等，往往不能满足治疗的要求。

一方面，在临床上，人体表面的肿瘤治疗以手术为主，然而手术后在肿瘤局灶部位有肿瘤细胞残留，容易造成肿瘤发生转移、复发等现象的出现。需要对肿瘤辅助化学治疗，而现有的抗癌药大部分是小分子，容易出现药物效率低、副作用大和耐药性等问题。因此，需要设计药物输送体用克服上述问题。另一方面，肿瘤切除后，往往会伴随着局灶部位的缺失，比如：骨缺损、肌肉缺损等，药物载体在治疗的时候往往需要有组织再生的功能。壳聚糖材料的降解产物为单糖等物质，容易被人体吸收，但是本身的线性结构很难支撑组织再生的三维空间环境。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种乏氧响应性壳聚糖药物载体。该乏氧响应性壳聚糖药物载体通过在壳聚糖材料侧链上修饰硝基咪唑基团实现其乏氧响应性，在乏氧微环境下通过硝基的化学结构变化赋予壳聚糖可控药物释放的能力，且刚性基团(如硝基咪唑基团)的引入为正常细胞提供生长空间，可应用于肿瘤治疗与组织再生，烷烃链的引入有助于吸附细菌和血红细胞，有助抗菌止血。

本发明的另一目的在于提供上述一种乏氧响应性壳聚糖药物载体的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述一种乏氧响应性壳聚糖药物载体的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种乏氧响应性壳聚糖药物载体，其结构式如式I所示：

其中，a为0～100，b为0～100，c为0～100，d为1～100，n为0～100，R为碳原子数为1～25的烷烃链或H，所述烷烃链带有苯基、对苯基和甲基中的至少一种基团。

优选地，所述a为1～100，n为1～20。

优选地，所述b为1～100，c为1～100。

优选地，所述乏氧响应性壳聚糖药物载体的结构式如式Ⅱ所示：

具有式Ⅱ结构的乏氧响应性壳聚糖药物载体具有抗菌止血功能。

上述一种乏氧响应性壳聚糖药物载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将端基为硝基咪唑的烷基酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在溶剂中，在0～60℃下反应0.5～4h，然后加入氨基壳聚糖酸溶液，控制体系pH为2～7，继续反应0.5～48h，结束反应，调节pH至7～10，沉淀，透析，得到乏氧响应性壳聚糖A；

(2)将乏氧响应性壳聚糖A溶于酸溶液中，然后加入氰基硼氢化钠的乙醇水溶液和RCHO，或加入RCOOH，或加入RC＝CH，在0～80℃下搅拌反应1～48h，结束反应，调节体系的pH值为2～10，离心，透析，得到乏氧响应性壳聚糖B；

所述乏氧响应性壳聚糖A和乏氧响应性壳聚糖B均为乏氧响应性壳聚糖药物载体。

优选地，步骤(1)所述端基为硝基咪唑的烷基酸中烷基的碳原子数为3～103，优选为4～23；所述端基为硝基咪唑的烷基酸优选为硝基咪唑丙酸、6-(2-硝基咪唑)己酸、7-(2-硝基咪唑)庚酸、8-(2-硝基咪唑)辛酸和12-(2-硝基咪唑)十二酸中的至少一种。

当步骤(1)所述端基为硝基咪唑的烷基酸为6-(2-硝基咪唑)己酸时，得到乏氧响应性壳聚糖A的结构式如式Ⅲ所示：

优选地，步骤(1)所述端基为硝基咪唑的烷基酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(0.8～1.5)：(0.8～1.5)；所述氨基壳聚糖酸溶液中的氨基壳聚糖中的氨基和端基为硝基咪唑的烷基酸的摩尔比为(0.01～1000)：1。

优选地，步骤(1)所述溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)与水按照体积比(0.1～10)：1混合得到。

优选地，步骤(1)所述端基为硝基咪唑的烷基酸在溶剂中的浓度为0.5～5mg/ml。

优选地，步骤(1)所述氨基壳聚糖酸溶液的质量浓度为0.1～5％(指100g氨基壳聚糖酸溶液中含有氨基壳聚糖0.1～5g)；所述氨基壳聚糖酸溶液中的酸溶液为醋酸溶液、盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的至少一种，其中酸溶液的质量浓度为0.1～1％。

优选地，步骤(1)所述反应的搅拌转速均为100～1000rpm。

优选地，步骤(1)和(2)所述透析均指将反应产物混合物在水中进行透析提纯。

优选地，步骤(2)所述乏氧响应性壳聚糖A在酸溶液中的质量浓度为0.1～5％(指100ml酸溶液中含有乏氧响应性壳聚糖A0.1～5g)；所述酸溶液为质量浓度为0.1～1％的醋酸溶液、盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的至少一种。

优选地，步骤(2)所述乏氧响应性壳聚糖A和RCHO或RCOOH或RC＝CH的摩尔比为(0.01～1000)：1；所述RCHO和氰基硼氢化钠的乙醇水溶液中氰基硼氢化钠的摩尔比为(0.01～1000)：1。

优选地，步骤(2)所述RCHO和RCOOH和RC＝CH中的R的定义与结构式Ⅰ中R的定义相同，即R为碳原子数为1～25的烷烃链或H，所述烷烃链带有苯基、对苯基和甲基中的至少一种基团。

优选地，步骤(2)所述RCHO为对十八烷氧基苯甲醛。

当步骤(1)所述端基为硝基咪唑的烷基酸为6-(2-硝基咪唑)己酸，步骤(2)所述RCHO为对十八烷氧基苯甲醛时，得到的乏氧响应性壳聚糖B的结构式如式Ⅳ所示：

优选地，步骤(2)所述反应的搅拌转速为150～1000rpm。

优选地，步骤(2)所述氰基硼氢化钠的乙醇水溶液中氰基硼氢化钠的浓度为0.5～10mg/mL。

优选地，步骤(2)所述氰基硼氢化钠的乙醇水溶液中乙醇与水的质量比为(0.1～100)：100。

上述一种乏氧响应性壳聚糖药物载体在载药和药物制备领域中的应用。

一种水凝胶状乏氧响应性壳聚糖载体药物，由以下方法制得：

将1～10mg药物分散在1～10mL浓度为1～10mg/mL的上述乏氧响应性壳聚糖药物载体溶液中，搅拌或超声分散1～24小时，得到水凝胶状乏氧响应性壳聚糖载体药物。

优选地，所述乏氧响应性壳聚糖药物载体溶液的溶剂为质量浓度为0.2～5％的醋酸溶液、盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的至少一种。

优选地，所述乏氧响应性壳聚糖药物载体溶液中乏氧响应性壳聚糖药物载体的载药率为1～100％。

优选的，所述药物为抗癌药物、抗生素和蛋白质中的至少一种；所述药物优选为顺铂、阿霉素、紫杉醇、喜树碱、头孢类抗生素、β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、吉西他滨、生长因子和抑制因子中的至少一种。

一种乏氧响应壳聚糖药物支架，由以下方法制得：

将上述水凝胶状乏氧响应性壳聚糖载体药物在-40～0℃下冷冻干燥1～48小时，得到乏氧响应壳聚糖药物支架。

本发明制得的乏氧响应性壳聚糖药物载体，具有稳定三维结构，可用于组织缺损的修复；在肿瘤或组织乏氧微环境下，疏水的硝基咪唑基团被还原成亲水氨基咪唑基团，造成壳聚糖材料的亲疏水性发生变化，可控释放药物。

本发明制得的乏氧响应性壳聚糖材料药物载体的脱乙酰化度为50～90％，可用于控制壳聚糖材料的降解速率、控制药物释放和组织再生的程序性进行。

本发明制备出一种基于硝基咪唑修饰的壳聚糖材料，为了实现壳聚糖材料在手术过程中具有抑菌止血的功能，在其侧链上修饰了不同长度的烷烃链，得到乏氧响应性壳聚糖药物载体。该乏氧响应性壳聚糖药物载体与广谱抗癌药、抗生素或蛋白质混合，形成凝胶后，便可将这些载药装载。

将本发明制得的乏氧响应性壳聚糖药物载体以水凝胶形式注射入手术局灶部位或者以药物支架形式植入局灶部位，在***的同时，乏氧响应性壳聚糖药物载体形成一定的三维网络，可进行组织再生。本发明所述乏氧响应性壳聚糖药物载体还可通过改变硝基咪唑的接枝率和壳聚糖的脱乙酰化度，控制药物释放速率和材料的降解速率。

本申请所述乏氧响应性壳聚糖材料在乏氧环境下，疏水的硝基咪唑烷烃链被还原成亲水的氨基咪唑烷烃链，使得壳聚糖材料的亲疏水性发生改变，从而释放药物，用于肿瘤治疗、抗细菌感染、促进组织生长等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明反应条件简单，均是商业化的原料制备而得；同时后处理简单，适宜于工业化生产。

2、本发明制得的乏氧响应性壳聚糖药物载体上的硝基咪唑基团，在肿瘤乏氧微环境下被还原成氨基咪唑基团，使壳聚糖的亲疏水性发生变化，进而可控释放药物，解决了现有的壳聚糖材料存在药物控制释放差的问题。

3、本发明的乏氧响应性壳聚糖药物载体的脱乙酰化度通过硝基咪唑烷烃链和R烷烃链的接枝比例控制，可以调节材料的降解速率，有利于释放药物的同时还能保持材料的三维结构，有利于组织缺损的修复和材料被代谢吸收的程序性进程。

附图说明

图1为实施例1制备的乏氧响应性壳聚糖的合成路线图。

图2为实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖的合成路线图。

图3为实施例1制备的乏氧响应性壳聚糖的¹H NMR谱图.

图4为实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖的¹H NMR谱图。

图5为实施例3制得的水凝胶型载阿霉素乏氧响应性壳聚糖的体外释放曲线。

图6为实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖材料的溶胀率。

图7为实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖材料的生物相容性。

图8为实施例4制备的载阿霉素乏氧响应壳聚糖药物支架材料的抑菌圈图。

图9为实施例3制备的水凝胶型载阿霉素乏氧响应性壳聚糖对于脑胶质瘤肿瘤细胞的毒性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请实施例所述氨基壳聚糖购买于浙江金壳药业股份有限公司(产品名称：药用辅料专用壳聚糖)。

实施例1

乏氧响应性壳聚糖药物载体的合成：将113.5mg的6-(2-硝基咪唑)己酸、384mg的EDC和231mg的NHS溶解在100mL体积比为0.2：1的DMF/H₂O混合溶液中，室温下搅拌2h后，加入1g质量浓度为1％的氨基壳聚糖酸溶液(指100g氨基壳聚糖酸溶液中含有氨基壳聚糖1g，其中酸溶液为质量浓度为0.5％的醋酸溶液)，继续在室温下反应48h，同时控制体系pH在4.2左右，反应的搅拌速度为500rpm。结束反应，最后调节pH至9左右，沉淀并且离心，最后使用透析袋在中性去离子水透析提纯，得到淡黄色固体，即为乏氧响应性壳聚糖药物载体。

实施例2

取8g实施例1制得的乏氧响应性壳聚糖溶于400ml浓度为0.5wt％醋酸水溶液中，在反应温度30℃，搅拌速度150rpm，直至壳聚糖材料完全溶解；然后加入100mL浓度为4.50mg/mL的对十八烷氧基苯甲醛乙醇溶液和100mL浓度为4.8mg/mL的氰基硼氢化钠乙醇水溶液，其中乙醇与水的质量比为1：2，室温下搅拌24h。反应结束后调节pH值为9，沉淀并且离心，最后使用透析袋在中性去离子水透析提纯，得到黄色固体，即为带有烷烃链的乏氧响应性壳聚糖药物载体。

实施例1和2所示化合物的合成路线，如图1和2所示；实施例1制得的乏氧响应性壳聚糖药物载体式III和实施2制得的乏氧响应性壳聚糖药物载体式IV所示的化合物¹H NMR如图3和4所示，测试溶剂为氘代醋酸重水溶液，分别对各个吸收峰进行归属，并在谱图中标明。其中在化学位移在1.0、7.0、7.3处的峰对应的是接硝基咪唑上的亚甲基、咪唑基团CH的吸收峰，说明反应后壳聚糖具有乏氧响应性的硝基咪唑。而图4中化学位移7.8处的吸收峰对应的是苯环上氢，说明成功引入对十八烷氧基苯甲基。

实施例3

使用实施案例2制备的乏氧响应性壳聚糖药物载体用于水凝胶型乏氧响应性壳聚糖载体药物的合成：取100mg的阿霉素(DOX)与实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖药物载体溶解于无内毒素水(质量浓度为0.5％的醋酸水溶液)中，并且进行振荡并超声分散，形成水凝胶型载阿霉素乏氧响应性壳聚糖。装载的DOX含量通过紫外可见分光光度计手段测试其DOX含量并且计算其载药率。

实施例4

药物支架性壳聚糖药物载体的合成：将实施例3中水凝胶型载阿霉素乏氧响应性壳聚糖使用5cm×10cm不锈钢模具、塑料培养皿、6孔板或24孔板为模具进行浇注，厚度为0.5-2μm，并且进行冷冻干燥，冷冻时间12h，温度-20℃，干燥时冷阱温度-70℃，真空度30Pa以下，干燥时间24h。最终脱模得到载阿霉素乏氧响应壳聚糖药物支架材料。

图5是实施例3制备的水凝胶型载阿霉素乏氧响应性壳聚糖的体外释放曲线。体外释放测定方法：精密移取载药阿霉素的乏氧响应性壳聚糖2mL于透析袋(30KD)中，放入到20mL不同pH值(7.4和5.0)的释放介质中，分别于0h、2h、4h、6h、8h、20h、24h、32h、48h时间点取1mL的介质液体，同时补充新鲜介质1mL，采用紫外可见吸收光谱仪测试500nm处的吸收峰，计算累计释放百分率，所有的测试均进行三次取平均值。

试验结果表明：壳聚糖药物载体体外具有乏氧响应性可控释放及缓释效果。

图6是普通壳聚糖和实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖药物载体的溶胀率。取10mg的材料放入水中，并且在5min后取出后并进行称量。溶胀率＝(M_t-M₀)/M₀，其中M_t为5min时材料吸水后的重量，为M₀初始重量。结果证明改性后的壳聚糖的溶胀率得到提高。

图7是实施例2制备的乏氧响应性壳聚糖材料细胞生物相容性实验。乏氧响应性壳聚糖水凝胶浓度为10mg/mL(原液，即图7中的壳聚糖本体溶液，由乏氧响应性壳聚糖材料溶于质量浓度为0.5％的醋酸水溶液制得)，鼠成纤维细胞L929细胞系购置中国科学院上海细胞库，使用96孔板进行铺板，8000细胞/孔，6个平行样，分别加入原液、稀释原液2倍、4倍、5倍和10倍的乏氧响应性壳聚糖水凝胶，与细胞共培养72小时后使用MTT方法进行毒性表征，对照组为空白对照组(即不添加乏氧响应性壳聚糖材料)，结果说明该材料具有良好的生物相容性。

图8是实施例4制备的载阿霉素乏氧响应壳聚糖药物支架材料细菌抑制效果实验。使用100μL浓度1×10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌(ATCC6538)涂覆在带有琼脂糖的培养基上12h，随后放入1cm直径的载阿霉素乏氧响应性壳聚糖支架，并培养12h。结果显示乏氧响应性壳聚糖材料周围并无细菌生长，说明该材料具有显著的抑菌性能。

图9是实施例3制备的水凝胶型载阿霉素乏氧响应性壳聚糖的对于脑胶质瘤癌细胞(中国科学院上海细胞库)的毒性。条件与L929细胞类似，使用96孔板并且以8000细胞/孔的浓度12h培养，随后分别加入负载阿霉素当量浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20μg/mL的乏氧响应性壳聚糖药物载体进行共培养，培养时间72h，随后通过MTT方法对癌细胞的存活率进行表征。结果显示在阿霉素浓度为10μg/mL时，该体系显著抑制脑胶质瘤细胞生长，说明在细胞水平具有肿瘤治疗的能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。