一种疫苗载体、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种疫苗载体、其制备方法及应用 (Vaccine vector, preparation method and application thereof ) 是由 宋万通 徐玉笛 赵佳雨 刘丽萍 汤朝晖 陈学思 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种疫苗载体、其制备方法和应用。本发明疫苗载体由氧化甘露聚糖和阳离子聚合物组成；所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚酰胺、聚β氨酯中的至少一种,或这些阳离子聚合物的衍生物,或这些阳离子聚合物及其衍生物与聚乳酸或与聚乳酸-羟基乙酸的嵌段共聚物或接枝共聚物。本发明疫苗载体的抗原负载量大、疫苗制备条件简单温和、稳定性好,并且具有出色的淋巴结靶向和树突细胞靶向能力,能够引起强烈的抗原特异性免疫响应。(The invention relates to the technical field of biological medicines, in particular to a vaccine vector, and a preparation method and application thereof. The vaccine carrier consists of oxidized mannan and cationic polymer; the cationic polymer comprises at least one of polyethyleneimine, polyamide and poly beta-urethane, or derivatives of the cationic polymers, or block copolymers or graft copolymers of the cationic polymers and derivatives thereof and polylactic acid or polylactic acid-glycolic acid. The vaccine vector has the advantages of large antigen load, simple and mild vaccine preparation conditions, good stability, excellent lymph node targeting and dendritic cell targeting capabilities and capability of causing strong antigen specific immune response.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种疫苗载体、其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗取得了巨大的进步，肿瘤疫苗作为一种极具潜力的免疫治疗方式日益受到重视。肿瘤疫苗的优势在于特异性强，安全且长期有效。纳米肿瘤疫苗近年来获得了越来越多的关注，因为纳米肿瘤疫苗可以：1)负载肿瘤抗原和佐剂，防止抗原和佐剂的降解以及过早的弥散；2)通过抗原和佐剂的共输送提升免疫刺激效果；3)利用独特的纳米尺寸优势高效回流到淋巴结并被抗原提呈细胞捕获。尽管如此，当前纳米疫苗的发展并不尽如人意，其取得的免疫刺激效果和抗肿瘤效果有限，限制了向临床的推广。
疫苗发挥作用的主要场所是在次级淋巴器官如淋巴结中。因此，有效的淋巴结回流是疫苗引起有效免疫响应的关键。目前已知，粒径对于纳米疫苗向淋巴结的回流具有重要影响，尺寸在20-200纳米之间的纳米颗粒能够高效回流到淋巴结。然而，刺激产生有效的免疫应答往往需要多步过程，包括抗原被树突细胞(DC)捕获、DC细胞活化、抗原交叉呈递等。现有的疫苗载体往往因功能单一而无法高效刺激产生免疫应答。如Zhiping Zhang等人使用简单的PLGA作为疫苗载体，担载抗原和佐剂，但其抗肿瘤效果有限。而简单叠加多重功能又会造成疫苗载体的复杂性提升(Biomaterials 32(2011)3666-3678)。如RodneyA.Rosalia等人报道了的纳米载体，其组分包括了CD40抗体，抗原蛋白，Pam3Csk4和Poly(I:C)佐剂等多种组分，制备过程繁琐(Biomaterials 40(2015)88-97)。RandallToy等人报道的疫苗，其组分包括PLGA，R848，蛋白抗原，PEI和负电的PUCC等(JournalofControlled Release330(2021)866–877)。上述疫苗的复杂制备过程极大地限制了其向临床应用。
有研究证明，对纳米粒子表面进行修饰也能提高淋巴结回流效果，如PEG的表面修饰能够降低纳米粒子表面对蛋白的吸附，增强向淋巴结的回流。甘露聚糖是一种细菌来源的多糖，由多个重复的糖单元构成，能够被巨噬细胞，B细胞和DC细胞表面的模式识别受体识别。特别的，表达在DC细胞表面的甘露糖受体和DC细胞特异性胞间黏附分子(DC-SIGN)能够识别甘露聚糖并介导吞噬作用的发生。另外，甘露聚糖作为一种TLR4激动剂，能够诱导DC细胞活化。因此，利用甘露聚糖作为疫苗载体的组分具有重要的潜力。现有技术中将甘露聚糖用于疫苗的研究主要是直接采用甘露聚糖与抗原组成的混合物。如澳大利亚艾森德生物制药公司公开的免疫刺激组合物和疫苗组合物的专利(CN201180033660.4)中，采用了包含甘露聚糖的组合物，但是其对甘露聚糖的分子量分布和氧化度提出了较高要求，其至少75％的甘露聚糖的分子量大于1000kDa，并且无法高效实现抗原交叉呈递，免疫效果有限。Moon等人报道了一类以甘露聚糖为外壳的纳米胶囊用于mRNA抗原的递送(Nano Letter(20)1499-1509)。虽然这种纳米胶囊具有一定的柔性，但是其制备工艺需要先以硅球为模板，后期通过溶蚀的方法除去氧化硅，工艺繁琐复杂，难以规模化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的疫苗载体、其制备方法及应用。本发明所提供的疫苗载体具有高免疫活性且结构简单，可广泛用于蛋白疫苗、mRNA疫苗或DNA疫苗的制备。
本发明提供的疫苗载体，由氧化甘露聚糖和阳离子聚合物组成；
所述阳离子聚合物包括I)～III)中至少一种：
I)、聚乙烯亚胺、聚酰胺、聚β氨酯中的至少一种或其衍生物中的至少一种；
II)、I)中所示聚合物与聚乳酸的嵌段共聚物或接枝共聚物；
III)、I)中所示聚合物与聚乳酸-羟基乙酸的嵌段共聚物或接枝共聚物。
甘露聚糖是一种细菌来源的多糖，由多个重复的糖单元构成，能够被巨噬细胞，B细胞和DC细胞表面的模式识别受体识别。特别的，表达在DC细胞表面的甘露糖受体和DC细胞特异性胞间黏附分子(DC-SIGN)能够识别甘露聚糖并介导吞噬作用的发生。另外，甘露聚糖作为一种TLR4激动剂，能够刺激DC细胞的活化。
阳离子聚合物能够通过静电作用与蛋白抗原、mRNA抗原或DNA抗原复合形成纳米颗粒，同时可以负载免疫刺激剂如CpG、Poly(I:C)、LPS、MPLA等，并且可以利用阳离子的破膜效应促进抗原交叉呈递的发生。
本发明中，所述阳离子聚合物为I)所示的聚合物：聚乙烯亚胺、聚酰胺、聚β氨酯或其衍生物中的至少一种，即包括聚乙烯亚胺、聚酰胺、聚β氨酯中的至少一种，以及聚乙烯亚胺衍生物、聚酰胺衍生物、聚β氨酯衍生物中的至少一种。
一些实施方案中，所述阳离子聚合物为支化聚乙烯亚胺、线型聚乙烯亚胺和树枝状聚酰胺中的至少一种。
一些是实施方案中，所述氧化甘露聚糖的氧化度在30-70％。
一些实施方案中，所述氧化甘露聚糖的重均分子量为20kDa～80kDa。
本发明还提供了所述疫苗载体在制备蛋白疫苗、mRNA疫苗或DNA疫苗中的应用。
本发明还提供一种疫苗，包括本发明所述的疫苗载体和抗原。
本发明还提供了所述疫苗的制备方法，包括以下步骤：
分别制备抗原溶液、阳离子聚合物溶液和氧化甘露聚糖溶液；
在涡旋条件下，将抗原溶液与阳离子聚合物溶液混合，获得混合液A；
将混合液A涡旋30s，加入氧化甘露聚糖溶液，涡旋30s，获得疫苗。
本发明中，在所述加入氧化甘露聚糖溶液之前还可以包括加入免疫刺激剂、涡旋30s的步骤。
进一步的，所述抗原为编码肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的mRNA或DNA，或编码病毒或其他微生物、病原体的mRNA或DNA。
具体地，所述免疫刺激剂为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、雷西莫特(R848)、寡核苷酸(CpG·ODN)、聚肌苷酸-聚胞苷酸Poly(I:C)、LPS、MPLA中的至少一种，免疫刺激剂的种类包括但不限于此，本领域常用的生物性佐剂、无机佐剂、人工合成佐剂均在本发明保护范围内。
本发明提供的疫苗具有核壳结构，阳离子聚合物与抗原复合形成内核，氧化甘露聚糖修饰在内核表面作为外壳。
本发明提供的疫苗载体由氧化甘露聚糖和阳离子聚合物组成；
所述阳离子聚合物包括I)～III)中至少一种：
I)、聚乙烯亚胺、聚酰胺、聚β氨酯中的至少一种或其衍生物中的至少一种；
II)、I)中所示聚合物与聚乳酸的嵌段共聚物或接枝共聚物；
III)、I)中所示聚合物与聚乳酸-羟基乙酸的嵌段共聚物或接枝共聚物。
本发明提供的疫苗载体的抗原负载量大、疫苗制备条件简单温和、稳定性好，具有较强的淋巴结靶向和树突细胞靶向能力，能够引起强烈的抗原特异性免疫响应，进而使得由本发明疫苗载体制得的癌症疫苗对肿瘤生长具有显著的抑制效果。
附图说明
图1为实施例5制备得到的PLA-PEI的1H NMR图谱；
图2为实施例6制备得到的PLA-PEI阳离子内核，PLA-PEI-CpG-OVA及氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA的粒径和电位；
图3为实施例6制备得到的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA透射电镜结果；
图4为实施例8中PAMAM-IMDQ衍生物的制备示意图；
图5为实施例14制备得到的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗激活BMDC结果；
图6为实施例15氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗促进BMDC抗原交叉呈递流式结果；
图7为实施例16氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗用于B16-OVA肿瘤模型的治疗结果；
图8为实施例17氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗用于B16-OVA模型后抗原特异性响应分析；
图9为实施例18氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38抗原疫苗用于MC38肿瘤切除模型的治疗结果。
具体实施方式
本发明提供了一种疫苗载体、其制备方法及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明涉及一种疫苗载体、其制备方法及应用。所述疫苗载体由氧化甘露聚糖和阳离子聚合物组成，在制备疫苗时利用阳离子聚合物复合蛋白抗原、mRNA抗原或DNA抗原制备成纳米颗粒内核，之后氧化甘露聚糖经席夫碱反应修饰到表面。本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1
氧化甘露聚糖的制备
1g甘露聚糖溶于10mL的无菌水中，冰浴下搅拌至溶解，657mg高碘酸钠溶于5mL无菌水中，滴加入甘露聚糖溶液中。2h后撤去冰浴，室温避光反应12h。产物透析纯化，冻干得到最终产物。
终产物的氧化度通过盐酸羟胺法测定，具体操作如下：取0.1mg的氧化甘露聚糖，溶于25mL的盐酸羟胺水溶液中(0.25mol/L,含有甲基橙0.05％)，在室温下静置3h。以标准NaOH溶液(0.1mol/L)滴定，红色变为黄色，消耗的NaOH体积记为V1。另取一份同样体积的盐酸羟胺水溶液(0.25mol/L,含有甲基橙0.05％)，以标准NaOH溶液(0.1mol/L)滴定，红色变为黄色，消耗的NaOH体积记为V0。醛基取代度由以下公式计算：
N＝(V1-V0)×M×Mw/(1000W)×100％
公式中M为氢氧化钠溶液的摩尔浓度，Mw为甘露聚糖重复单元的相对分子量(164)；W为使用的氧化甘露聚糖的重量(g)。
经计算，氧化甘露聚糖的氧化度为40％。
实施例2
氧化甘露聚糖/PEI-CpG-OVA疫苗的制备
将OVA蛋白溶于无菌注射用水中，得到浓度为1mg/mL的抗原溶液，将PEI溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将CpG溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将氧化甘露聚糖溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将1体积的OVA溶液在涡旋下，加入到4体积的PEI溶液中，涡旋30s，再将1体积的CpG加入到混合物中，涡旋30s，加入2体积的氧化甘露聚糖溶液，涡旋30s，得到氧化甘露聚糖/PEI-CpG-OVA疫苗。其粒径由马尔文粒度仪测定，为211nm。
实施例3
PEI衍生物(PEI-4BImi)的制备
将50mg的PEI(Mw＝10kDa)溶于DMSO溶液中，将25mg的苯并咪唑-7-羧酸，60mg的EDC·HCl，36mg的NHS共同溶于10mL的DMSO中，室温搅拌，活化30min，加入到PEI的DMSO溶液中，室温反应72h。产物使用无菌注射用水透析纯化，冻干得到终产物PEI-4BImi。
实施例4
氧化甘露聚糖/PEI-4BImi-OVA疫苗的制备
将PipE溶于无菌注射用水，浓度为1mg/mL，将OVA蛋白溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将1体积的OVA蛋白在涡旋下，加入到1体积的PipE溶液中，涡旋30s，加入2体积的氧化甘露聚糖溶液，制备得到PipE-OVA疫苗。其粒径由马尔文粒度仪测定，为225nm。
实施例5
PLA-PEI的制备
5g的PLA(分子量15k)和1.5倍摩尔当量的N,N’-羰基二咪唑溶于干燥的DMSO中，室温搅拌24小时。1倍摩尔当量的PEI(分子量10k)溶于干燥的DMSO中，缓慢加入到PLA溶液中，反应继续搅拌24h。使用无菌水透析纯化，冻干后得到最终产物。利用核磁共振氢谱对实施例5中得到的PLA-PEI阳离子聚合物进行分析。图1为得到的PLA-PEI阳离子聚合物的1H NMR图谱。
实施例6
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗的制备
首先制备PLA-PEI纳米粒子，20mg PLA-PEI溶于1mL的DMSO中，另制备15mL的浓度为10mM的HEPES缓冲液。在超声条件下，将有机相缓慢滴加到水相中(40％功率，10min)。得到的溶液经过无菌水透析纯化，除去DMSO等杂质。最终体积定容到20mL，得到浓度为1mg/mL的阳离子内核溶液，置于4度保存，以备用。粒径和电位使用马尔文粒度仪测量，如图2所示。
将OVA蛋白溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将CpG溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将氧化甘露聚糖溶于无菌注射用水中，浓度为5mg/mL，将0.1体积的CpG溶液在涡旋下加入到1体积的PLA-PEI纳米粒子溶液中，涡旋30s，再加入0.2体积的OVA蛋白溶液，涡旋30s，最后将上述混合物加入到1体积的氧化甘露聚糖溶液中，涡旋2min，得到氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗。粒径和电位使用马尔文粒度仪测量，如图2所述。使用透射电镜拍摄疫苗结构，呈现出较明显的核壳机构，如图3所示。
实施例7
氧化甘露聚糖与OVA复合物的制备
将氧化甘露聚糖溶于无菌注射用水中，浓度为5mg/mL，将OVA溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将0.2体积的OVA加入到1体积的氧化甘露聚糖溶液中，涡旋30s，得到氧化甘露聚糖OVA复合物。使用马尔文粒度仪测试其粒径。
实施例8
制备PAMAM键合IMDQ佐剂的衍生物PAMAM-IMDQ
将IMDQ(M＝359.21)256mg与2倍摩尔当量的N,N’-羰基二咪唑溶于干燥的DMSO中，室温搅拌24小时。将200mg的PAMAM(G4)溶于干燥的DMSO中，加入到上述溶液中，室温反应48小时。反应结束后，使用无菌注射用水透析纯化，冻干，得到终产物PAMAM-IMDQ。制备过程如图4所示。
实施例9
氧化甘露聚糖/PAMAM-IMDQ-OVA疫苗的制备
将OVA蛋白溶于无菌注射用水中，得到浓度为1mg/mL的OVA蛋白溶液，将PAMAM-IMDQ溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将氧化甘露聚糖溶于无菌注射用水中，浓度为1mg/mL，将1体积的OVA蛋白溶液在涡旋下加入到PAMAM-IMDQ溶液中，涡旋30s，在涡旋下将混合物加入到2倍体积的氧化甘露聚糖溶液中，继续涡旋30s，得到氧化甘露聚糖/PAMAM-IMDQ-OVA疫苗。
实施例10
切除肿瘤组织来源抗原蛋白的制备
肿瘤组织取自荷瘤小鼠(如MC38肿瘤荷瘤鼠)，经由外科手术切除得到。将2g切除的肿瘤组织切成小块，加入5mL浓度为60μM的次氯酸钠溶液，轻轻研磨后，置于37度处理1h。孵育结束后，加入10mL的PBS，离心(8000rpm，10min)，弃去上清，再加入10mL的PBS，重复上述离心步骤。加入5mL的PBS，超声破碎(40％功率，20min)，随后反复冻融6个循环。将混合物离心(8000rpm，10min)，弃去下层沉淀，保留上清液。将上清液进行BCA蛋白定量，上清置于-80度保存备用。
实施例11
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38个性化抗原疫苗的制备
使用无菌水溶解CpG1826，得到浓度为1mg/mL的CpG溶液。取1mL的阳离子内核溶液(浓度为1mg/mL)，涡旋下加入100μL的CpG溶液。涡旋30s后，静置5分钟。将MC38抗原蛋白稀释得到浓度为1mg/mL的蛋白溶液。将200μL的蛋白溶液在涡旋下加入前述阳离子内核和CpG的混合溶液中，涡旋30s，静置5分钟。得到PLA-PEI-抗原蛋白复合物。
使用无菌水溶解氧化甘露聚糖，得到浓度为5mg/mL的氧化甘露聚糖溶液。在涡旋条件下，将前述PLA-PEI-抗原蛋白复合物滴加入1mL的氧化甘露聚糖溶液中，涡旋30s，制备得到氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38抗原疫苗。
实施例12
氧化甘露聚糖/PEI-CpG-mRNA疫苗的制备
使用无菌注射用水溶解PEI，浓度为1mg/mL，使用无菌注射用水溶解编码OVA抗原的mRNA，使用无菌注射用水溶解CpG1826,浓度为1mg/mL，使用无菌注射用水溶解氧化甘露聚糖，浓度为1mg/mL，涡旋下，将1体积的mRNA加入到5体积的PEI溶液中，继续涡旋30s，再向体系中加入1体积的CpG溶液，继续涡旋30s，最后向体系中加入2体积的氧化甘露聚糖溶液，涡旋30s，制备得到氧化甘露聚糖/PEI-CpG-mRNA疫苗。
实施例13
氧化甘露聚糖/PEI-CpG-DNA疫苗的制备
使用无菌注射用水溶解PEI，浓度为1mg/mL，使用无菌注射用水溶解编码OVA抗原的DNA，使用无菌注射用水溶解CpG1826,浓度为1mg/mL，使用无菌注射用水溶解氧化甘露聚糖，浓度为1mg/mL，涡旋下，将1体积的DNA加入到5体积的PEI溶液中，继续涡旋30s，再向体系中加入1体积的CpG溶液，继续涡旋30s，最后向体系中加入2体积的氧化甘露聚糖溶液，涡旋30s，制备得到氧化甘露聚糖/PEI-CpG-DNA疫苗。其粒径由马尔文粒度仪测定，为241nm。
实施例14
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗活化BMDC
骨髓来源的DC细胞(BMDC)接种在24孔板中，密度为每孔3×105个细胞。游离的OVA蛋白，游离的CpG,PLA-PEI-CpG-OVA，氧化甘露聚糖/PLA-PEI-OVA，氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗分别加入到不同的孔中，每孔中加入的OVA蛋白量相同，均为20μg/mL。孵育6h后，不贴壁或贴壁不牢的细胞被轻轻吹打下来，使用抗鼠的PE-CD11C,APC/Cy7-MHC-II和APC-CD80流式抗体进行染色后进行流式分析。所有的操作均在冰上完成，防止BMDC在染色过程中的不必要的活化。不同组别的BMDC活化情况如图5所示。
由图5可知，氧化甘露聚糖和CpG均可促进BMDC的活化，但是氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA组对BMDC的活化能力最强，显著优于其他处理组，证明本发明氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA纳米疫苗具有显著地免疫活化能力。
实施例15
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗促进抗原交叉呈递
本实施例中所使用的的疫苗是由实施例6制备得到的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗。BMDC接种在24孔板中，密度为每孔3×105个细胞。游离蛋白(free OVA)，PLA-PEI-OVA和氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗分别加入到不同的孔中，每孔的OVA蛋白的最终浓度均为20μg/mL。经过24h的孵育之后，不贴壁或贴壁不牢的细胞被轻轻吹打下来，使用抗鼠的FITC-CD11C和PE-H2Kb(结合SIINFEKL)抗体染色后进行流式分析。结果如图6所示。
由图6可知，氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗能极大的促进BMDC细胞对抗原的交叉呈递能力，效果显著优于单独-OVA疫苗和氧化甘露聚糖-OVA疫苗组，具有极显著差异(p＜0.001)。相比比单独氧化甘露聚糖-OVA组提高了3倍。
实施例16
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗用于B16-OVA模型抗肿瘤分析
本实施例中所使用的的疫苗是由实施例6制备得到的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗。在B16-OVA模型抗肿瘤分析中，6到8周龄的雌性C57小鼠皮下注射3×105个B16-OVA肿瘤细胞，注射当天记为0天。小鼠随机分为5组：1)未经治疗组，2)OVA蛋白组(freeOVA)，3)铝佐剂+OVA组(Al+OVA)，4)氧化甘露聚糖-OVA，5)氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA。在第5,10和15天，每组小鼠接受尾部皮下注射治疗。OVA蛋白的单次给药剂量为50μg每只小鼠，CpG的单次给药剂量为25μg每只小鼠。肿瘤体积每两天测量一次，肿瘤体积计算公式为V＝a×b2×0.5，其中a为肿瘤的长度，b为肿瘤的宽度。结果如图7所述。
由图7可知，氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗具备最强的抗肿瘤能力，其肿瘤抑制率达到了94％，远高于商业化的铝佐剂+OVA抗原的24％的肿瘤抑制率。
实施例17
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗用于B16-OVA模型后抗原特异性响应分析
本实施例中所使用的的疫苗是由实施例6制备得到的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗。使用ELISOPT方法测定核壳结构蛋白疫苗用于B16-OVA模型后，脾细胞对抗原的特异性响应情况。将捕获抗体稀释至工作浓度，按照每孔100μL加入到ELISPOT孔板中，孔板置于4度孵育过夜。使用PBS洗涤孔板三次，而后每孔中加入封闭液100μL，置于室温2h。弃去封闭液，准备含有抗原的RPMI 1640培养基。每孔加入200μL含抗原的RPMI1640培养基。分离治疗后的小鼠的脾脏细胞，分别接种到孔板中，密度为每孔2×105个细胞。将孔板置于37度含有5％二氧化碳的培养箱中培养72小时。弃去细胞及培养基，使用去离子水洗涤2次。加入稀释至工作浓度的检测抗体，每孔加入100μL，室温孵育2h。使用PBST洗涤孔板2次，每孔加入100μL的链霉亲和素-HRP，室温孵育1h后，使用PSB洗涤孔板3次。每孔中加入100μL显色液，直至有板块显出。使用去离子水洗涤终止反应。结果如图8所示。
由图8可知，给予本发明提供的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-OVA疫苗后，能够显著提高机体对于抗原的特异性免疫响应。
实施例18
氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38疫苗用于MC38术后模型抗肿瘤分析
本实施例中所使用的的疫苗是由实施例10制备得到的氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38抗原疫苗。6到8周龄的雌性C57小鼠皮下种植MC38肿瘤细胞，密度为每只小鼠2×106个细胞。当肿瘤体积长到约200mm3，切除90％体积的肿瘤组织，切除当天记为0天，肿瘤组织经由实施例4方法制备MC38抗原蛋白，小鼠被随机分为五组：1)未经治疗组，2)MC38抗原，3)铝佐剂+MC38抗原，4)氧化甘露聚糖-MC38抗原，5)氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38抗原。分别在第0,5和10天，给予小鼠尾部皮下治疗，MC38抗原蛋白单次给药剂量为每只50μg，CpG单次给药剂量为每只25μg。结果如图9所示。
结果显示，与未治疗组相比，MC38抗原组、铝佐剂+MC38抗原组、氧化甘露聚糖-MC38抗原和氧化甘露聚糖/PLA-PEI-CpG-MC38抗原组的肿瘤明显变小，其中，PLA-PEI-CpG-MC38抗原组肿瘤体积基本没有增长，肿瘤体积远远小于其他处理组。上述结果表明，本发明提供的疫苗具有显著的抗肿瘤作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种提高羟丙甲纤维素可压性的方法